No Cistanche Deserticola izolētas kopējās feniletanoīda glikozīda frakcijas labvēlīgā ietekme uz kaulu mikrostruktūru žurkām, kurām veikta olnīcu izņemšana

Šis pētījums tika izstrādāts, lai novērtētu kopējās feniletanoīdu glikozīdu frakcijas, kas izolēta no C. deserticola (CDP), antiosteoporotisko aktivitāti žurkām, ko izraisīja olnīcu izņemšana (OVX), kā arī ar to saistītos mehānismus. Pēc 3 mēnešu perorālas lietošanas tika atjaunots samazināts kaulu minerālais blīvums, seruma Ca un P OVX žurkām, un trabekulārā kaula mikroarhitektūra tika daļēji uzlabota ar CDP (60, 120 un 240 mg/kg) iejaukšanos. kaulu rezorbcijas marķieri tika samazināti, un kaulu veidošanās indeksa bioaktīvais līmenis tika regulēts; tikmēr MDA saturs tika samazināts, un GSH palielinājās ar CDP ārstēšanu. Sastāvā CDP tika identificēti 8 feniletanoīdu glikozīdu savienojumi, kuru kopējais saturs tika kvantificēts kā 50,3 procenti, izmantojot HPLC metodi. Mehāniski CDP samazināja TRAF6, RANKL un RANK līmeni, tādējādi nomācot RANKL/RANK/TRAF6-inducēto pakārtoto NF-κB un PI3K/AKT signālu ceļu aktivāciju un galu galā novēršot NFAT2 galveno osteoklastogēno proteīnu aktivitātes. un c-Fos. Visi iepriekš minētie dati liecināja, ka CDP labvēlīgi ietekmēja kaulu mikrostruktūru žurkām ar olnīcu izņemšanu, un šīs sekas var būt saistītas ar NF-κB un PI3K / AKT signalizācijas ceļiem, ko izraisīja RANKL, RANK un TRAF6 saistīšanās.

Noklikšķiniet uz cistanche priekšrocības produkts

1. Ievads

Pēcmenopauzes osteoporoze, kurā cieš 1 no 3 sievietēm, kas vecākas par 50 gadiem, kļūst par galveno veselības apdraudējumu, kas skar vairāk nekā 200 miljonus sieviešu visā pasaulē [1]. Menopauzes laikā straujš estrogēna līmeņa pazemināšanās parasti izraisa kaulu rezorbcijas pārsniegšanu, ko izraisa pastiprināta osteoklastoģenēze; tad tika izjaukts līdzsvars starp osteoblastu izraisītu kaulu veidošanos un osteoklastu izraisītu kaulu rezorbciju, un paātrinātā kaulu rezorbcija beidzot izraisīja osteoporozi un pat gūžas vai mugurkaula lūzumus [2]. Tika uzskatīts, ka osteoklastu diferenciācija tika aktivizēta, kad kodolfaktora kappa B (RANK) receptoru aktivators bija saistīts ar RANKL, RANK ligandu. Tomēr RANK un RANKL kombināciju nevar aktivizēt, ja tajā nav pievienots ar proteīnu audzēja nekrozes faktora receptoriem saistītais faktors 6 (TRAF6) [3], kam seko pakārtoto signalizācijas ceļu, tostarp PI3K/AKT un NF-κB, stimulēšana. Visbeidzot, tika regulētas aktivēto T šūnu c2 (NFAT2) un c-Fos kodolfaktora izpausmes [4], lai modulētu osteoklastu diferenciāciju, kā arī kaulu rezorbciju. Tādējādi faktori un regulatori, kas ir tieši vai netieši saistīti ar osteoklastu aktivāciju un diferenciāciju, tika uzskatīti par būtiskiem mērķiem kaulu zuduma novēršanā.

Patiešām, ir dažas klīniskas un sintētiskas hormonu aizstājterapijas zāles, piemēram, estradiola valerāts, kas ir efektīvas pēcmenopauzes osteoporozes ārstēšanā. Diemžēl daži no tiem palielināja nopietnu vēža, tostarp krūts un endometrija vēža, risku [5], kas ierobežoja to klīnisko pielietojumu.

Tāpēc ir nepieciešams izvēlēties citas alternatīvas ar efektivitāti un minimālām blakusparādībām. Tradicionālās ķīniešu zāles (TCM), kā arī izolētie bioaktīvie savienojumi un frakcijas [6–9] ir izrādījušies efektīvi pret dažādām slimībām, tostarp pēcmenopauzes osteoporozi. Šo bioaktīvo komponentu un frakciju vidū feniletanoīdu glikozīdu (PhG) savienojumi ar potenciālu efektivitāti tika uzskatīti par daudzsološiem līdzekļiem osteoporozes ārstēšanā [10–12]. PhG struktūras sastāv no kanēļskābes aglikona, hidroksilfeniletilgrupas, kas ir savienota ar glikopiranozi, apiozi, galaktozi, ramnozi vai ksilozi, izmantojot glikozīdu saiti. Tie plaši sastopami Cistanche ģints zāļu sugās [13]. Cistanche deserticola YC Ma ir oficiāls TCM, kas ir reģistrēts Ķīnas farmakopejā, un C deserticola ir ne tikai svarīgs TCM [14], bet arī pretnovecošanās tonizējošs augs ar nelielām blakusparādībām, kas ir izstrādāts ārstniecības dzērienā un uztura šķidrumā, ko apstiprinājusi Valsts Pārtikas un zāļu pārvalde.

Pamatojoties uz Ķīnas farmakopejas ierakstu, vietējie iedzīvotāji tradicionāli izmantoja C. deserticola, lai risinātu tādas nieru deficīta problēmas kā muskuļu vājums un jostasvietas vājums, un feniletanoīdu glikozīdu savienojumi, tostarp ehinakozīds un akteozīds, ir šī auga galvenās bioaktīvās sastāvdaļas. Saskaņā ar TCM teoriju par "nieres pārvalda kaulu", kaulu sistēmu pārvalda nieru esence [15], un ar kauliem saistītas problēmas, piemēram, osteoporozi, var novērst, izmantojot ārstniecības augus vai savienojumus, kas baro nieru esenci. Tāpēc mēs izvirzījām hipotēzi, ka no C. deserticola izolētā kopējā feniletanoīda glikozīdu frakcija vismaz daļēji bija labvēlīga osteoporozes ārstēšanā. Tāpēc pašreizējais eksperiments tika izstrādāts, lai apstiprinātu mūsu hipotēzi, izmantojot ovariektomizētu (OVX) žurku modeli; papildus kaulu rezorbcijas un veidošanās marķieriem, kas ir jānovērtē, antioksidācijas indekss, kā arī RANKL/RANK/TRAF6- inducētie PI3K/AKT un NF-κB signalizācijas ceļi, tika izmantoti arī, lai izpētītu galvenos kaulu veidošanās mehānismus. antiosteoporotiskā bioaktivitāte

2. Materiāli un metode

2.1. Augu materiāli un sagatavošana. Kopumā 30 kg Cistanche deserticola YC Ma stublāji tika savākti no Yongning apgabala 2015. gada septembrī ar koordinātām 106.026597 un 38.262816, Ningsijas provincē, Ķīnā. Šo augu identificēja Dr. Lin Dong (Ningsijas Medicīnas universitātes Farmakognozijas nodaļa), un atbilstošs paraugs (#20150901) tika saglabāts Farmaceitiskās analīzes nodaļā.

Pirmkārt, 30.0 kg pulverveida C. deserticola tika ekstrahēti, izmantojot atteces metodi ar 70 procentiem etanola kā šķīdinātāju; materiāla attiecība pret šķīdinātāju tika iestatīta kā 1:10, un atteces laiks bija 2 stundas 3 reizes. Pēc tam visi filtrāti tika apvienoti un kondensēti pazeminātā spiedienā 60 °C temperatūrā. Otrkārt, iepriekšējai atdalīšanai tika izmantotas AB-8 makroporaino sveķu kolonnas un dažādas etanola attiecības ūdenī ({ Eluēšanai tika izmantoti {34}} procenti, 20 procenti, 30 procenti, 40 procenti, 50 procenti un 60 procenti, katrs 60 l). Treškārt, 40% un 50% eluenti tika apvienoti un tālāk attīrīti, izmantojot atkārtotas AB-8 makroporaino sveķu kolonnas ar eluentiem 0% , 20% , 30% , 40% un 50% etanola ūdenī, un katrs eluents bija 12 l. Visbeidzot, 40 procentu frakcija tika savākta un kondensēta pazeminātā spiedienā, lai iegūtu 150 g gaiši dzeltenas C. deserticola feniletanoīda glikozīda frakcijas (CDP, iznākums bija 0,5 procenti). In vivo eksperimentiem CDP izšķīdināšanai izmantoja 0,5% CMC-Na šķīdinātāju; perorāla ievadīšana dzīvniekiem tika iestatīta kā 1 ml/100 g ķermeņa svara; in vitro Western blot analīzei CDP tika izšķīdināts ar DMSO un pēc tam atšķaidīts ar DMEM, lai iegūtu galīgās koncentrācijas 0, 1 mg / ml, 0, 01 mg / ml un 0, 001 mg / ml.

2.2. Ķīmiskās vielas un šķīdinātāji. Estradiola valerāts (EV) bija no Delpharm Lille SAS, Francija; sārmainās fosfatāzes (ALP), kaulu gla-proteīna (BGP), tartrātu rezistentās skābes fosfatāzes (TRAP) un deoksipiridinolīna (DPD) šķērssaites ELISA komplekti no Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Šanhaja, Ķīna, 201605; malondialdehīda (MDA, 20181221), superoksīda dismutāzes (SOD, 20121218) un glutationa (GSH, 20181221) reaģentu komplekti no Nanjing Jiancheng Bioloģiskās inženierijas institūta, Nanjing, Ķīna; lntact parathormona (l-PTH, NEWASHE7UZ), kalcitonīna (2L9ISN7AIU) un ar estrogēnu saistīto alfa receptoru (ERR, Y3AY8QEWB3) šķērssaites ELISA komplekti no Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Vuhana, Ķīna; katepsīna K ELISA reaģenta komplekts no BioVision, Amerika, 1l300141; primārās antivielas pret RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κBp65 (AH04138226), PI3 alfakināzi AKT 1 (AF05173234), -aktīns (17AV0411) un sekundārās antivielas no mārrutku peroksidāzes konjugētā kazas antitrušu IgG no ZSGB-BIO, Ķīna, 136080; kopējā BCA proteīna testa komplekts un komerciālais komplekts osteoklastu veidošanās un liellopu augļa seruma noteikšanai un Dulbecco modificētā ērgļa barotne (DMEM) no HyClone, Logan, UT, ASV; polivinilidēnfluorīda (PVDF) membrāna no Millipore Life Sciences, Billerica, MA, ASV; penicilīns un streptomicīns no Gibco, Rockville, MD, ASV. Visas pārējās izmantotās ķīmiskās vielas bija AR kategorijas.

2.3. HPLC CDP kvantitatīva noteikšana. Lai identificētu un kvantitatīvi noteiktu CDP sastāvu, tika izmantots Agilent 1220 HPLC instruments. Hromatogrāfijas apstākļi bija šādi: C18 kolonna (TSK-GEL, 4 6 I d × 250 mm, 5 μm); gradienta eluēšana saturēja šķīdinātājus A (acetonitrils) un B (ūdens, kas satur 0,5 procentus etiķskābes) (0-10 min: 17-20 procenti A; 10-30 min: 20-25 procenti A; un 30-40 min: 25-30 procenti A); noteikšanas viļņa garums bija 333 nm; apkārtējās vides temperatūra; plūsmas ātrums bija 1,0 ml/min; parauga injekcijas tilpums bija 5 μL. Tika identificēti astoņi PhG savienojumi, proti, cistanīds F, ehinakozīds, 6′-acetilakteozīds, cistanīds C, cistanīds A, akteozīds, 2′-acetilakteozīds un izoakteozīds; izmantojot atbilstošās standartvielas un ārēju standarta metodi, iepriekšminēto 8 PhG saturu kvantitatīvi noteica ar HPLC analīzi (1. attēls).

2.4. Dzīvnieku eksperimentu protokols. Pavisam 60 pieaugušas Sprague-Dawley žurku mātītes, kuru vecums bija 3 mēneši, tika iegūtas no Ningsijas Medicīnas universitātes izmēģinājumu centra ar dzīvniekiem, kuru vidējais sākotnējais ķermeņa svars bija aptuveni 234 ± 25 g. Žurkas tika izmitinātas standarta specifiskā, patogēnu brīvā vidē, lai aklimatizētos 1 nedēļu. Pēc tam visas žurkas tika anestēzijas (hlorhidrāts, 100 mg/kg, ip) tikai vai fiktīva olnīcu izņemšana (SHAM), vai arī divas olnīcas tika izņemtas un pēc tam nejauši sadalītas 5 apakšgrupās: perorāli apstrādātas ar nesēju (0,5% CMC- Na) tika iestatīta kā modeļa grupa (OVX), estradiola valerāts (1 mg/kg/dienā) kā pozitīvā grupa (EV) un 60, 120 un 240 mg/kg/dienā CDP kā zems (CDPL), vidējas (CDPM) un augstas (CDPH) devu grupas. Visas žurkas tika ievadītas perorāli katru dienu, un tās ilga 3 mēnešus, devu pielāgojot ik pēc 2 nedēļām, kas bija atkarīga no visa ķermeņa svara izmaiņām. Eksperimenta ar dzīvniekiem pēdējā dienā 24-stundu urīns tika iegūts, izmantojot vielmaiņas būrus; serums tika savākts no anestēzētu žurku augšstilba artērijas; labais augšstilba kauls, stilba kauls un visi orgāni tika izgriezti un uzglabāti -80 ° C temperatūrā turpmākai analīzei. Mūsu veiktos eksperimentus ar dzīvniekiem apstiprināja Ningxia Medicīnas universitātes Institucionālā dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja.

2.5. Kaulu minerālu blīvuma noteikšana un mikro-CT analīze. Pirmkārt, lai novērtētu katras žurkas labā augšstilba kaula kopējo minerālo blīvumu, tika izmantota divu enerģiju rentgena absorbcijas aparāts (Lunar, ASV); otrkārt, tas pats augšstilba kauls tika izmantots, lai novērtētu trabekulārā kaula mikroarhitektūras 3D attēlu, izmantojot mikro-CT skenera aparātu (GE, Amerika). Izotropā izšķirtspēja tika iestatīta kā 14 μm, lai iegūtu ideālu 3D attēlu; interesējošais reģions (ROI) tika izvēlēts, katra parauga augšstilba kaula augšanas plāksnē iestatot vienādas koordinātas; un kaulu morfometriskos parametrus, tostarp trabekulāro atdalīšanu (Tb. Sp), trabekulāro skaitu (Tb. N), trabekulāro biezumu (Tb. Th), kaulu minerālvielu saturu (BMC), audu minerālo blīvumu (TMD) un audu minerālvielu saturu (TMC). ) tika iegūti, analizējot IA.

2.6. Seruma un urīna bioķīmiskā pārbaude. Seruma katepsīna K, TRAP, SOD un GSH aktivitātes, kā arī seruma PTH, kalcitonīna, ERR , MDA, BGP un urīna DPD saturs tika noteikts, izmantojot atbilstošus reaģentu komplektus saskaņā ar ražotāja norādījumiem un līmeni. sārmainās fosfatāzes (ALP) un seruma un urīna kalcija (Ca) un fosfora (P) saturs tika novērtēts, izmantojot automātisko iekārtu (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, ASV).

2.7. Western Blot analīze. Osteoklasti tika ierosināti, izmantojot RAW 264.7 šūnas, kurām pievienots makrofāgu koloniju stimulējošais faktors (MCSF) un RANKL. Īsumā, 1 × 107 RAW 264.7 šūnas tika kultivētas 6-iedobes plāksnē 30 ng/mL MCSF un 25 ng/ml RANKL klātbūtnē. Pēc 6 dienu indukcijas nobriedušās osteoklastu šūnas tika identificētas, izmantojot TRAP iekrāsoto metodi ar atbilstošo komplektu, pēc tam apstrādātas ar CDP (0,1, 0,01 un 0,001 mg/ml). attiecīgi) 24 stundas; pēc tam šūnas tika lizētas ar līzes buferi, kas satur 0, 5 mmol fenilmetilsulfonilfluorīda, proteāzes un fosfatāzes inhibitorus. Pēc tam lizāts tika atdalīts, izmantojot 10% SDS-PAGE, un pārnests uz PVDF membrānu, kas tika pārbaudīts ar AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3Kp85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos un -aktīnu (1). : 400) pēc bloķēšanas ar 5% beztauku pienu 2 stundas. Tās pašas membrānas tika noņemtas un vēlreiz pārbaudītas ar iepriekš minētajām 9 atbilstošajām antivielām, pēc tam tās beigās atklāja programmatūra Image Lab. Eksperimenti tika atkārtoti trīs reizes.

2.8. Statistiskā analīze. Visi in vivo un in vitro eksperimentos iegūtie dati, kas aprakstīti kā vidējais ± SD, tika analizēti, izmantojot vienvirziena ANOVA, kam sekoja Daneta tests (SPSS 22.0 programmatūra, SPSS, ASV); p < 0 05 bija statistiski nozīmīgs.

2.7. Western Blot analīze. Osteoklasti tika ierosināti, izmantojot RAW 264.7 šūnas, kurām pievienots makrofāgu koloniju stimulējošais faktors (MCSF) un RANKL. Īsumā, 1 × 107 RAW 264.7 šūnas tika kultivētas 6-iedobes plāksnē 30 ng/mL MCSF un 25 ng/ml RANKL klātbūtnē. Pēc 6 dienu indukcijas nobriedušās osteoklastu šūnas tika identificētas, izmantojot TRAP iekrāsoto metodi ar atbilstošo komplektu, pēc tam apstrādātas ar CDP (0,1, 0,01 un 0,001 mg/ml). attiecīgi) 24 stundas; pēc tam šūnas tika lizētas ar līzes buferi, kas satur 0, 5 mmol fenilmetilsulfonilfluorīda, proteāzes un fosfatāzes inhibitorus. Pēc tam lizāts tika atdalīts, izmantojot 10% SDS-PAGE, un pārnests uz PVDF membrānu, kas tika pārbaudīts ar AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3Kp85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos un -aktīnu (1). : 400) pēc bloķēšanas ar 5% beztauku pienu 2 stundas. Tās pašas membrānas tika noņemtas un vēlreiz pārbaudītas ar iepriekš minētajām 9 atbilstošajām antivielām, pēc tam tās beigās atklāja programmatūra Image Lab. Eksperimenti tika atkārtoti trīs reizes.

2.8. Statistiskā analīze. Visi in vivo un in vitro eksperimentos iegūtie dati, kas aprakstīti kā vidējais ± SD, tika analizēti, izmantojot vienvirziena ANOVA, kam sekoja Daneta tests (SPSS 22.0 programmatūra, SPSS, ASV); p < 0 05 bija statistiski nozīmīgs.

3. Rezultāti

3.1. CDP ķīmiskais sastāvs. Izmantojot HPLC metodi, šajā frakcijā tika atrasti astoņi feniletanoīdu glikozīdu savienojumi, kā parādīts 1. attēlā. Izmantojot standarta atsauces un ārēju standarta metodi, savienojumi un to saturs tika identificēti un kvantificēti šādi: (1) akteozīds F (3,6 procenti), (2) ehinakozīds (8,8 procenti), (3) cistanozīds A (5.{101} {11}} procenti), (4) akteozīds (13,3 procenti), (5) izoakteozīds (3,3 procenti), (6) akteozīds C (3,6 procenti), (7) 2′-acetilakteozīds (9,9 procenti) un (8) ) 6′-acetilakteozīds (3,2 procenti). Šo astoņu komponentu kopējais saturs tika noteikts kā 50,7 procenti.

3.2. CDP ietekme uz kaulu minerālu blīvumu un trabekulas mikroarhitektūru. Žurku kopējais kaulu minerālais blīvums dažādās apakšgrupās parādīts 2. attēlā. OVX modeļa grupas žurkām tika novērota kaulu minerālā blīvuma satura samazināšanās tendence, kas samazinājās par gandrīz 12.0 procentiem pēc plkst. 12 operācijas nedēļas, salīdzinot ar SHAM grupas žurkām (p < 0 001). Visām ar CDP ārstētajām žurkām kaulu minerālais blīvums ievērojami palielinājās attiecīgi par 11,2 procentiem, 12.{11}} procentiem un 10,7 procentiem (p < 0 01), salīdzinot ar OVX modeļu grupas žurkām. .

Turklāt saskaņā ar datiem par kopējo kaulu minerālo blīvumu, mikro-CT rekonstrukcija, kā arī augšstilba kaula histomorfometriskā noteikšana parādīja, ka OVX grupas žurkām bija acīmredzama trabekulārās arhitektūras pasliktināšanās, par ko liecina ievērojami samazināts trabekulu skaits un laukums. kā arī ievērojami palielināts Tb. Tātad, salīdzinot ar SHAM grupas žurkām. Ārstēšana ar CDP novērsa OVX izraisīto trabekulārās arhitektūras pasliktināšanos; kā parādīts 3. attēlā, BMC, TMC un Tb. N vērtības tika ievērojami palielinātas, un Tb laukums. Sp tika ievērojami samazināts, savukārt TMD un Tb vērtības. Šķita, ka OVX darbība un mūsu CDP iejaukšanās tos būtiski neietekmēja.

3.3. CDP ietekme uz urīna un seruma bioķīmiskajiem parametriem. Kā parādīts 4. attēlā, OVX modeļa grupas žurkām tika konstatētas nozīmīgas P līmeņa un seruma kalcitonīna satura samazināšanās tendences, kas bija gandrīz par 30 procentiem un 60 procentiem mazāk nekā SHAM žurkām (p < 0 001 ), savukārt starp OVX un SHAM grupām netika novērotas acīmredzamas Ca un seruma Ca koncentrācijas urīnā, kā arī P un seruma PTH līmeņa paaugstināšanās vai samazināšanās tendences. Ārstēšana ar CDP būtiski novērsa P un Ca zudumu serumā OVX žurkām, par ko liecina ievērojami paaugstināts P un Ca līmenis serumā (p < 0 05), salīdzinot ar OVX modeļa grupas žurkām. Turklāt, salīdzinot ar OVX modeļa grupu, tika novērotas paaugstinātas, bet nestatistiski nozīmīgas kalcitonīna tendences gan CDP zemo, gan lielo devu grupās.

3.4. CDP ietekme uz kaulu veidošanos un kaulu rezorbcijas marķieriem. CDP labvēlīgā ietekme uz kaulu veidošanās indeksu, kā arī inhibējošā ietekme uz kaulu rezorbcijas marķieriem ir aprakstīta 5. attēlā. Attiecībā uz kaulu veidošanās marķieriem seruma BGP līmeni gandrīz neietekmēja operācija ar olnīcu izņemšanu, par ko liecina nenozīmīgas izmaiņas, kas novērotas visās ārstētajās grupās, bet statistiski nozīmīgi seruma ALP uzlabojumi tika iegūti gan ar zemām (60 mg/kg), gan mērenām (120 mg/kg) CDP intervences grupu devām, salīdzinot ar žurkām. no SHAM grupas (p < 0 01). Attiecībā uz kaulu rezorbcijas indeksu seruma katepsīna K un DPD, kā arī TRAP līmenis OVX modeļu grupas žurkām bija ievērojami paaugstināts par attiecīgi aptuveni 75,0%, 41,4% un 21,0%, salīdzinot ar SHAM žurkām, un ārstējot ar CDP, īpaši ar zemo devu 60 mg/kg, katepsīna K un DPD, kā arī TRAP īpašības OVX modeļu grupā tika ievērojami inhibētas attiecīgi par 67,3 procentiem, 41,4 procentiem un 25,9 procentiem, salīdzinot ar žurkas OVX modeļu grupā.

3.5. CDP ietekme uz maksts un dzemdes, kā arī visa ķermeņa svaru. Nenozīmīgas atšķirības žurku sākotnējā veselā ķermeņa svarā pirms ārstēšanas tika novērotas sešās grupās (6. attēls). Tomēr operācija ar olnīcu izņemšanu izraisīja ievērojamu žurku galīgā ķermeņa svara palielināšanos OVX modeļu grupā, kas ir gandrīz par 360 procentiem, savukārt dzemdes un maksts mitrā masa krasi samazinājās par gandrīz 9{{6} }.0 procenti un 60,0 procenti attiecīgi, salīdzinot ar SHAM žurkām (p < 0 001). Lai gan ERR saturs neuzrādīja būtiskas atšķirības starp OVX un SHAM grupām, visas ārstēšanas grupas, ieskaitot CDP un EV, ievērojami palielināja ERR līmeni. Turklāt, ārstējot ar EV, iepriekš minētās OVX žurku ķermeņa masas palielināšanās, kā arī maksts un dzemdes svara zudums daļēji tika novērsts (p < 0 001), bet CDP iejaukšanās tos neietekmēja.

3.6. CDP ietekme uz seruma MDA, SOD un GSH līmeni. Starp SHAM un OVX modeļu grupām nebija statistiski nozīmīgas atšķirības seruma SOD un GSH īpašībās; kā aprakstīts 7. attēlā, starp iepriekšminētajām divām grupām var novērot GSH pieauguma tendenci. Turklāt OVX modeļa grupas žurkām, salīdzinot ar SHAM žurkām, seruma MDA līmenis tika strauji paaugstināts par gandrīz 50 procentiem. CDP apstrāde neietekmēja SOD aktivitāti, turpretim GSH īpašības būtiski uzlaboja CDP iejaukšanās, un CDP ievērojami samazināja MDA līmeni par 33,9 procentiem un 42,4 procentiem, lietojot devas attiecīgi 60 un 240 mg/kg ( p < 0 001).

3.7. CDP ietekme uz proteīna ekspresijas līmeņiem. Mūsu dati, kas parādīti 8. attēlā, liecināja, ka CDP ārstēšana ievērojami samazināja TRAF6, RANK un RANKL olbaltumvielu līmeni, salīdzinot ar kontroli. Pakārtotie signālu ceļi, tostarp NF-κB, tika nomākti, un PI3K / AKT stimulēja CDP iejaukšanās, par ko liecina NF-κB-p65 pazeminātas regulēšanas izpausme, savukārt PI3Kp85 un AKT1 tika regulēti. Līdz ar to NFAT2 ekspresija bija ievērojami samazināta, un cFos palielinājās pēc apstrādes ar CDP koncentrācijā 0.001-0,1 mg/ml. Ierosinātais mehānisms ir aprakstīts 9. attēlā, kur CDP pazemināja RANKL un RANK līmeņus, kā rezultātā samazinājās šī liganda saistīšanās daudzums ar tā receptoriem, un RANKL savienojums ar RANK tika vēl vairāk samazināts, samazinot TRAF6. kam sekoja pakārtoto ceļu nomākšana, ieskaitot NF-κB ceļu, turpretim tika stimulēts PI3K / AKT signāla ceļš, kas galu galā noveda pie NFAT2 ekspresijas samazināšanās un c-Fos līmeņa paaugstināšanās.

4. Diskusija

Feniletanoīda glikozīdi ir dabā sastopami ūdenī šķīstoši komponenti, kas plaši sastopami ārstniecības augu valstībā [11]. Līdz šim feniletanoīdu glikozīdu savienojumi bija piesaistījuši arvien vairāk pētnieku, jo tiem bija acīmredzama loma dažādu cilvēku slimību un anomāliju ārstēšanā [13]. No desmitiem dabisko ārstniecības augu tika identificētas un izolētas vairākas antiosteoporotiskas bioaktīvas frakcijas un savienojumi, tostarp polifenolu un feniletanoīdu glikozīdi [5, 10, 12, 16, 17]. C. deserticola ir labi pazīstama kā "tuksneša žeņšeņs", kas norāda uz šī ēdamā TCM drošības profilu [18, 19]. Kā vispārējs tonizējošais augs un dabīgs veselīgs ēdiens, ko jau sen izmanto Āzijas valstīs, C. deserticola uzrādīja labvēlīgu funkciju nieru darbības uzlabošanai.

Tika konstatēts, ka TCM, ko tradicionāli izmanto nieru esences uzmundrināšanai un uzturēšanai, parasti lieto osteoporozes ārstēšanai, gan in vitro, gan in vivo publicētie dati ir pierādījuši C. deserticola antiosteoporotisko aktivitāti [20–23], un feniletanoīdu glikozīdu sastāvdaļas, tostarp ehinakozīds un akteozīds, ir galvenie bioaktīvie komponenti, kas pastāv šajā ēdamajā ārstniecības augā; tas viss liecināja, ka ne tikai ehinakozīds un akteozīds, bet arī citi C. deserticola saturošie feniletanoīdu glikozīdu komponenti tika uzskatīti par atbildīgiem par šī auga antiosteoporotisko īpašību. Mūsu pašreizējā pētījumā tika izmantoti labvēlīgi droši makroporainie sveķi, lai izolētu un bagātinātu feniletanoīdu glikozīdu frakciju no C. deserticola, un, izmantojot HPLC metodi, astoņas galvenās feniletanoīda glikozīda sastāvdaļas, proti, akteozīds F, ehinakozīds, cistanīds A, akteozīds, Izoakteozīds, akteozīds C, 2′-acetilakteozīds un 6′-acetillakteozīds tika atrasti izolētajā feniletanoīda glikozīda frakcijā, un to saturs bija 3,6 procenti, 8,8 procenti, 5,0 procenti, 13,3 procenti, 3,3,3 procenti. un attiecīgi 3,2 procenti. Ir pierādīts, ka ehinakozīdam, vienam no galvenajiem C. deserticola reģistrētajiem savienojumiem [14], piemīt antiosteoporotiska iedarbība; tomēr 270 mg/kg deva bija tik liela, ka ierobežoja tās turpmāko klīnisko pielietojumu [24]. Pašreizējos eksperimentos OVX žurkām tika izmantota kopējā feniletanoīda glikozīda frakcija ar mazāku devu 60-240 mg/kg ķermeņa svara dienā, un identificēto sastāvdaļu saturs šajā frakcijā bija gandrīz 50% tīrs, izmantojot HPLC metode.

Bija labi zināms, ka OVX var izraisīt osteoporozi, un tika uzskatīts, ka OVX žurka ir klasisks un piemērots modelis cilvēka pēcmenopauzes osteoporozes modelēšanai. Tajā pašā laikā pēc ovariektomijas operācijas tika novērota ievērojama kaulu minerālā blīvuma, trabekulārā kaulu mikroarhitektūras, dzemdes un maksts mitrās masas un estrogēnu līmeņa samazināšanās, kā arī acīmredzama kaulu rezorbcijas un ķermeņa masas palielināšanās. daļa estrogēna zuduma dēļ [25]. Mūsu līdz šim iegūtie dati skaidri parādīja, ka OVX patiešām izraisīja pēcmenopauzes osteoporozi, un to vienmēr pavada strauja kaulu kvalitātes, kaulu mikroarhitektūras un dzemdes un maksts mitrā svara samazināšanās. Tā kā EV ir vispārējs hormonu aizstājējs, kas ir izmantots klīniskajā praksē, tas tika izmantots kā pozitīva kontrole mūsu in vivo eksperimentā, un tika konstatēts palielinātais ķermeņa svars un atrofētais dzemdes svars, kā arī kaulu minerālā blīvuma un trabekulārā kaula mikroarhitektūras pasliktināšanās. paredzams, ka to mainīs EV papildinājums.

Atšķirībā no pozitīvās kontroles, OVX modeļa grupas žurku samazināto maksts un dzemdes svaru, kā arī palielināto visa ķermeņa svaru CDP ārstēšana neietekmēja, kas nozīmēja, ka CDP varētu uzlabot kaulu veidošanos, neizraisot blakusparādības uz ķermeni un dzemdes organiskie audi. Lai gan CDP terapija ievērojami palielināja ERR līmeni, tas bija gluži kā fitoestrogēna efekts, jo netika novērotas blakusparādības uz dzemdes un maksts organiskajiem audiem. Turklāt CDP ārstēšana ievērojami uzlaboja kaulu kvalitāti OVX žurkām, kuras bija pasliktinājušās olnīcu izņemšanas operācijas dēļ.

Turklāt P un Ca līmeņi OVX žurku urīnā un serumā tika izmantoti arī, lai atspoguļotu antiosteoporotisko efektu, un Ca un neorganiskā P koncentrācija parasti bija atkarīga no kalcitonīna un PTH līmeņa [26]. Lai gan šajā pētījumā OVX modeļa grupas žurkām netika iegūtas būtiskas Ca, seruma P, seruma Ca un PTH izdalīšanās ar urīnu līmeņa pazemināšanās vai palielināšanās tendences, nozīmīgs P un kalcitonīna līmenis urīnā (p < { {1}}) tika novēroti. Saskaņā ar publicētajiem datiem, ka estrogēna deficīts, ko izraisīja olnīcu izņemšana, vienmēr izraisīja kalcitonīna līmeņa pazemināšanos asinīs, šis pazeminātais kalcitonīna līmenis serumā beidzot izraisīja paaugstinātu PTH līmeni, kur Ca tika uzskatīts par galveno PTH sekrēcijas regulatoru. Tā kā PTH koncentrācija šajā pētījumā neuzrādīja būtisku atšķirību starp OVX un SHAM grupām, Ca līmenis gan serumā, gan urīnā arī neuzrādīja acīmredzamas izmaiņas starp iepriekš minētajām divām grupām.

Tomēr tika iegūta ievērojami pazemināta tendence uz kalcitonīna līmeni starp OVX un SHAM grupām, un līdz ar to P saturs OVX urīnā tika ievērojami samazināts. Mēs uzskatījām, ka iepriekš minētie dati var izskaidrot pretrunīgo parādību, kāpēc Ca līmeņa izdalīšanās urīnā OVX žurkām neuzrādīja acīmredzamas izmaiņas salīdzinājumā ar SHAM žurkām, un šī parādība var būt saistīta arī ar palielinātu kaulu apmaiņas ātrumu [27] . Pēc ārstēšanas ar CDP P un Ca līmenis serumā tika ievērojami paaugstināts, un P saturs urīnā tika pazemināts OVX žurkām, kas atspoguļoja, ka CDP varēja ne tikai novērst kaulu minerālu elementu izdalīšanos, bet arī uzlabot šo dzīvnieku seruma saturu. elementi, tādējādi netieši nomācot kaulu zudumu.

Turklāt, lai izskaidrotu CDP pamatā esošos antiosteoporotiskos mehānismus, tika izmantoti arī kaulu veidošanās un rezorbcijas marķieri, kā arī antioksidantu enzīmi, tostarp SOD un GSH. Līdzīgi kā publicētajos datos, ALP līmenis OVX modeļa grupas žurkām uzrādīja nestatistiski nozīmīgu pieauguma tendenci, kas norāda uz paātrinātu kaulu apmaiņas ātrumu pēcmenopauzes osteoporozes gadījumā [10]. Tomēr pēc ārstēšanas ar CDP (60, 120 un 240 mg/kg/dienā) ALP īpašības tika ievērojami uzlabotas. Bija labi zināms, ka OVX izraisīja strauju estrogēna līmeņa pazemināšanos, kas parasti izraisa pārmērīgu kaulu rezorbciju un oksidatīvo stresu [28], par ko liecina TRAP, katepsīna K un DPD, kā arī MDA līmenis, kas ievērojami paaugstināts žurkām. OVX modeļu grupa.

Tomēr šos pasliktināšanos daļēji uzlaboja CDP iejaukšanās. Turklāt OVX žurku apstrāde ar CDP (60 un 240 mg/kg) uzrādīja ievērojamu GSH aktivitātes pieaugumu (p < 0 05). Iepriekš minētie rezultāti liecināja, ka CDP bija terapeitiska iedarbība uz OVX izraisītu osteoporozi, un šie efekti bija gan, uzlabojot kaulu veidošanos un nomācot kaulu rezorbciju, gan uzlabojot kaulu antioksidantu sistēmu.

RANK aktivizēšana ar tā ligandu RANKL stimulēja NFAT2 un c-Fos izpausmes, izmantojot PI3K/AKT un NF-κB signālu pārraidi [29]. Izrādījās, ka NF-κB ir būtisks osteoklastoģenēzē, jo NF-κB traucējumi var izraisīt osteoklastu diferenciācijas traucējumus ar osteoporotisku fenotipu, un NF-κB pārregulēja c-Fos un pazemināja NFAT2 ekspresijas RANKL / RANK / TRAF izraisītas osteoklastoģenēzes laikā. Lai novērtētu CDP labvēlīgo ietekmi uz NFAT2 un c-Fos mediēto osteoklastoģenēzi, tika analizēti RANKL un RANK ekspresijas līmeņi. Paredzams, ka CDP ievērojami inhibēja NFAT2 un stimulēja c-Fos līmeni, samazinot RANKL un RANK izpausmes.

Tikmēr pašam RANK trūka iekšējās kināzes īpašību, ja vien to nepievienoja TRAF6, lai aktivizētu pakārtoto signalizāciju [3]. CDP arī pazemināja TRAF6 ekspresiju, kā rezultātā ievērojami samazinājās RANKL un RANK saistīšanās daudzums. Hipotēzes CDP antiosteoporotiskais mehānisms OVX žurkām aptvēra iepriekš minētos signalizācijas ceļus, un regulatori ir aprakstīti 9. attēlā. Konspektīvi, CDP samazināja TRAF6, RANKL un RANK līmeni, tādējādi nomācot pakārtotos signalizācijas ceļus, tostarp PI3K/AKT un NF-κB, kas tiek iedarbinātas RANKL / RANK, un visbeidzot samazināja galveno osteoklastogēno proteīnu NFAT2 un c-Fos izpausmes un aktivitātes. Tāpēc vairākas datu norādes liecināja par CDP labvēlīgo ietekmi uz OVX žurku kaulu metabolismu, galvenokārt izmantojot RANKL/RANK/TRAF6-mediētos PI3K/AKT un NF-κB ceļus.

5. Secinājums

Rezumējot, kopējiem feniletanoīdu glikozīdiem, kas izolēti no C. deserticola, bija nozīmīga labvēlīga ietekme uz OVX žurku osteoporozi pēcmenopauzes periodā, un terapeitiskais potenciāls kaulu zuduma nomākšanā galvenokārt bija, stimulējot kaulu veidošanos un kavējot kaulu rezorbciju, kā arī uzlabojot kaulu antioksidantu. sistēma; mehānismi var būt saistīti ar RANKL/RANK/TRAF{0}}inducētu NF-κB aktivāciju un PI3K/AKT inaktivāciju, kā arī c-Fos stimulāciju un NFAT2 nomākšanu, un, visbeidzot, tika kavēta osteoklastu diferenciācija.

Saīsinājumi

AKT: proteīna kināze B

ALP: sārmaina fosfatāze

BGP: Kaulu gla-proteīns

BMC: kaulu minerālvielu saturs

CDP: C. deserticola feniletanoīda glikozīda frakcija

CK: katepsīns K

CT: kalcitonīns

DPD: dezoksipiridinolīns

ERR: ar estrogēnu saistīts alfa receptors

EV: Estradiola valerāts

GSH: Glutations

l-PTH: neskarts parathormons

MCSF: makrofāgu koloniju stimulējošais faktors

MDA: Malondialdehīds

NFAT2: aktivēto T šūnu kodolfaktors c2

NF-κB: kodolfaktors kappa B

OPG: Osteoprotegerīns

OVX: olnīcu izņemšana

PhGs: feniletanoīdu glikozīdi

PI3K: fosfoinositīda 3-kināze

RANK: kodolfaktora kappa B receptoru aktivators

RANKL: kodolfaktora kappa B liganda receptoru aktivators

ROI: interesējošais reģions

SOD: superoksīda dismutāze

Tb. N: Trabekulārais numurs

Tb.Sp: Trabekulāra atdalīšana

Tb.Th: Trabekulārais biezums

TCM: tradicionālā ķīniešu medicīna

TMC: audu minerālvielu saturs

TMD: audu minerālais blīvums

TNF: audzēja nekrozes faktors

TRAF6: ar audzēja nekrozes faktora receptoriem saistītais 6. faktors

TRAP: pret tartrātiem izturīga skābā fosfatāze.

Datu pieejamība

Dati, kas izmantoti, lai pamatotu šī pētījuma secinājumus, pēc pieprasījuma ir pieejami no attiecīgā autora.

Interešu konflikti

Autoriem nebija interešu konflikta.

Autoru ieguldījumi

XM izstrādāja un uzraudzīja eksperimentus; SD un LY veica lielāko daļu eksperimentu un izstrādāja manuskriptu; BZ un JL veica Western blot analīzi un piedalījās eksperimentos ar dzīvniekiem; YD analizēja datus; QT un PY pārskatīja manuskriptu. Visi autori pārskatīja manuskriptu. Linglings Jangs un Šukjins Dings līdzvērtīgi ieguldīja manuskripta tapšanā.

Pateicības

Šo darbu atbalstīja Ningsijas Augstākās izglītības Zinātnes tehnoloģiju fonda (NGY2017090), Ķīnas Nacionālā dabaszinātņu fonda (Nr. 81560684), Ningsijas Galvenās pētniecības un attīstības programmas (2018BHF2001), Ningxia Galvenās pētniecības un Austrumu un Rietumu zinātnes un tehnoloģiju sadarbības izgudrojumu programma (nr. 2017BY084 un 2017BY079) un Ķīnas Zinātņu akadēmijas West Light fonds — Rietumu jaunie zinātnieki 2017.

Atsauces

[1] LJ Melton III, EA Christchilles, C. Cooper, AW Lane un BL Riggs, "Perspektīva. Cik sievietēm ir osteoporoze?", Kaulu un minerālu pētījumu žurnāls, sēj. 7, Nr. 9, 1005.–1010. lpp., 1992. gads.

[2] S. Schnell, SM Friedman, DA Mendelson, KW Bingham un SL Kates, "Gūžas kaula lūzumu programmā veciem cilvēkiem ārstēto pacientu mirstība gadā 1-", Geriatric Orthopedic Surgery & Rehabilitation, sēj. 1, nē. 1, 2010. gada 6.–14.

[3] EM Tan, L. Li, IR Indran, N. Chew un EL Yong, "TRAF6 mediē osteoklastoģenēzes nomākšanu un ovariektomijas izraisīta kaulu zuduma novēršanu ar jaunu prenilflavonoīdu", Kaulu un minerālu pētījumu žurnāls, sēj. 32, Nr. 4, 846.–860, 2017. lpp.

[4] JH Kim un N. Kim, "NFATc1 regulēšana osteoklastu diferenciācijā", Journal of Bone Metabolism, sēj. 21, Nr. 4, 233.–241. lpp., 2014. gads.

[5] Q. Ye, XQ Ma, CL Hu et al., "Antiosteoporotic activity and constituents of Podocarpium podocarpus", Phytomedicine, sēj. 22, Nr. 1, 2015. gada 94.–102. lpp.

[6] SA Jang, HS Song, JE Kwon, et al., "Protokatehuīnskābe vājina trabekulāro kaulu zudumu pelēm, kurām veikta ovariektomija", Oxidative Medicine and Cellular Longevity, sēj. 2018, raksta ID 7280342, 11 lpp., 2018. gads.

[7] AB Abdel-Naim, AA Alghamdi, MM Algandaby, et al., "Rutīns, kas izolēts no Chrozophora tinctoria, uzlabo kaulu šūnu proliferāciju un pārkaulošanās marķierus", Oxidative Medicine and Cellular Longevity, sēj. 2018, raksta ID 5106469, 10 lpp., 2018. gads.

[8] J. Wattanathorn, C. Thipkaew, W. Thukham-mee, S. Muchimapura, P. Wannanon un T. Tong-un, "Morinda citrifolia L. lapu ekstrakts aizsargā pret smadzeņu išēmiju un osteoporozi in vivo eksperimentā. menopauzes modelis," Oksidatīvā medicīna un šūnu ilgmūžība, sēj. 2018, raksta ID 1039364, 13 lpp., 2018. gads.

[9] S. Sungkamanee, J. Wattanathorn, S. Muchimapura un W. Thukham-mee, "Antiosteoporotic Effect of a Combined Extract of Morus alba and Polygonum odoratum", Oxidative Medicine and Cellular Longevity, sēj. 2014, raksta ID 579305, 9 lpp., 2014. gads.

[10] J. Liu, Z. Zhang, Q. Guo, Y. Dong, Q. Zhao un X. Ma, "Syringin novērš kaulu zudumu pelēm, kurām veikta olnīcu izņemšana, izmantojot TRAF6 mediētu NF-κB inhibīciju un PI3K/AKT stimulāciju. "Fitomedicīna, sēj. 42, 43.–50. lpp., 2018. gads.

[11] CW Lu, SK Huang, TY Lin un SJ Wang, "Echinacoside, aktīvā Herba Cistanche sastāvdaļa, nomāc epileptiformu aktivitāti hipokampu CA3 piramīdas neironos", The Korean Journal of Physiology & Pharmacology, sēj. 22, Nr. 3, 249.–255. lpp., 2018. gads.

[12] X. Xu, Z. Zhang, W. Wang, H. Yao un X. Ma, "Cistanozīda A terapeitiskā iedarbība uz ovariektomizētu peļu kaulu metabolismu", Molecules, vol. 22, Nr. 2. lpp. 197, 2017.

[13] K. Alipieva, L. Korkina, IE Orhan, un MI Georgiev, "Verbascoside–a review of its rašanās, (bio)sintēze un farmakoloģiskā nozīme", Biotechnology Advances, sēj. 32, Nr. 6, 1065.–1076. lpp., 2014. gads.

[14] Ķīnas farmakopejas redakcijas komiteja, Ķīnas Tautas Republikas farmakopeja, Ķīnas medicīnas zinātnes un tehnoloģiju izdevums, Pekina, Ķīna, 10. izdevums, 2015. gads.

[15] H. Zhang, WW Xing, YS Li et al., "Tradicionāla ķīniešu augu izcelsmes preparāta ietekme uz osteoblastiem un osteoklastiem", Maturitas, sēj. 61, Nr. 4, 334.–339. lpp., 2008. gads.

[16] X. Ma, J. Liu, L. Yang, B. Zhang, Y. Dong un Q. Zhao: "Cynomorium solārijs novērš kaulu rezorbciju žurkām, kurām veikta olnīcu izņemšana, izmantojot RANKL/RANK/TRAF6 mediētu PI3K/AKT un NF-κB ceļi," Life Sciences, sēj. 209, 140.–148. lpp., 2018. gads.

[17] XQ Ma, T. Han, X. Zhang u.c., "Kaempferitrīns novērš kaulu zudumu žurkām ar ovariektomiju", Phytomedicine, sēj. 22, Nr. 13, 1159.–1162. lpp., 2015. gads.

[18] PL Liao, CH Li, LS Tse, JJ Kang un YW ​​Cheng, "Cistanche tubulosa veselīgas pārtikas produkta Memoregain® drošības novērtējums: genotoksicitāte un 28-dienas atkārtotas devas toksicitātes tests", Food and Chemical Toxicology , sēj. 118, 581.–588. lpp., 2018. gads.

[19] CC Wong, HB Li, KW Cheng un F. Chen, "Sistēmisks pētījums par antioksidantu aktivitāti 30 ķīniešu ārstniecības augos, izmantojot dzelzs reducējošo antioksidantu jaudas testu", Food Chemistry, sēj. 97, Nr. 4, 705.–711. lpp., 2006. gads.

[20] D. Song, Z. Cao, Z. Liu et al., "Cistanche deserticola polisaharīds vājina osteoklastoģenēzi un kaulu rezorbciju, inhibējot RANKL signalizāciju un reaktīvo skābekļa sugu veidošanos", Journal of Cellular Physiology, sēj. 233, Nr. 12, 9674.–9684. lpp., 2018. gads.

[21] HD Liang, F. Yu, ZH Tong, HQ Zhang un W. Liang, "Cistanches Herba ūdens ekstrakts, kas ietekmē seruma BGP un TRAP un kaulu smadzeņu Smad1 mRNS, Smad5 mRNS, TGF- 1 mRNS un TIEG1 mRNS ekspresijas līmeņi osteoporozes slimībā," Molecular Biology Reports, sēj. 40, Nr. 2, 757.–763. lpp., 2013. gads.

[22] TM Li, HC Huang, CM Su et al., "Cistanche deserticola ekstrakts palielina kaulu veidošanos osteoblastos", Journal of Pharmacy and Pharmacology, sēj. 64, Nr. 6, 897.–907. lpp., 2012. gads.

[23] H. Liang, F. Yu, Z. Tong un Z. Huang, "Cistanches Herba ūdens ekstrakta ietekme uz kaulu zudumu žurkām ar ovariektomiju", International Journal of Molecular Sciences, sēj. 12, Nr. 8, 5060.–5069. lpp., 2011. gads.

[24] F. Li, X. Yang, Y. Yang et al., "Antiosteoporotic activity of echinacoside in ovariectomized rats", Phytomedicine, sēj. 20, Nr. 6, 549.–557. lpp., 2013. gads.

[25] H. Nian, MH Ma, SS Nian un LL Xu, "Antiosteoporotic activity of Icariin in ovariectomized rats", Phytomedicine, sēj. 16, Nr. 4, 320.–326. lpp., 2009. gads.

[26] SR Fahmy, AM Soliman, AA Sayed un M. Marzouk, "Iespējamais Cicer arietinum ekstrakta antiosteoporotiskais mehānisms žurkām, kam veikta ovariektomija", International Journal of Clinical and Experimental Pathology, sēj. 8, Nr. 4, 3477–3490, 2015. lpp.

[27] R. Swaminathan, "Kaulu apgrozījuma bioķīmiskie marķieri", Clinica Chimica Acta, sēj. 313, Nr. 1-2, 95.–105. lpp., 2001. gads.

[28] S. Muthusami, I. Ramachandran, B. Muthusamy, et al., "Ovariektomija inducē oksidatīvo stresu un pasliktina kaulu antioksidantu sistēmu pieaugušām žurkām", Clinica Chimica Acta, sēj. 360, Nr. 1-2, 81.–86. lpp., 2005. gads.

[29] WJ Boyle, WS Simonet un DL Lacey, "Osteoclast diferenciācija un aktivācija", Nature, sēj. 423, Nr. 6937, 337.–342. lpp., 2003. gads.

For more information:1950477648nn@gmail.com