No arilogļūdeņraža receptoriem atkarīgi un neatkarīgi ceļi veicina kurkumīna pretnovecošanās efektu 2. daļa

Lūdzu sazinietiesoscar.xiao@wecistanche.comlai iegūtu vairāk informācijas

2.2.6. Primārā cilvēka EK audzēšana

Cilvēka primārā EK (Lonza, Ķelne, Vācija) tika kultivēta pilnīgā endotēlija bazālajā barotnē (EBM) (Lonza, Ķelne, Vācija), kas papildināta ar 1 ug/mL hidrokortizona, 12 ug/ml liellopu smadzeņu ekstraktu, 50 ug/ ml gentamicīna, 10 ng/ml cilvēka epidermas augšanas faktora un 10% (o/v) augļa teļa seruma 37 grādu temperatūrā un 5% CO līdz trešajai pasāžai. Pēc atdalīšanas ar 0, 05% (o / o) tripsīnu / EDTA (Thermo Scientific, Schwerte, Vācija), šūnas tika kultivētas 6 cm kultivēšanas trauciņos vai 6 iedobju kultūras plāksnēs vismaz 18 stundas pirms transfekcijas vai apstrādes.

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

2.2.7. Pārejoša EK transfekcija

Šūnas tika transfekētas, kā aprakstīts iepriekš [65]. Īsumā, EK tika transficēta, izmantojot SuperFectTransfection Reagent (Qiagen, Hilden, Vācija) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. AhR pārmērīga ekspresija vai notriekšana tika panākta attiecīgi pēc 24 vai 48 stundām. Transfekcijas efektivitāte pārmērīgas ekspresijas gadījumā bija aptuveni 40 procenti.

2.2.8. EK skrāpējumu brūču pārbaude

Lai izpētītu EK migrācijas spēju, tika veikti skrāpējumu brūču testi, kā aprakstīts iepriekš [66]. Sīkāk, brūces tika ievietotas šūnu monoslānī ar šūnu skrāpi gar izsekošanas līniju. Pēc traumas nesaistītās šūnas tika noņemtas, maigi mazgājot.cistanche salsas ekstraktsĀrstēšana ar kurkumīnu tika veikta tieši pēc brūces nostiprināšanas. Kurķimenes tika izšķīdinātas DMSO un izmantotas galīgajā koncentrācijā 7, 5 uM. EK migrācija tika kvantificēta, krāsojot šūnas ar 5 ug/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindolu (DAPI) (Carl Roth, Karlsrūe, Vācija) PBS 5 minūtes pēc šūnu fiksācijas. ar 4 procentiem (v/v) paraformaldehīdu 15 minūtes istabas temperatūrā. Attēli tika uzņemti, izmantojot Zeiss AxioVision Observer D1 fluorescējošo mikroskopu (Carl Zeiss, Oberkochen, Vācija)), izmantojot 200-palielinājumu. Šūnas, kas migrēja brūcē no izsekošanas līnijas, tika automātiski skaitītas, izmantojot Image]1.52a ]67I daļiņu analīzes funkciju pēc tam, kad tika atdalīti pārklājošie kodoli.

Cistanche var novērst novecošanos

2.2.9. EK imūnkrāsošana

EC tika fiksēts ar 4% (o / v) paraformaldehīdu 15 minūtes istabas temperatūrā. Pēc permeabilizācijas un bloķēšanas 0,3 procentu (o/o)Triton-X 100 un 3 procentu (o/u)normālā kazas serumā PBS, šūnas tika inkubētas ar truša antivielu pret AhR (1:100, Abcam, Kembridža, Apvienotā Karaliste) vai Nrf2 (klons D1Z9C, 1:100, Cell Signaling Technology, Frankfurte, Vācija), kas atšķaidīts ar 1% (o/v) normālu kazas serumu PBS uz nakti 4 C temperatūrā. Pēc tam šūnas tika mazgātas ar PBS un inkubēts ar Alexa 594-saistītu kazu anti-trušu IgG (1:500, Invitrogen, Darmštate, Vācija) 1 stundu istabas temperatūrā.cistanche kātsAktīna krāsošanai šūnas 20 minūtes istabas temperatūrā inkubēja ar Alexa FluorTM 488 Phalloidin (1:7 0, Invitrogen, Darmštate, Vācija). Kodolus 5 minūtes istabas temperatūrā iekrāsoja ar 0, 5 ug / ml DAPI PBS, un šūnas tika piestiprinātas ar ProLong'MDiamond Antifade Mountant (Invitrogen, Darmštate, Vācija). Fluorescējošie attēli tika uzņemti, izmantojot Zeiss AxioVision Observer D1 fluorescējošo mikroskopu ar 400 × vai 200 × palielinājumu.

2.2.10. qPCR šūnās

Kopējā šūnu RNS tika izolēta, apvienojot līzi TRIzolTM ar pakārtotu apstrādi, izmantojot RNeasy Mini Kit (Qiagen (Hilden, Vācija)) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. cDNS sintēze tika veikta, izmantojot QuantiTect9 reversās transkripcijas komplektu (Qiagen (Hilden, Vācija)) ar 1 ug RNS saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Relatīvie transkripta līmeņi tika noteikti ar PCR, izmantojot 2x SYBR③ Green qPCR Master Mix un Rotor-Gene Q termisko ciklu (Qiagen (Hilden, Vācija)). Par atsauci tika izmantots ribosomu proteīna L32 (rpl32) transkripts, un relatīvā izteiksme tika aprēķināta ar AC metodi [68]. Tika izmantoti šādi intronus aptverošie primeru pāri:lielais (gēna pievienošanās numurs NM_000499.5):5'-TCGCTACCTACCTACCCAACCCTT-3',5'-TGTGTCAAACCCAGCTCCAA-3';ahr(gēns pievienošanās numurs NM_001621.5):5'-CGTGGGTCAGATGCAGTACA-3',5'ACCAGGGT-CAAAATTGGGCT3';sod2(gēna pievienošanās numurs NM_000636.4):5'-GCCCTGGAACCTCAC ATCAA -3';5'-AGCAACTCCCCTTTGGGTTC-3';rpl32(gēna pievienošanās numurs NM_000994.4):5'-GTGAAGCCCAAGATCGTCAA-3',5'-TTGTTGCACATCAGCAGCAC{{ 41}}”.

2.3.Peles

2.3.1. Peļu līnijas un audzēšana

Sieviete 8-12-nedēļu ("jauna") un 18-mēnesi veca ("veca") ar AHR deficītu B6.129-AHRtmlBra/J (Schmidt et al., 1996; atsauce šeit kā AHR-KO) peles tika audzētas kā heterozigotes IUF dzīvnieku novietnē. Kontrolei tika izmantoti savvaļas tipa metiena biedri. Peles tika audzētas un turētas īpašos no patogēniem brīvos apstākļos 12/12 stundu gaismas-tumsas ciklā un saņēma standarta čau (sniff"MZ, SSNIFF, Soest, Vācija) ad libitum. 2.3.2.qPCR pelēm

Kopējā RNS tika izolēta no trīs WT un trīs AHR deficītu peļu orgānu audiem ar TriZol [. Pēc tam 400 ng RNS tika reversi transkribēts, izmantojot reversās transkriptāzes M-MLV (Promega, Madison, WI, ASV) un izlases heksamēru praimerus. Gēnu ekspresijas līmeņi tika mērīti divos eksemplāros katram peles audam uz Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden, Vācija), 15 μL gala tilpumā, kas satur 7,5 μL Rotor Gene SybrGreenTM (Biorad, Feldkirhen, Vācija), 1 uM katra primera. ,1,5 μL cDNS un RNāzes nesaturoša ūdens. Primeru efektivitāte bija no 90 procentiem līdz 146 procentiem. Praimeru sekvences un efektivitāti skatīt tabulā S2. Ekspresijas līmeņi tika kalibrēti atbilstoši RPS6 ekspresijai kā mājas uzturēšanas gēns tajā pašā paraugā, izmantojot {{ 14}}CT metode [69].

2.4. In Silico analīzes

CeAhR LBD homoloģijas modelēšana

C. elegans AhR LBD (atliekas 267-372) strukturālais modelis tika ģenerēts ar homoloģijas modelēšanu. Kā veidnes tika izmantotas homologu bHLH-PAS ģimenes locekļu PASB domēnu rentgenstaru struktūras, kurām ir visaugstākā secības identitāte (apmēram 20 procenti) ar CeAhR PASB: diennakts lokomotorās izejas cikli kaput (CLOCK, PDB: 4F3L), neironu PAS domēnu saturošs proteīns 3 (NPAS3, PDB: 5SY7), hipoksijas izraisītie faktori 20 (HIF2o, PDB: 3H82, 4ZP4, 3F1N) un lo (HIFlo, PDB: 4H6J). Modelis tika iegūts ar MODELER[70-72].cistanche tubulosa priekšrocības un blakusparādībasOptimālais modelis tika izvēlēts no 10 izveidotajiem, pamatojoties uz labāko DOPE SCORE [73]. Modeļu kvalitāte tika novērtēta, izmantojot PROCHECK [74]. Sekundārās struktūras piešķīra DSSPcont [75]. Saistīšanas dobums modelētajos LBD tika raksturots, izmantojot CASTp serveri[76]. Modeļu vizualizācija tika veikta, izmantojot PYMOL[77].

2.5. Statistiskā analīze

Ja nav norādīts citādi, statistiskās analīzes tika veiktas GraphPad Prism (versija 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA). Dzīves/veselības ilguma pārbaudēm statistiskā analīze tika veikta, izmantojot OASIS[53]. Mikroarray datu statistiskā analīze tika veikta R (R Foundation (Vīne, Austrija)). Boxploti tika izveidoti programmā GraphPad Prism (versija 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA), un tie parāda mediānu (līnija), 25-75. procentili (kaste) un 10-90. procentili (ūsas).

3. Rezultāti

3.1. Kurkumīns veicina veselības saglabāšanu AhR atkarīgā un neatkarīgā veidā

Ahr{0}} zudums veicina C.elegans veselību un dzīves ilgumu pamata apstākļos[14], un tas negatīvi ietekmē ar vecumu saistītās iezīmes, reaģējot uz zīdītāju AhR modulatoriem, piemēram, benzo[a]pirēnu (BaP), UVB. gaisma un mikrobiota [25]. Uztura polifenoli, piemēram, kurķimenes, veido nozīmīgu zīdītāju AhR modulatoru grupu ar ilgstošu iedarbību C. elegans [78,79], un tādējādi mēs pētījām kurkumīna dzīves ilgumu pagarinošo ietekmi uz tā ahr{10}} atkarība. Kurkumīns reproducējami un ievērojami pagarināja C. elegans dzīves un veselības ilgumu no h{12}}atkarīgā veidā (1.A un B attēls). Iepriekš mēs esam parādījuši, ka ahr{14}} zudums arī pagarina mūža ilgumu Hantingtona slimības un Parkinsona slimības modeļos, attiecīgi palielinot agregācijas poliglutamīna (poliQ40) un -sinukleīna (-syn) ekspresiju muskuļos, kamēr plkst. vienlaikus palielinot olbaltumvielu agregātu saturu [25]. Interesanti, ka ārstēšana ar kurkumīnu palielināja poliQ40 un -syn agregātu skaitu tādā pašā mērā kā ahr{23}} funkcijas zudums (1. C attēls). Kurkumīns arī veicināja dzīves ilgumu un kustību spējas šajos slimību modeļos (1. attēls, DE), bet ahr-1 zuduma un kurkumīna papildināšanas ietekme bija aditīva PolyQbackground (1. D attēls), atklājot AHR-1-neatkarīgas aizsargfunkcijas. kurkumīna vismaz šajā apdraudētajā fonā.

1. attēls. Kurkumīns veicina veselību AHR-1-atkarīgā un neatkarīgā veidā. Ar DMSO vai kurkumīnu apstrādātu wt un ahr{5}} nematožu dzīves ilguma (A) un veselības ilguma (B) līknes. Izdzīvošanas līknes parāda apkopotus datus par 290-300 tārpiem/stāvokli 5 eksperimentos. Statistiskais tests: log-rank tests, # nozīmīgums pret DMSO, * nozīmīgums pret masu, Bonferronip vērtība<0.05.(c) quantification="" of="" aggregates="" in="" 10-day-old="" polyq;wt="" and="" poly="" air-1="" (left="" panel)="" or="" 7-day-old="" async;wt="" and="" an;ahr-1="" (right="" panel).="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 59-111="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05><0.05 vs.dmso.(d,e)life/health="" span="" of="" polyq;wt="" and="" polyq;ahr-1.survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 180="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,significance="" vs.="" dmso,="" *="" significance="" vs.="" wt,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.2.ugt-45 veicina kurkumīna un ahr-1 novecošanās novēršanu

Meklējot iespējamos pakārtotos ahr{0}}atkarīgos kurkumīna efektus, mēs izmantojām mērķtiecīgu un objektīvu pieeju. Mēs pārbaudījām klasisko zīdītāju AhR mērķa gēnu ekspresiju un koncentrējāmies uz Cyp gēniem, jo ​​kurkumīns maina CyplA1 un CyplB1 ekspresiju zīdītāju šūnās [80, 81]. Tomēr 47 dažādu cyps kvantitatīva noteikšana C.elegans ar daļēji kvantitatīvu reāllaika PCR (qPCR) atklāja, ka tikai cyp{8}}B1 tika ievērojami paaugstināts vai nu ar ahr-1 samazināšanos vai kurkumīnu. ahr-1-atkarīgā veidā (attēls S1A-B), savukārt trīs citi cipi (ti, cyp-13A5, cyp-13A8 un cyp-42A1) bija palielināts par kurkumīnu tikai tad, ja nav ahr{21}}(S1. attēls). Šie dati kopā ar citiem darbiem [25,82] liecina, ka cipi, visticamāk, nav galvenie CeAhR mērķi. To atbalsta arī mūsu transkriptomiskā analīze savvaļas tipa un ahr-1 mutantiem. Patiešām, saskaņā ar AHR-1 lomu neironu noteikšanā [37, 38, 40, 41], gēnu ekspresijas izmaiņas starp savvaļas tipa un ahr-1 mutantiem uzrādīja bagātināšanos procesos, kas saistīti ar neironu attīstību. un diferenciācija, un nav būtisku izmaiņu klasiskajos detoksikācijas gēnos (2.A attēls). qPCR analīze dažiem no augstāk un zemāk regulētajiem gēniem starp ahr-1(45. jūlijs) un savvaļas tipu (atf{40}}). , K04H4.2, egl-46, T20F5.4, ptr-4, dyf-7,clec-209, C01B4.6, C01B4.7, F56A4.3)galvenokārt apstiprināja to ahr{60}}atkarību pamata apstākļos (2.B attēls), taču ne UVB [25], ne kurkumīns (2.C attēls) būtiski neietekmēja šo gēnu ekspresiju. Mēs prātojām, vai ekspresijas izmaiņas šajos gēnos ir evolucionāri saglabājušās, un novērtējām to ekspresiju dažādos audos (ti, smadzenēs, aknās, zarnās un asinīs) 8- un 18-mēnešus vecos savvaļas tipa un AhR KO peles. Dažiem gēniem bija tendence uz paaugstinātu ekspresiju jaunām (atf-2 homologs) vai vecām (lpr-4/5 homologiem) pelēm audiem raksturīgā veidā, taču netika konstatēts ne acīmredzams modelis, ne konservētas izmaiņas. novērots (S2 attēls). Šie rezultāti atspoguļo iespējamās sugai raksturīgās atšķirības vai no audiem atkarīgo AhR transkripcijas aktivitāti zīdītājiem, ko neņem vērā visa dzīvnieka transkriptomiskā analīze C. elegans. Rūpīga C. elegans savvaļas tipa un ahr{77}} (45. jūl.) visdažādāk ekspresēto gēnu izpēte atklāja, ka daudzu šo gēnu ekspresiju ietekmē C.elegans novecošanās laikā, kā arī uztura zīdītāju AhR modulatori ( piemēram, kvercetīns un resveratrols)[25], tādējādi liekot domāt par AHR-1 lomu polifenolu modulētā gēnu ekspresijā. Saskaņā ar šo scenāriju mikroarray dati parādīja, ka lielākā daļa gēnu, kas atšķirīgi izteikti, ārstējot ar kurkumīnu, patiešām tika regulēti atkarībā no ahr{82}} (2. D attēls; 1. tabula).cistanche tubulosa ekstraktsNo 47 gēniem, ko savvaļas tipā izmainīja kurkumīns (43 uz augšu un 4 uz leju), tikai 5 tika inducēti arī ar kurkumīnu ahr-1 (ju145). Starp gēniem, ko kurkumīns regulē AHR-1-atkarīgā veidā, bija II fāzes enzīmi, un interesanti, ka dažus no tiem (ugt-9 un ugt-29) kurkumīns regulēja vienā virzienā. orby zaudējums ahr-1 (1. tabula). Tādējādi mēs pārbaudījām to izteiksmi un papildu ugts (ugt-45 un ugt-57), kas tika izteiktas atšķirīgi, piemērojot mazāk ierobežojošu statistisko analīzi, kas nav koriģēta vairākiem salīdzinājumiem. No pārbaudītajiem gēniem ugt-45 palielinājās ahr-1(ijul45) un kurkumīna terapijas rezultātā (3.A un B attēls). Mēs arī novērojām izmaiņas dažu detoksikācijas gēnu ekspresijā starp savvaļas tipa un AhR KO peles no audiem atkarīgā veidā. Šo gēnu diferenciālā ekspresija bija visaugstākā smadzenēs, kur Ugt2a3 (ugt-9 un ugt-29 C.elegans) bija zemāka un Hpgds (gst-4 C. elegans gadījumā) tika regulēts (S3A attēls). Neviena pārbaudītā gēna ekspresija nemainījās pelēm aknu paraugos (S3B attēls). Saskaņā ar C,elegans datiem ugt-45 peles homologam Ugt3a2 bija tendence uz pārmērīgu ekspresiju Ahr KO peļu zarnas (S3C attēls). Proti, ugt-45 RNSi novērsa labvēlīgo ietekmi uz dzīves un veselības ilgumu, ko veicināja kurkumīns (3. C un D attēls) vai ahr-1 izsīkums (3. E, F attēls), norādot, ka abas iejaukšanās var būt atkarīgas no kopīgi modulēta pakārtota signalizācija, lai izraisītu to pretnovecošanās aktivitāti.

2. attēls. Gēni, ko atšķirīgi regulē kurkumīns, galvenokārt tiek regulēti ahr-1-atkarīgā veidā.(A)Gēnu ontoloģija (GO) bagātināšana bioloģiskiem procesiem pēc GO termina saplūšanas ahr-1 vs. wt. (B, C) Spēcīgāko lejup un augšup regulēto gēnu ekspresija starp wt un ahr-1 [25] tika novērtēta ar qPCR wt vs.ahr-1(B) un DMSO-vs. . ar kurkumīnu apstrādātas nematodes (C). Boxplots parāda datus no 3 eksperimentiem. Izteiksme ir parādīta attiecībā pret ar DMSO apstrādātu wt (pārtraukta līnija). Statistiskais tests:1-ANOVA veids ar Tukey vairāku salīdzinājumu testu,*p vērtība<0.05 vs.wt.="" (d)venn="" diagram="" of="" differentially="" expressed="" genes="" on="" the="" microarray.="" the="" number="" of="" genes="" that="" were="" differentially="" up-or="" down-regulated="" between="" the="" indicated="" conditions="" is="" shown="" in="" red="" and="" blue,="" respectively.="" the="" numbers="" in="" the="" interchanges="" refer="" to="" the="" genes="" that="" occurred="" in="" both="" comparisons.="" the="" values="" in="" the="" lower="" right="" corner="" show="" the="" number="" of="" genes="" on="" the="" array="" that="" were="" not="" differentially="">

Attēls 3.ugt-45 ir nepieciešams kurkumīna un ahr-1 mutantu mūža pagarināšanai. (A, B) Gēnu ekspresija tika novērtēta ar qPCR wt vs.ahr-1(A) un DMSO- salīdzinājumā ar kurkumīnu apstrādātām wt nematodēm (B). Boxplots parāda datus no 3 eksperimentiem. Izteiksme ir parādīta attiecībā pret ar DMSO apstrādātu wt (norādīta kā pārtraukta līnija). Statistiskais tests: 2-Ceļa ANOVA ar Sidaka vairāku salīdzinājumu testu, *p-vērtība<0.05vs.wt,><0.05 vs.="" dmso.="" (c,d)effect="" of="" ugt-45="" rnai="" on="" the="" curcumin-mediated="" life/health="" span="" extension="" in="" the="" wt.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" "significance="" vs.="" dmso,*="" significance="" vs.control="" rnai,="" bonferroni=""><0.05.(e,f)effect of="" ugt-45="" rnai="" on="" ahr-1-mediated="" life/healthspan="" extension.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,#="" significance="" vs.="" wt,*="" significance="" vs.="" control="" rnai,="" bonferroni=""><>

3.3. AHR-1 un kurkumīns neatkarīgi aizsargā pret oksidatīvo stresu

Polifenolu labvēlīgās īpašības bieži tiek attiecinātas uz to spēju aizsargāt pret reaktīvām skābekļa sugām (ROS)|83,84]. Tā kā AhR ir iesaistīts oksidatīvā stresa izraisītos procesos [85-87], mēs domājām, vai kurkumīns var ietekmēt dzīvnieku fizioloģiju, izmantojot AhR regulētas antioksidantu reakcijas. Mēs novērojām, ka ahr-1 mutanti rada vairāk mitohondriju (mt)ROS un tiem ir samazināts mitohondriju membrānas potenciāls (4.A un B attēls), kas ir divi parametri, kas korelē ar ilgmūžību [88,89]. Lai gan saskaņā ar mitohormēzes paradigmu ahr{10}}(45. jūlijs) ražo nedaudz vairāk mtROS un dzīvo ilgāk, šie dzīvnieki bija jutīgāki pret oksidatīvo stresu nekā savvaļas tips. Konkrētāk, juglona un H2O2 izraisītā kaitīgā ietekme uz dzīvnieku lēkšanu, kustīgumu un izdzīvošanu bija ievērojami spēcīgāka ahr{14}}(45. jūlijā) salīdzinājumā ar savvaļas tipu (4. C-F attēls). Šie dati liecina, ka AHR-1 izsīkumam ir labvēlīga motoriskā iedarbība bazālos apstākļos, savukārt tā klātbūtne ir nepieciešama aizsardzībai pret oksidatīvo stresu, tādējādi atdalot divus bieži korelējošus ar vecumu saistītus parametrus, proti, dzīves ilgumu un izturību pret stresu. Tā vietā kurkumīns ievērojami uzlaboja H, O un juglona rezistenci gan savvaļas tipa, gan ahr{21}} mutantos (4.E, F attēls), kas liecina, ka kurkumīns izraisa ahr-1-neatkarīgu antioksidantu reakciju. Saskaņā ar nesaistīto dzīves ilguma un oksidatīvā stresa rezistences regulējumu ugt-45 klusēšana neietekmēja jutību pret oksidatīvo stresu ne ahr-1 mutantiem, ne ar kurkumīnu ārstētiem dzīvniekiem (4.G attēls).cistanche tubulosa atsauksmesTādējādi kurkumīnam ir ilgstoša iedarbība, izmantojot ahr-1 un ugt-45, bet tas aizsargā pret oksidatīvo stresu, izmantojot ahr-1-neatkarīgus mehānismus.

3.4. Nrf2/SKN-1 veicina kurkumīna AhR neatkarīgo iedarbību

Lai vēl vairāk novērtētu AhR-kurkumīna šķērsrunu papildu ar vecumu saistītās iezīmēs, mēs izmērījām migrācijas spēju cilvēka primārajā EK — asinsvadu funkcionalitātes pazīme, kas samazinās līdz ar vecumu [90] un samazinās AhR aktivācijas rezultātā [14]. Atbilstoši ahr{5}} nomākšanas un kurkumīna pretnovecošanās aktivitātei AhR pārmērīga ekspresija tika ievērojami kavēta, bet kurkumīns palielināja cilvēka primārās EK migrācijas spēju (5.A attēls). Jāatzīmē, ka kurkumīna migrācijas spēju indukcija bija salīdzināma tukšās ar vektoru vai AhR ekspresijas vektoru transfektētās šūnās (5.A attēls). Tomēr ar kurkumīnu apstrādāto šūnu migrāciju ievērojami samazināja AhR pārmērīga ekspresija: kurkumīns tukšās ar vektoru transfektētās šūnās inducē līdz 60 migrētām šūnām uz lieljaudas lauku, savukārt AhR pārmērīgi ekspresējošās šūnās tikai līdz 25 šūnām uz lieljaudas lauku (attēls 5A). Šie dati liecina, ka kurkumīna migrējošo efektu modulē no AhR neatkarīgi mehānismi, bet, iespējams, arī AhR aktivitātes samazināšanās. Pēc tam mēs noteicām intracelulāro AhR sadalījumu un cVplal ekspresiju ar kurkumīnu ārstētā cilvēka EK, kurkumīns neietekmēja AhR kodola translokāciju (5.B attēls) vai ciplālo ekspresiju (5.C attēls). Meklējot ceļus, ko kurkumīns modulē no AhR neatkarīgā veidā, mēs atgriezāmies pie nematodes transkripta profiliem, lai atrastu transkripcijas faktorus, kas regulē gēnus, kurus būtiski modulē ahr-1 zudums vai ārstēšana ar kurkumīnu savvaļas tipa dzīvniekiem (1. ). Veicot in silico meklēšanu, tika identificēts redokstranskripcijas faktors SKN-1, cilvēka Nrf2 ortologs (ar kodolfaktoru eritroīdā 2-saistītais faktors 2), kura aktivācija ar kurkumīnu [91] bieži tiek ziņots kā iespējamais starpnieks. tā antioksidanta aktivitāte [92,93]. Attiecīgi prototipa C.elegans Nrf2/SKN-1-atkarīgais gēns gst-4 ir pārmērīgi ekspresēts alhr-1 mutantā [25] un inducēts ar kurkumīnu savvaļas tipa un vēl vairāk. ahr-1 mutantos (5.D attēls). Turklāt kurkumīns palielināja Nrf2 stabilizāciju un kodola translokāciju primārajā cilvēka EK (attēls 5E) un izraisīja mangāna superoksīda dismutāzes (Sod2) - klasiskā Nrf2 mērķa gēna - ekspresiju šūnās, kas transficētas ar tukšu vektoru vai šūnās, kurās AhR apklusina shRNS (5.F attēls). AhR shRNS Sod2 indukcijas trūkums EK var būt saistīts ar daļēju (50 procentiem) ekspresijas samazinājumu (S3D attēls), kas var nebūt pietiekams, lai aktivizētu Nrf2 vai papildu transkripcijas faktoru (TF), kas , C.elegans, var piekrist gst-4 [94] indukcijai pēc pilnīgas AhR izsīkšanas. Interesanti, ka Hpgds, C.elegans gst-4 homologs, bija ievērojami palielināts AhR KO peļu smadzenēs (S3A attēls), taču tas nav Nrf2 mērķis. Papildu pierādījumi iespējamai Nrf2/SKN-1 neatkarīgai signalizācijai, ko aktivizē ahr-1 izsīkums, ir tas, ka gst-4 aktivizēšanu ar kurkumīnu pilnībā nomāc ādas-7 RNSi C.elegans savvaļas tips, savukārt ahr-1 mutanti joprojām inducē gst-4, neskatoties uz ādas-1 izsīkumu (5G, H attēls). Tomēr ādas-1 RNSi samazināja oksidatīvā stresa pretestību gan savvaļas tipa, gan ahr-1(ju145) (5I. attēls). Negaidīti ādas klusēšana neietekmēja ar kurkumīnu ārstēto dzīvnieku juglona rezistenci (5. attēls). Mūsu dati atklāj sarežģītu scenāriju, saskaņā ar kuru kurkumīns veicina dažādas pretnovecošanās funkcijas, balstoties vai nu uz AhR atkarīgu vai no AhR neatkarīgu, bet no Nrf2/SKN{77}}atkarīgu (un papildu) signālu.

4. attēls. AHR-1 un kurkumīns neatkarīgi aizsargā pret oksidatīvo stresu. (A) Reprezentatīvi attēli (pa kreisi) un DSRed intensitātes kvantitatīva noteikšana (pa labi) ar MitoSOX iekrāsotajās wt vai ahr -1 nematodēs. Boxplots parāda apkopotus datus no 129-135 tārpiem/stāvokļiem 3 eksperimentos. ( B ) Mitohondriju membrānas potenciāls tika novērtēts ar TRME krāsošanu norādītā vecuma nematodēs. Tiek parādīti reprezentatīvi attēli (pa kreisi) un TMRE fluorescences kvantitatīvā noteikšana (pa labi). Boxplots parāda apkopotus datus no 3 eksperimentiem. (C, D) Rīkles sūknēšanas aktivitāte (C) un kustīgums (D) wt un ahr-1 mutantiem pēc apstrādes ar H2O2. Boxplots parāda apkopotus datus no 39-54(C) vai 35-36 tārpiem/stāvoklis (D) 3-4eksperimentos.*p-vērtība<0.05 vs.wt,$=""><0.05 vs.control="" treatment,="" statistical="" test:="" 1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (e)pharyngeal="" pumping="" of="" curcumin-treated="" nematodes="" after="" h,="" o,="" treatment.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 32="" worms/conditions="" in="" 2experiments.="" *=""><0.05><0.05cur vs.="" dmso="" treatment,="" $=""><0.05 h2o2="" vs.="" control="" statistical="" test:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.(f)influence="" of="" curcumin="" on="" juglone-induced="" toxicity.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 500="" worms/condition="" in="" 20="" experiments.="" *significance="" alhr-1="" vs.wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05.(g) effect="" of="" ugt-45="" rnai="" in="" curcumin-fed="" wt="" and="" ahr-1="" worms.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 150="" worms/condition="" in="" 6experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05. no="" statistical="" significance="" was="" observed="" in="" ugt-45="" vs.="" control="" rnai-treated="">

5. attēls. Kurkumīns aktivizē Nrf2/SKN-1 neatkarīgi no AhR.(A) skrāpējuma brūces testa ar kurkumīnu (cur) vai DMSO apstrādātā cilvēka primārajā EK, kas transficēta ar tukšu vektoru (EV) vai ekspresijas vektoru cilvēka AhR. Augšējais panelis: reprezentatīvi attēli; pārtrauktā līnija apzīmē migrācijas sākumu. Mēroga josla: 100 um. Apakšējais panelis: kvantifikācija; lodziņos ir parādīti 4-6eksperimentu dati. Statistikas pārbaude:1-veids ANOVA,*p<0.05><0.05 ys.dmso.(b,c)human="" primary="" ec="" were="" treated="" with="" cur="" or="" dmso.="" (b)representative="" immunostainings:="" ahr="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin="" (green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control="" (-con),="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.scale="" bar:50="" um.(c)="" relative="" capital="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr.="" mean="" expression="" in="" the="" dmso-treated="" controls="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" from="" 7="" experiments.="" (d)pgst-4:gfp="" expression="" in="" dmso-and="" curcumin-treated="" (cur)wt="" and="" alr-1="" worms.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 118-138="" worms/conditions="" in4=""><0.05><0.05 vs.="" dmso="" treatment,="" statistical="" test:1-way="" anova.(e)representative="" immunostaining="" images="" of="" human="" primary="" ec="" treated="" with="" cur="" or="" dmso:="" nrf2="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin(green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control(-="" con)="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.="" scale="" bar:="" 50="" um.(f)="" human="" primary="" ec="" was="" transfected="" with="" an="" empty="" vector(ev)or="" an="" expression="" vector="" for="" an="" shrna="" targeting="" the="" human="" ahr="" transcript="" (shahr).="" relative="" sod2="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr,="" and="" mean="" expression="" in="" the="" ev="" transfected="" cells="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" of="" 7experiments.=""><0.05 vs.="" respective="" control.="" (g,h)="" post-4:gfp="" expression="" in="" dmso-or="" cur-treated="" wt="" and="" ahr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skin-1="" rnai.="" representative="" images(g)="" and="" gst-4-driven="" gfp="" quantification(h)="" are="" shown.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 103-189="" worms/conditions="" in="" 4="" experiments.="" (i)="" juglone="" stress="" survival="" in="" curcumin-="" or="" dmso-treated="" wt="" and="" alhr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skn-1="" rnai.="" kaplan="" meier="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 100="" worms/condition="" in="" 4="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,="" #significance="" curcumin="" vs.="" dmso,="" $="" significance="" skn-1="" vs.="" con="" rnai,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.5. Kurkumīnam un prooksidantiem ir pretēja ietekme uz AHR-1 aktivitāti

Saskaņā ar samazinātas AhRekspresijas/aktivitātes pretnovecošanās efektu, mūsu dati liecina, ka kurkumīns var pagarināt C.elegans dzīves ilgumu, nomācot AHR-1-regulētos ceļus, samazinot AHR-1 ekspresiju/aktivitāti vai iedarbojoties. uz kopējiem pakārtotajiem signalizācijas ceļiem. Tāpēc mēs mēģinājām kvantitatīvi noteikt AHR-1 aktivitāti C.elegans, bet daudzi mēģinājumi novērtēt AHR-1 ekspresiju un subcelulāro lokalizāciju, izmantojot antivielas (pret zīdītāju AhR vai pielāgotas antivielas pret CeAhR) vai fluorescējoši marķētas. reportieri (OP562, UL1709, ZG93) nesniedza nozīmīgus pierādījumus. Ņemot vērā, ka AHR-1 saistās ar XRE in vitro [35], mēs domājām izmantot XRE vadītu gēnu ekspresiju kā AHR-1 aktivitātes nolasījumu. Tādējādi mēs pievērsāmies pērtiķu izcelsmes Cos7 šūnām, kas neizpauž endogēno AhR un tādējādi neuzrāda endogēnu AhR aktivitāti [95,96], un tās var izmantot, lai uzraudzītu XRE virzītu luciferāzes indukciju kā AHR nolasījumu.{18}} aktivitāte (Larigot et al.; iesniegts kopā ar šo pētījumu). Kad Cos7 šūnas tika kotransfektētas ar vektoriem, kas ekspresē C.elegans AhR/alr-1, ARNT/aha-1 un ar luciferāzi saistītu XRE saturošu cilvēka CYPIA1 gēna promotoru [64] AHR{ {27}} uzrādīja zemu aktivitāti bazālos (ar transportlīdzekli ārstētos) apstākļos. Jāatzīmē, ka ārstēšana ar kurkumīnu vai citiem uztura līdzekļiem, kas veicina veselīgu C.elegans novecošanos, piemēram, luteīnu [97] un resveratrolu [98,99], ievērojami nomāca AHR-1 aktivitāti (6.A–C. attēls). Tā vietā BaP un leflunomīds, kas ir zināmi AhR aktivatori zīdītājiem, neietekmēja AHR -1 aktivitāti (6.A, B attēls) mūsu izmantotajās koncentrācijās. Konkrēti, AHR-1 aktivitāte tika atcelta Cos7 šūnās, kas transficētas ar vektoru, kas ekspresē ahr-1(jul45) alēli, nevis savvaļas tipa alēli (6A-C attēls), kas liecina, ka jul45 ir patiess. funkciju zuduma alēle un ka izmērītā luciferāzes intensitāte ir saistīta ar funkcionālo AHR-1.

Pēc tam mēs centāmies izpētīt, vai kurkumīns samazina AHR -1 aktivitāti ar tiešu saistīšanu vai netiešu modulāciju. Līdz šim C.elegans AHR-1 ligandi nav identificēti, un, tā kā nav pieejama informācija par tā LBD, mēs veicām in silico analīzi, lai to raksturotu. Abas AHR-1 izoformas, la un 1b, tika izlīdzinātas un, lai arī atšķiras pēc garuma, to PASB domēna secība ir identiska. Pēc tam šī secība tika saskaņota ar Drosophila melanogaster PASB domēnu un diviem AhR no mugurkaulniekiem, kuriem iepriekš tika izveidoti strukturālie modeļi, proti, peles (Mus musculus)[100] un zebrazivs (Danio rerio)[101] (attēls). 6D). Izlīdzināšana parādīja skaidras atšķirības starp sugām ar galveno īpatnību bezmugurkaulniekiem, kas izslēdz secību dzēšanu PAS domēna mainīgākajā reģionā, kas atbilst elastīgajam reģionam, ieskaitot spirālveida saišķi (C , D , E spirāles) un īsās cilpas, kas savieno. šos elementus (6.D,E attēls). Šīs dzēšanas varētu samazināt pieejamo vietu šo AhR saistīšanas dobumā. Pēc tam mēs izveidojām AHR-1 PASB 3D modeli, izmantojot homoloģijas modelēšanu. Šim modelim ir tipisks PAS locījums, bet ar īsāku Do spirāli, salīdzinot ar citiem AhR. Tomēr iekšējam dobumam ir dažas īpatnības; tajā ir vairāk hidrofobu atlikumu, un to pārgriež uz pusēm dažas iekšējās sānu ķēdes. Jo īpaši H365 un H274 ir saskaras un var veidot ūdeņraža saiti dobuma vidū; turklāt Y332, L363 un L302 sānu ķēdes var aizsprostot dobumu, samazinot ligandiem pieejamo iekšējo telpu (6. E attēls). Šis mazais un saīsinātais dobums, visticamāk, neļauj saistīt lielus ligandus (piemēram, TCDD vai kurkumīnu). Līdzīgi kā AHR-1 strukturālajā modelī, zebrafish zfAhRla modelis parādīja, ka LBD dobums ir saīsināts salīdzinājumā ar TCDD saistošajiem paralogiem zfAhR1b un zfAhR2 [101]. Mazie un elastīgie ligandi, piemēram, leflunomīds, saistās un aktivizē zfAhRla, bet mūsu pārbaudītā leflunomīda koncentrācija neaktivizēja AHR-1 mūsu Cos7 šūnu sistēmā (6.B attēls). Pēc tam mēs domājām, vai mutācijas aminoskābēs, kas ir atbildīgas par nelielo LBD dobumu, varētu ļaut klasiskajiem ligandiem aktivizēt CeAhR. CeAhR L363 atlikums (6.D attēls) atbilst A375 mAhRb-I un V375 Madridē, un šim atlikumam ir liela ietekme uz ligandu saistīšanos [102]. Līdzīgi zfAhRla T386 (6.D attēls), kas atbilst A375 mAhRb-1 un A386 zfAhR1b un zfAhR2, veicina zfAhRla TCDD saistīšanās trūkumu un, mutējot pret alanīnu, atjauno jutībuH, kad ir arī YDD96. ieviests [101]. Aminoskābe Y296 jau ir C.elegans(H274) histidīns. Tādējādi mēs mutējām tikai leicīnu L363 pozīcijā CeAhR vektorā par alanīnu (L363A) (6.D, E attēls, kas norādīts ar bultiņu). Turklāt mēs mutējām blakus esošo histidīnu pozīcijā H365 uz glutamīnu (H365Q), kas pelēm ir Q377 (6.D attēls, E, kas norādīts ar bultiņu), jo tas, iespējams, veido ūdeņraža saiti ar H274 un var veicināt AHR mazo dobumu. {49}} (6. E attēls). Pēc tam mēs pārbaudījām, vai zīdītāju AhR ligandi ietekmē AHR{51}} aktivitāti, kad L363 un H365 ir mutēti. Tomēr šīs izmaiņas tā vietā, lai atjaunotu reakciju uz ksenobiotiskajiem ligandiem, kā tas ir zebrafish [101], likvidēja pat bazālo AHR-1 aktivitāti, līdzīgi kā ju145 alēlei (6.F attēls). Šie rezultāti parāda skaidras atšķirības starp C.elegans un zebrafish LBD, taču parāda, ka LBD ir būtiska AHR-1 pamata aktivitātei. Kopā ar iepriekšējiem pētījumiem [35, 38, 82] mūsu rezultāti liecina, ka AHR-1, visticamāk, nav iesaistīta klasiskajā ksenobiotiku izraisītā transaktivācijas reakcijā, kas tādējādi var nebūt saistīta ar ahr-1-regulētu. fizioloģiskā novecošana. Tā vietā augu izcelsmes savienojumi vismaz daļēji var radīt konservatīvu efektu, nomācot AHR{66}}modulētos ceļus. Mūsu 3D modelis liecina, ka kurkumīns nemodulē AHR{68}} aktivitāti, saistot tā LBD. Tādējādi kurkumīna izraisītā AHR-1 aktivitātes nomākšana varētu būt saistīta ar tā antioksidanta iedarbību. Saskaņā ar šo iespēju un C.elegans ahr-1 mutantu paaugstināto jutību pret oksidatīvo stresu, mēs atklājām, ka AHR-1 aktivitāti patiešām palielina ROS inducējošie aģenti. Proti, Cos7 šūnas, kas apstrādātas ar prooksidantu rotenonu, uzrādīja paaugstinātu AhR aktivitāti, kad tās tika transficētas ar C.elegans vai peles AhR, bet ne tad, ja tās tika transficētas ar jul45 alēli vai alēli ar LBD mutācijām (6.G, H attēls).

Kopumā, lai gan CeAhR aktivācija aizsargā pret oksidatīvo stresu agrīnā dzīves posmā, tās samazinātā ekspresija neitralizē novecošanos un veicina kurkumīna labvēlīgo pretnovecošanās efektu (7. attēls). Tādējādi kurkumīns var palīdzēt līdzsvarot redox TF aktivāciju no konteksta un laika atkarīgā veidā un veicināt AhR nomākšanu tieši, pateicoties tā antioksidanta iedarbībai un/vai aktivizējot Nrf2/SKN-1 (vai citu TF), kas var vienlaicīgi. veicināt kurkumīna pretnovecošanās aktivitāti.

6. attēls. Kurkumīnam un prooksidantiem ir pretēja ietekme uz AHR-1 aktivitāti. (AC)AHR-1 aktivitātes novērtējums pēc apstrādes ar norādītajiem savienojumiem Cos7 šūnās, kas transficētas ar wt AHR-1(wt) vai AHR-1, kas satur ju145 punkta mutāciju (ju145) un AHA{10}}, kā arī ar XRE inducējamu luciferāzi. Boxplots parāda 3-5eksperimentu* p-vērtību datus<0.05><0.05 vs.="" dmso/etoh,="" statistical="" test:="" 2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (d)="" alignment="" of="" the="" lbds="" from="" c.elegans,="" drosophila,="" and="" zebrafish="" ahrs.="" the="" color="" scheme="" for="" residues:="" red,="" acidic;="" blue,="" basic;="" purple,="" polar;="" yellow,="" cys;="" brown,="" aromatic;="" green,="" hydrophobic;="" orange,="" ser,="" thr;="" gray,="" pro;="" white,="" gly.="" (e)="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" to="" the="" ceahr="" pasb="" are="" indicated="" on="" top(light="" gray="" bars="" for="" helices="" and="" dark="" gray="" bars="" for="" β-strands)="" and="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" asterisks="" mark="" the="" amino="" acids="" likely="" contributing="" to="" the="" inability="" of="" ceahr="" to="" bind="" big="" ligands.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" the="" investigation="" of="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).i3dmodels="" of="" the="" ceahr="" (left)="" and="" the="" mahr="" (right)="" pasb="" domains="" were="" obtained="" by="" homology="" modeling,="" shown="" in="" a="" cartoon="" representation.="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" are="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" the="" colored="" internal="" area="" (blue="" for="" ceahr="" and="" yellow="" for="" mahr)defines="" the="" molecular="" surface="" of="" the="" binding="" cavity="" identified="" by="" castp.="" in="" the="" car="" model,="" the="" amino="" acids="" protruding="" into="" the="" binding="" cavity="" (asterisks="" in="" panel="" d)="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" blue="" sticks.="" the="" mahr="" amino="" acids="" corresponding="" to="" those="" displayed="" in="" the="" ceahr="" model,="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" yellow="" sticks.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" studying="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).="" (f)="" ahr="" activity="" in="" bap-or="" mnf-treated="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" an="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365o="" mutations="" (lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr),="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt,"=""><0.05 vs.dmso.(g)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" ahr-1(either="" wt="" or="" ju145)="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.*=""><0.05vs.wt, #=""><0.05 vs.="" dmso.(h)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365q="" mutations(lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr).boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt/ahr-1,="" #="" p-value=""><0.05 vs.="">

7. attēls. Piedāvātais AHR-1 signalizācijas ceļa modelis C.elegan reakcijā uz pro- un antioksidantiem. "Parastos"apstākļos (vidējais panelis) AHR-1 aktivizē intracelulārais ROS. Tas noved pie chaperonu izdalīšanās no citozola AHR-1 un sekojošas AHR-1 kodoltranslokācijas. Kodolā AHR-1 veido heterodimēru ar AHR kodoltranslokatoru (AHA{). {7}}) un saistās ar mērķa gēnu XRE, kas savukārt noved pie intracelulārā ROS līmeņa pazemināšanās. Šādos apstākļos ahr{8}} funkcijas zudums palielina kalpošanas laiku. Antioksidantu klātbūtnē (kreisais panelis) intracelulārā ROS koncentrācija ir zema, kā rezultātā AHR-1 atrodas citoplazmā, ko saista tās kofaktori. Bāzes AHR{10}} aktivitātes kavēšana palielina dzīves ilgumu. Prooksidantu klātbūtnē (labais panelis) AHR-1 aktivizē pārmērīgs ROS, kā rezultātā notiek tā kodola translokācija, AHR-1-AHA-1 heterodimēra veidošanās un mērķa gēna transkripcija. Ahr-1 KO gadījumā samazināta ROS detoksikācija, izmantojot AHR-1-inducētos mērķa gēnus, izraisa ROS uzkrāšanos un padara ahr-1 KO jutīgu.

4. Diskusija

Sākotnēji AhR tika atklāts zīdītājiem tās ksenobiotiskās reakcijas aktivitātes dēļ, ko izraisa vides toksisko vielu vai endogēno ligandu saistīšanās, taču pastāv arī modulatori, kas nepaļaujas uz ligandu saistīšanos, taču tie ir daudz mazāk pētīti. C.elegans ir unikāls paraugorganisms, lai pētītu AhR aktivitātes neatkarīgi no tā klasiskās ksenobiotiskās reakcijas, jo CeAhR nesaista prototipu AhR ligandus [35,39]. Izmantojot šo modeli, mēs identificējām evolucionāri konservētu AhR funkciju novecošanas procesā [14] un parādījām, ka daži zīdītāju AhR modulatori (ti, baktērijas, Bal un UVB) ietekmē novecošanās parametrus caur AHR-1. konteksta atkarīgā veidā [25]. Šeit mēs turpinājām savus iepriekšējos atklājumus, mehāniski izmeklējot AhR regulētās novecošanās pazīmes starp sugām, izmantojot uztura polifenola kurkumīnu. Mūsu kombinētās in vivo, in vitro un in silico analīzes atklāja jaunu un sarežģītu scenāriju: lai gan kurkumīns vismaz daļēji no AhR atkarīgā veidā veicina pretnovecošanās īpašības nematodēs un cilvēka primārajā EK, tā antioksidanta iedarbība abās sugās ir atkarīga. uz AhR neatkarīgiem, bet galvenokārt Nrf2/SKN{11}} atkarīgiem mehānismiem.

Mēs pirmo reizi parādījām, ka kurkumīns aizkavē C.elegans fizioloģisko novecošanos AHR{0}}atkarīgā veidā. Meklējot iespējamos kurkumīna pakārtotos ahr-1-atkarīgos efektus, mēs izmantojām mērķtiecīgas un objektīvas pieejas un atklājām, ka lielākā daļa atšķirīgi regulēto gēnu, kas tiek ārstēti ar kurkumīnu, tiek regulēti AHR-1-atkarīgā veidā. Turklāt daudziem no šiem gēniem bija līdzīgs ekspresijas modelis ar AHR-1-noplicinātiem un ar kurkumīnu ārstētiem dzīvniekiem, kas liecina, ka kurkumīns veicina dzīves ilguma pagarināšanu, nomācot AHR-1 aktivitāti. Pārsteidzoši, ne mērķtiecīgā, ne transkriptomiskā analīze neliecināja par nozīmīgu lomu klasiskajiem AhR mērķu gēniem, piemēram, kausiem, un tā vietā tika konstatēts, ka neironos lielā mērā ir nepietiekami izteikts (Larigot et al.; iesniegts kopā ar šo pētījumu). Interesanti, ka šie atklājumi var norādīt, ka vesela dzīvnieku transkriptika var maskēt AhR neironu specifisko iedarbību, šajā konkrētajā gadījumā izmantojot cps gēnus. Mēs noskaidrojām, ka starp atšķirīgi ekspresētajiem gēniem daudzi pieder pie II fāzes detoksikācijas enzīmiem, piemēram, zarnu-45, ko palielināja gan ahr-1 izsīkums (un AhR KO peļu smadzenēs). un ārstēšana ar kurkumīnu, lai veicinātu to dzīves ilguma pagarināšanu. Tā vietā ārstēšana ar kurkumīnu un ahr{12}} samazināšanās palielināja cita II fāzes detoksikācijas enzīma GST-4 ekspresiju, izmantojot dažādus mehānismus: pirmais paļaujas uz, bet otrais galvenokārt ir neatkarīgs no Nrf2/ SKN-1, klasisks redox TF, kas izraisa GST-4 oksidatīvā stresa ietekmē C.elegans [103]. Turklāt, lai gan kurkumīns izraisa Nrf2/SKN-1-atkarīgas atbildes reakcijas C.elegans (GST-4 ekspresija) un cilvēka primārā EK (Sod2 ekspresija un migrācijas spēja), tas arī aizsargā C.eleans pret oksidatīvo stresu. SKN-1-neatkarīgā veidā. C.elegans gadījumā kurkumīns nevar pagarināt mūža ilgumu ļoti slimas ādas -1(zu67) mutantiem [104], savukārt GST-4 var inducēt SKN-1-neatkarīgā veidā ar EGF signālu palīdzību. [94], un zīdītājiem tika ziņots par šķērsrunu starp EGF ceļu un AhR [105].

Interesanti, ka pretēji savvaļas tipa celmam mēs novērojām AHR-1-neatkarīgu kurkumīna ietekmi uz veselības ilgumu attiecīgi Hantingtona un Parkinsona slimības nematožu modeļos. Šajos celmos ārstēšana ar kurkumīnu palielināja proteīnu agregātu skaitu tādā pašā mērā kā AHR-1 deficīts, norādot uz pašas proteīna agregācijas aizsargājošo iedarbību un/vai uz kurkumīna aktivizēšanu ceļiem, kas aizsargā pret proteīnu agregāciju neatkarīgi no a/ hr-1 izsīkums. Kurkumīna ietekme uz proteīnu agregāciju ir pretrunīga: tika pierādīts, ka tas kavē fibrilu veidošanos, bet arī saistās ar amiloidogēno proteīnu prefibrilārām/oligomērām sugām, tādējādi paātrinot to agregāciju un samazinot vispārējo neirotoksicitāti [106]. Jāatzīmē, ka kofeīns, kas arī aizsargā pret sirds un asinsvadu novecošanas pazīmēm [66, 107], arī novērš A izraisītu paralīzi, nesamazinot A agregātus, bet aktivizējot aizsargājošo Nrf2/SKN{10}}atkarīgo ceļu [108]. Būs svarīgi novērtēt, vai C.elegans slimības modeļos kurkumīna vai visa{12}} izsīkuma izraisītā aizsargājošā iedarbība ir saistīta ar mehānismiem, kas veicina oligomēru/pirmsfibrilāru sugu izvadīšanu mazāk toksiskos agregātos un/vai citu mehānismu, piemēram, Nrf2/SKN-1, aktivizēšana, kas vienlaikus var aizsargāt pret proteotoksicitāti. Jāatzīmē, ka detoksikācijas enzīmi var saturēt gan XRE, gan ARE (antioksidantu reaģējošus elementus), un ir aprakstīta mijiedarbība starp Nrf2/ARE un AhR/XRE regulēto signalizāciju [109]. Tāpēc būs interesanti noskaidrot, kā kurkumīns veicina tā atšķirīgo labvēlīgo pretnovecošanās iedarbību, izmantojot līdzsvaru starp Nrf2 un AhR regulēto signalizāciju.

Mūsu kombinētās pieejas parādīja, ka kurkumīns kavē AHR{0}} aktivitāti. Tika ierosināts, ka zīdītājiem kurkumīna AhR inhibējošo iedarbību veicina tieša saistīšanās ar LBD [110] vai proteīnkināzes C, kas fosforilē AhR, inhibīcija[79]. Cits pētījums norādīja, ka AhR transkripcijas aktivitāte ir atkarīga no šūnu redox statusa un hromatīna struktūras, ko abus ietekmē kurkumīns[111]. Lai gan AHR-1 nesaista TCDD, tas saistās ar XRE in vitro[36], taču sistemātisku pētījumu, kas pievēršas poliaromātisko ogļūdeņražu vai citu zīdītāju AhR ligandu potenciālam modulēt AHR-1, trūkst galvenokārt tāpēc, ka piemērotu instrumentu trūkums, lai to novērtētu. Mūsu pētījumi mēģina aizpildīt šo plaisu un izmantot Cos7 šūnas, kas ekspresē AHR-1, kas saistītas ar luciferāzes testiem (Larigot et al.; iesniegts kopā ar šo pētījumu), un C. elegans LBD in silico modelēšana atklāja, ka kurkumīns nomāc AHR. -1 darbību, bet, visticamāk, ne ar tiešu LBD saistīšanu. Mūsu pētījumā izmantotais in vitro tests apstiprināja, ka CeAhR netiek aktivizēts, izmantojot klasisko ksenobiotiku signālu. Tomēr tas neatklātu aktivitātes, kas saistītas ar AhR saistīšanos ar DNS sekvencēm, kas nav "klasiskais" XRE, kas atrodams CYP1A1, piemēram, uz polifenolu (kvercetīnu) reaģējošais XRE, kas atrodams PON1 [112, 113]. Imūnkrāsošana cilvēka primārajā EK arī iebilst pret kurkumīnu, kas izraisa AhR kodola translokāciju, kas kopā ar migrācijas spējas veicinošo efektu AhR pārmērīgi ekspresējošās šūnās var arī norādīt, ka kurkumīns nomāc AhR aktivitāti.

Mēs ierosinām, ka kurkumīna inhibējošā iedarbība, nevis paļaušanās uz AhR saistīšanos, ietver tā antioksidanta spēju, kas patiešām var būt saistīta ar Nrf2/SKN-1 aktivāciju vai pat atkarīga no tās. Zīdītāju AhR aktivizē ROS, izmantojot no LBD neatkarīgu oksidatīvo modifikāciju [85], taču mūsu dati liecina, ka AHR-1 aktivitātes indukcijai ar prooksidantu rotenonu ir nepieciešams LBD. Netiešs ROS mediētās AhR aktivācijas mehānisms ir spēcīga AhR liganda FICZ veidošanās[114]. Tomēr FICZ ir liela plakana molekula, kas saskaņā ar mūsu in silico modeli neatbilst AHR-1 LBD. Lai gan precīzs mehānisms, ar kuru AHR-1 aktivitāti veicina ROS un inhibē kurkumīns (vai nu ar tiešu ROS dzēšanu, vai netieši, aktivizējot Nrf2 vai citus antioksidantus regulējošos gēnus), vēl nav noskaidrots, to stingri atbalsta mūsu atklājumi: AHR-1 aktivizē rotenons, un ahr-1 mutanti uzrāda vairāk mtROS, samazina mitohondriju membrānas potenciālu un ir jutīgāki pret H, O un juglonu, kā arī pret UVB un BaP [25] , kas abi ražo ROS[115,116]. Šajā kontekstā ir interesanti atzīmēt, ka ahr-1 mutanti uzrāda nelielas mitohondriju funkciju izmaiņas, kas līdzinās mitohormēzes funkcijām [117. Tas liek domāt, ka visa-1 izsīkšana (un iespējamais kurkumīns, inhibējot AHR-1) var veicināt veselības saglabāšanu ar vieglu mitohondriju stresu, kas, kā zināms, pagarina C.elegan dzīves ilgumu, izmantojot detoksikācijas gēnus, kas līdzīgi modulēti citās{19}}. {20}} mutanti [118,119]. Turklāt, vai Nrf2/SKN-1 un mitohondrijiem ir nozīme AHR-1 aktivitātes modulēšanā kurkumīna terapijas laikā, ir interesanta iespēja, kas vēl ir jāapstiprina.

Kopumā, izmantojot daudzās nematodes C.elegans piedāvātās iespējas in vivo pētījumiem, mēs ierosinām, ka AhR senču funkcija varētu būt fāzes 1-enzīmu regulēšanā, kas saistīti ar antioksidantu, nevis ksenobiotisku reakciju. Pretēji kaitīgajai ietekmei, ko izraisa augsts ROS līmenis, labvēlīgo ietekmi, ko veicina AhR deficīts, var izraisīt viegls mitohondriju stress un/vai viegla ROS veidošanās (mitohormēze), kas arī ir atkarīga no Nrf2/SKN-1. Mēs arī sniedzam pārliecinošus pierādījumus par mijiedarbību starp kurkumīnu un AhR. Kurkumīna AhR signālu inhibīcija ir evolucionāri konservēta, un to, visticamāk, neizraisa saistīšanās ar AhR LBD, bet gan kurkumīna ROS attīrīšanas īpašības vai Nrf2/SKN -1 aktivizēšana. Kurkumīns patiešām var aktivizēt Nrf2 signalizācijas ceļu dažādos veidos [91]. Visbeidzot, mūsu dati parādīja, ka kurkumīns veicina pretnovecošanās efektu arī neatkarīgi gan C.elegans (paaugstināta GST-4 ekspresija un oksidatīvā stresa rezistence), gan cilvēka primārajā EK (paaugstināta Sod2 ekspresija un migrācijas spēja ), kas varētu arī izskaidrot kurkumīna aditīvo ietekmi un AHR-1 funkcijas zudumu uz poliQ ekspresējošo dzīvnieku veselības ilgumu.

5. Secinājumi

Visbeidzot, izmantojot oriģinālu in silico, vitro un in vivo pieeju kombināciju, mēs parādījām, ka, lai gan CeAhR aktivācija aizsargā pret oksidatīvo stresu agrīnā dzīves posmā, tās samazinātā ekspresija neitralizē novecošanos un veicina kurkumīna labvēlīgo pretnovecošanās efektu (7. attēls). . Tādējādi kurkumīns var palīdzēt līdzsvarot dažādu transkripcijas faktoru aktivitāti, kas ir iesaistīti detoksikācijas/antioksidantu reakcijās (nomāc AhR un aktivizē Nrf2) apstākļos, kad tie tiek mainīti (palielina AhR un samazina Nrf2/SKN-1), piemēram, novecošanās vai ar vecumu saistīti traucējumi. Mūsu darbs jau tā plašajām daudzfunkcionālajām un kontekstam specifiskajām AhR aktivitātēm pievieno papildu sarežģītības līmeni, būtiski ietekmējot organisma veselību un dzīves ilgumu. Turklāt tas paver durvis papildu pētījumiem, izmantojot nematodu sistēmu, lai atklātu un izpētītu AhR senču funkcijas, kuras zīdītājiem mazāk iespējams identificēt.

Šis raksts ir iegūts no Antioxidants 2022, 11, 613. https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants