No Cistanche Deserticola izolētas kopējās feniletanoīda glikozīda frakcijas labvēlīgā ietekme uz kaulu mikrostruktūru žurkām, kurām ir izņemtas olnīcas Ⅰ

Šis pētījums tika izstrādāts, lai novērtētu kopējās feniletanoīdu glikozīdu frakcijas antiosteoporotisko aktivitāti, kas izolēta noC. deserticola(CDP) žurkām, ko izraisīja ovariektomija (OVX), kā arī ar to saistītie mehānismi. Pēc 3 mēnešu perorālas lietošanas,samazināts kaulu minerālais blīvums, seruma Ca un P OVX žurkām tika atgūti un trabekulārais stāvoklis pasliktinājāskaulu mikroarhitektūradaļēji uzlabojās CDP (60, 120 un 240 mg/kg) iejaukšanās, tika pazeminātas kaulu rezorbcijas marķieru aktivitātes un paaugstināts kaulu veidošanās indeksa bioaktīvais līmenis; tikmēr MDA saturs tika samazināts, un GSH palielinājās ar CDP ārstēšanu. Sastāvā tika identificēti 8 feniletanoīdu glikozīdu savienojumified in CDP, ar kopējo saturu quantified kā 50,3%, izmantojot HPLC metodi. Mehāniski CDP samazināja TRAF6, RANKL un RANK līmeni, tādējādi nomācot RANKL/RANK/TRAF6-inducēto pakārtotās NF-aktivāciju.κB un PI3K / AKT signalizācijas ceļi un galu galā novērš NFAT2 un c-Fos galveno osteoklastogēno proteīnu aktivitātes. Visi iepriekš minētie dati liecināja, ka CDP bija ieguvumsfiCial EFfietekme uz kaulu mikrostruktūru žurkām ar olnīcu izņemšanu, un šīs eFfects var būt saistītas ar NF-κB un PI3K/AKT signalizācijas ceļi, kurus izraisīja RANKL, RANK un TRAF6 saistīšanās.

DABĪGA ORGANISKĀ CISTANČE KAULU AUGŠANAI

1. Ievads

Pēcmenopauzes osteoporoze, kurā cieš 1 no 3 sievietēm, kas vecākas par 50 gadiem, kļūst par galveno veselības apdraudējumu, kas skar vairāk nekā 200 miljonus sieviešu visā pasaulē [1]. Menopauzes laikā strauja estrogēna līmeņa pazemināšanās parasti izraisa pārmērīgu kaulu rezorbciju, ko izraisa pastiprināta osteoklastoģenēze; tad līdzsvars starp osteoblastu un osteoklastu izraisītu kaulu veidošanoskaulu rezorbcijatiek traucēta, un paātrinātā kaulu rezorbcija beidzot izraisīja osteoporozi un pat gūžas vai mugurkaula lūzumus [2]. Tika uzskatīts, ka osteoklastu diferenciācija tika aktivizēta, kad kodolfaktora kappa B (RANK) receptoru aktivators saistījās ar RANKL, RANK ligandu. Tomēr RANK un RANKL kombināciju nevar aktivizēt, ja tajā nav pievienots proteīna audzēja nekrozes faktora receptoru saistītais faktors 6 (TRAF6) [3], kam seko pakārtoto signalizācijas ceļu, tostarp PI3K/AKT un NF-κB, stimulēšana. . Visbeidzot, tika regulētas aktivēto T šūnu c2 (NFAT2) un c-Fos kodolfaktora ekspresijas [4], lai modulētu osteoklastu diferenciāciju, kā arī kaulu rezorbciju. Tādējādi tika uzskatīts, ka faktori un regulatori, kas ir tieši vai netieši saistīti ar osteoklastu aktivāciju un diferenciāciju, ir būtiski mērķi kaulu zuduma novēršanai.

Patiešām, ir dažas klīniskas un sintētiskas hormonu aizstājterapijas zāles, piemēram, estradiola valerāts, kas ir efektīvas pēcmenopauzes osteoporozes ārstēšanā. Diemžēl daži no tiem palielināja nopietnu vēža, tostarp krūts un endometrija vēža, risku [5], kas ierobežoja to klīnisko pielietojumu. Tāpēc ir nepieciešams izvēlēties citas alternatīvas ar efektivitāti un minimālām blakusparādībām. Tradicionālās ķīniešu zāles (TCM), kā arī izolētie bioaktīvie savienojumi un frakcijas [6–9] ir izrādījušies efektīvi pret dažādām slimībām, tostarp pēcmenopauzes osteoporozi. Šo bioaktīvo komponentu un frakciju vidū feniletanoīdu glikozīdu (PhG) savienojumi ar potenciālu efektivitāti tika uzskatīti par daudzsološiem līdzekļiem osteoporozes ārstēšanā [10–12]. PhG struktūras sastāv no kanēļskābes aglikona, hidroksilfeniletilgrupas, kas ir savienota ar glikopiranozi, apiozi, galaktozi, ramnozi vai ksilozi, izmantojot glikozīdu saiti. Tie plaši sastopami Cistanche ģints zāļu sugās [13]. Cistanche deserticola YC Ma ir oficiāls TCM, kas ir reģistrēts Ķīnas farmakopejā, un C deserticola ir ne tikai svarīgs TCM [14], bet arī pretnovecošanās tonizējošs augs ar dažām blakusparādībām, kas ir izstrādāts ārstniecības dzērienā un uztura šķidrumā, ko apstiprinājusi Valsts Pārtikas un zāļu pārvalde. Pamatojoties uz Ķīnas farmakopejas ierakstu, vietējie iedzīvotāji tradicionāli izmantoja C. deserticola, lai risinātu nieru esences deficīta problēmas, piemēram, muskuļu vājumu un jostasvietas vājumu, un feniletanoīdu glikozīdu savienojumi, tostarp ehinakozīds un acetonīds, ir šī auga galvenās bioaktīvās sastāvdaļas. Saskaņā ar TCM teoriju par "nieres pārvalda kaulu", kaulu sistēmu pārvalda nieru esence [15], un ar kauliem saistītas problēmas, piemēram, osteoporozi, var novērst, izmantojot ārstniecības augus vai savienojumus, kas baro nieru esenci. Tāpēc mēs izvirzījām hipotēzi, ka no C. deserticola izolētā kopējā feniletanoīda glikozīdu frakcija vismaz daļēji bija labvēlīga osteoporozes ārstēšanā. Tāpēc pašreizējais eksperiments tika izstrādāts, lai apstiprinātu mūsu hipotēzi, izmantojot ovariektomizētu (OVX) žurku modeli; papildus kaulu rezorbcijas un veidošanās marķieriem, kas jānovērtē, antioksidācijas indekss, kā arī RANKL/RANK/TRAF6- inducētie PI3K/AKT un NF-κB signālu ceļi tika izmantoti arī, lai izpētītu galvenos antiosteoporotiskās bioaktivitātes mehānismus. .

2. Materiāli un metode

2.1. Augu materiāli un sagatavošana.

Kopā 2015. septembrī no Yongning apgabala tika savākti 30 kg Cistanche deserticola YC Ma stublāji ar koordinātām 106.026597 un 38.262816, Ningxia province, Ķīna. Šo augu identificēja Dr. Lin Dongs (Ningsijas Medicīnas universitātes Farmakognozijas katedra), un atbilstošais paraugs (#20150901) tika saglabāts departamentā. farmaceitiskā analīze. Vispirms tika ekstrahēti 30,0 kg pulverveida C. deserticola, izmantojot atteces metodi ar 70% etanolu kā šķīdinātāju; materiāla attiecība pret šķīdinātāju tika iestatīta kā 1:10, un atteces laiks bija 2 stundas 3 reizes. Pēc tam visi filtrāti tika apvienoti un kondensēti pazeminātā spiedienā 60°C. Otrkārt, iepriekšējai atdalīšanai tika izmantotas AB-8 makroporaino sveķu kolonnas un dažādas etanola attiecības ūdenī (0%, 20%, Eluēšanai tika izmantoti 30%, 40%, 50% un 60%, katrs 60 l). Treškārt, 40% un 50% eluenti tika apvienoti un tālāk attīrīti, izmantojot atkārtotas AB-8 makroporaino sveķu kolonnas ar eluentiem 0%, 20%, 30%, 40% un 50% etanola ūdenī, un katrs eluents bija 12 l. Visbeidzot, 40% frakcija tika savākta un kondensēta pazeminātā spiedienā, lai iegūtu 150 g gaiši dzeltenas C. deserticola feniletanoīda glikozīda frakcijas (CDP, iznākums bija 0,5%). In vivo eksperimentiem CDP izšķīdināšanai izmantoja 0,5% CMC-Na šķīdinātāju; perorāla ievadīšana dzīvniekiem tika iestatīta kā 1 ml/100 g ķermeņa svara; in vitro Western blot analīzei CDP tika izšķīdināts ar DMSO un pēc tam atšķaidīts ar DMEM, lai iegūtu galīgās koncentrācijas 0, 1 mg / ml, 0, 01 mg / ml un 0, 001 mg / ml.

2.2. Ķīmiskās vielas un šķīdinātāji.

Estradiola valerāts (EV) bija no Delpharm Lille SAS, Francija; sārmainā fosfatāze (ALP),kaulu gla-proteīns(BGP), tartrāta rezistenta skābes fosfatāzes (TRAP) un deoksipiridinolīna (DPD) šķērssaites ELISA komplekti no Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Šanhaja, Ķīna, 201605; malondialdehīda (MDA, 20181221), superoksīda dismutāzes (SOD, 20121218) un glutationa (GSH, 20181221) reaģentu komplekti no Nanjing Jiancheng Bioloģiskās inženierijas institūta, Nanjing, Ķīna; lntact parathormona (l-PTH, NEWASHE7UZ), kalcitonīna (2L9ISN7AIU) un ar estrogēnu saistīto alfa receptoru (ERR, Y3AY8QEWB3) šķērssaites ELISA komplekti no Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Vuhana, Ķīna; katepsīna K ELISA reaģenta komplekts no BioVision, Amerika, 1l300141; primārās antivielas pret RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κBp65 (AH04138226), PI3 alfakināzi (p26AC8) AKT 1 (AF05173234), -aktīns (17AV0411) un sekundārās antivielas no mārrutku peroksidāzes konjugētā kazas anti-trušu IgG no ZSGB-BIO, Ķīna, 136080; kopējā BCA proteīna testa komplekts un komerciālais komplekts kaulu oklastu veidošanās un liellopu augļa seruma noteikšanai un Dulbecco modificētā Ērgļa barotne (DMEM) no HyClone, Logan, UT, ASV; polivinilidēnfluorīda (PVDF) membrāna no Millipore Life Sciences, Billerica, MA, ASV; penicilīns un streptomicīns no Gibco, Rockville, MD, ASV. Visas pārējās izmantotās ķīmiskās vielas bija AR kategorijas.

2.3. HPLC CDP kvantitatīva noteikšana.

CDP sastāva noteikšanai un kvantitatīvai noteikšanai tika izmantots Agilent 1220 HPLC instruments. Hromatogrāfijas apstākļi bija šādi: C18 kolonna (TSK-GEL, 4 6 I d × 250 mm, 5 μm); gradienta eluēšana saturēja šķīdinātājus A (acetonitrils) un B (ūdens, kas satur 0,5% etiķskābes) (0-10 min: 17-20% A; 10-30 min: 20-25% A; un 30-40 min: 25-30% A); noteikšanas viļņa garums bija 333 nm; apkārtējās vides temperatūra; plūsmas ātrums bija 1,0 ml/min; parauga injekcijas tilpums bija 5 μL. Tika identificēti astoņi PhG savienojumi, proti, cistanīds F, ehinakozīds, 6′-acetilakteozīds, cistanīds C, cistanīds A, akteozīds, 2′-acetilakteozīds un izoakteozīds; izmantojot atbilstošās standartvielas un ārēju standarta metodi, iepriekšminēto 8 PhG saturu kvantitatīvi noteica ar HPLC analīzi (1. attēls).

1. attēls: CDP HPLC pirkstu nospiedums. Šajā frakcijā tika atrasti astoņi feniletanoīdu glikozīdu savienojumi, un kopējais saturs tika noteikts kā 50,7%. Savienojumi un to saturs bija šādi: (1) akteozīds F (3,6%), (2) ehinakozīds (8,8%), (3) cistanozīds A (5,0%), (4) akteozīds (13,3%), (5) izoakteozīds (3,3 %), (6) akteozīds C (3,6 %), (7) 2′-acetilakteozīds (9,9 %) un (8) 6′-acetilakteozīds (3,2 %).

2.4. Dzīvnieku eksperimentu protokols.

Pavisam 6 0 pieaugušas Sprague-Dawley žurku mātītes, kuru vecums bija 3 mēneši, tika iegūtas no Ningsijas Medicīnas universitātes izmēģinājumu centra ar dzīvniekiem, kuru vidējais sākotnējais ķermeņa svars bija aptuveni 234 ± 25 g. Žurkas tika izmitinātas standarta specifiskā, patogēnu brīvā vidē, kas bija paredzēta aklimatizācijai 1 nedēļu. Pēc tam visas žurkas tika anestēzijas (hlorhidrāts, 100 mg/kg, ip) tikai vai fiktīva olnīcu izņemšana (SHAM), vai arī divas olnīcas tika izņemtas un pēc tam nejauši sadalītas 5 apakšgrupās: perorāli apstrādātas ar nesēju (0,5% CMC- Na) tika noteikta kā modeļa grupa (OVX), estradiola valerāts (1 mg/kg/dienā) kā pozitīvā grupa (EV) un 60, 120 un 240 mg/kg/dienā CDP kā zems (CDPL), vidējas (CDPM) un augstas (CDPH) devu grupas. Visas žurkas tika ievadītas perorāli katru dienu, un tās ilga 3 mēnešus, devu pielāgojot ik pēc 2 nedēļām, kas bija atkarīga no visa ķermeņa svara izmaiņām. Eksperimenta ar dzīvniekiem pēdējā dienā 24-stundu urīns tika iegūts, izmantojot vielmaiņas būrus; serums tika savākts no anestēzijas veidā tizētu žurku augšstilba artērijas; labais augšstilba kauls, stilba kauls un visi orgāni tika izgriezti un uzglabāti -80 ° C temperatūrā turpmākai analīzei. Mūsu veiktos eksperimentus ar dzīvniekiem apstiprināja Ningsijas Medicīnas universitātes Institucionālā dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja.

2.5. Kaulu minerālu blīvuma noteikšana un mikro-CT analīze.

Pirmkārt, lai novērtētu katras žurkas labā augšstilba kaula kopējo minerālo blīvumu, tika izmantota divu enerģiju rentgena absorbcijas aparāts (Lunar, ASV); otrkārt, tas pats augšstilba kauls tika izmantots, lai novērtētu trabekulārā kaula mikroarhitektūras 3D attēlu, izmantojot mikro-CT skenera aparātu (GE, Amerika). Izotropā izšķirtspēja tika iestatīta kā 14 μm, lai iegūtu ideālu 3D attēlu; interesējošais reģions (ROI) tika izvēlēts, katra parauga augšstilba kaula augšanas plāksnē iestatot vienādas koordinātas; un kaulu morfometriskie parametri, tostarp trabekulārā atdalīšana (Tb.Sp), trabekulārais skaitlis (Tb.N), trabekulārais biezums (Tb. Th), kaulu minerālvielu saturs (BMC), audu minerālvielu blīvums (TMD) un audu minerālvielu saturs (TMC). ) tika iegūti, analizējot IA.

2.6. Seruma un urīna bioķīmiskā pārbaude.

Seruma katepsīna K, TRAP, SOD un GSH aktivitātes, kā arī seruma PTH, kalcitonīna, ERR , MDA, BGP un urīna DPD saturs tika noteikts, izmantojot atbilstošus reaģentu komplektus saskaņā ar ražotāja norādījumiem un Sārmainās fosfatāzes (ALP) līmenis un kalcija (Ca) un fosfora (P) saturs serumā un urīnā tika novērtēts, izmantojot automātisko iekārtu (Ciba-Corning 550 Diag nostics Corp., Oberlin, OH, ASV).

2.7. Western Blot analīze.

Osteoklasti tika ierosināti, izmantojot RAW 264.7 šūnas, kurām pievienots makrofāgu koloniju stimulējošais faktors (MCSF) un RANKL. Īsumā, 1 × 107 RAW 264.7 šūnas tika kultivētas 6-iedobes plāksnē 30 ng/mL MCSF un 25 ng/ml RANKL klātbūtnē. Pēc 6 dienu indukcijas nobriedušās osteoklastu šūnas tika identificētas, izmantojot TRAP iekrāsoto metodi ar atbilstošo komplektu, pēc tam apstrādātas ar CDP (0,1, 0,01 un 0,001 mg/ml). attiecīgi) 24 stundas; pēc tam šūnas tika lizētas ar līzes buferi, kas satur 0,5 mmol fenilmetilsulfonilfluorīda, proteāzes un fosfatāzes inhibitorus. Pēc tam lizāts tika atdalīts, izmantojot 10% SDS-PAGE, un pārnests uz PVDF membrānu, kas tika pārbaudīts ar AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3K p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos un -aktīnu ( 1:400) pēc bloķēšanas ar 5% beztauku pienu 2 stundas. Tās pašas membrānas tika noņemtas un vēlreiz pārbaudītas ar iepriekš minētajām 9 atbilstošajām antivielām, pēc tam tās beigās atklāja programmatūra Image Lab. Eksperimenti tika atkārtoti trīs reizes.

2.8. Statistiskā analīze.

Visi in vivo un in vitro eksperimentos iegūtie dati, kas aprakstīti kā vidējais ± SD, tika analizēti, izmantojot vienvirziena ANOVA, kam sekoja Daneta tests (SPSS 22.0 programmatūra, SPSS, ASV); p < 0 05 bija statistiski nozīmīgs.

Wecistanche atbalsta dienests

E-pasts:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel.:+86 15292862950

Iegādājieties sīkāku informāciju par specifikācijām:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-veikals