No Cistanche Deserticola izolētas kopējās feniletanoīda glikozīda frakcijas labvēlīgā ietekme uz kaulu mikrostruktūru žurkām, kurām veikta olnīcu izņemšana

1. Ievads

Pēcmenopauzes osteoporoze, ar kuru cieš 1 no 3 sievietēm, kas vecākas par 50 gadiem, kļūst par galveno veselības apdraudējumu, kas skar vairāk nekā 200 miljonus sieviešu visā pasaulē [1]. Menopauzes laikā strauja estrogēna līmeņa pazemināšanās parasti izraisa pārmērīgu kaulu rezorbciju, ko izraisa pastiprināta osteoklastoģenēze; tad tiek izjaukts līdzsvars starp osteoblastu izraisītu kaulu veidošanos un osteoklastu izraisītu kaulu rezorbciju, unkaulu rezorbcijabeidzot izraisīja osteoporozi un pat gūžas vai mugurkaula lūzumu [2]. Tika uzskatīts, ka osteoklastu diferenciācija tika aktivizēta, kad kodolfaktora kappa B (RANK) receptoru aktivators saistījās ar RANKL, RANK ligandu. Tomēr RANK un RANKL kombināciju nevar aktivizēt, ja tajā nav pievienots ar proteīnu audzēja nekrozes faktora receptoriem saistītais faktors 6 (TRAF6) [3], kam seko pakārtoto signalizācijas ceļu, tostarp PI3K/AKT un NF-κB, stimulēšana. Visbeidzot, tika regulētas aktivēto T šūnu c2 (NFAT2) un c-Fos kodolfaktora ekspresijas [4], lai modulētu osteoklastu diferenciāciju, kā arī kaulu rezorbciju. Tādējādi tika uzskatīts, ka faktori un regulatori, kas ir tieši vai netieši saistīti ar osteoklastu aktivāciju un diferenciāciju, ir būtiski mērķi kaulu zuduma novēršanai. Patiešām, ir dažas klīniskas un sintētiskas hormonu aizstājterapijas zāles, piemēram, estradiola valerāts, kas ir efektīvas pēcmenopauzes osteoporozes ārstēšanā. Diemžēl daži no tiem palielināja nopietnu vēža, tostarp krūts un endometrija vēža, risku [5], kas ierobežoja to klīnisko pielietojumu. Tāpēc ir nepieciešams izvēlēties citas alternatīvas ar efektivitāti un minimālām blakusparādībām. Tradicionālās ķīniešu zāles (TCM), kā arī izolētie bioaktīvie savienojumi un frakcijas [6–9] ir izrādījušies efektīvi pret dažādām slimībām, tostarp pēcmenopauzes osteoporozi. Šo bioaktīvo komponentu un frakciju vidū feniletanoīdu glikozīdu (PhG) savienojumi ar potenciālu efektivitāti tika uzskatīti par daudzsološiem līdzekļiem osteoporozes ārstēšanā [10–12]. PhG struktūras sastāv no kanēļskābes aglikona, hidroksilfeniletilgrupas, kas ir savienota ar glikopiranozi, apiozi, galaktozi, ramnozi vai ksilozi, izmantojot glikozīdu saiti. Tie plaši sastopami Cistanche ģints zāļu sugās [13]. Cistanche deserticola YC Ma ir oficiāls TCM, kas ir reģistrēts Ķīnas farmakopejā, un C.deserticola ir ne tikai svarīgs TCM [14], bet arī pretnovecošanās tonizējošs augs ar nelielām blakusparādībām, kas ir izstrādāts ārstniecības dzērienā un uztura šķidrumā, ko apstiprinājusi Valsts Pārtikas un zāļu pārvalde. Pamatojoties uz Ķīnas farmakopejas ierakstiem, vietējie iedzīvotāji tradicionāli izmantoja C. deserticola, lai risinātu nieru esences deficīta problēmas, piemēram, muskuļu vājumu un jostas daļas vājumu, kā arī feniletanoīdu glikozīdu savienojumus, tostarpehinakozīdsun akteozīds ir galvenās šī auga bioaktīvās sastāvdaļas. Saskaņā ar TCM teoriju par "nieres pārvalda kaulu", kaulu sistēmu pārvalda nieru esence [15], un ar kauliem saistītas problēmas, piemēram, osteoporozi, var novērst, izmantojot ārstniecības augus vai savienojumus, kas baro nieru esenci. Tāpēc mēs izvirzījām hipotēzi, ka no C. deserticola izolētā kopējā feniletanoīda glikozīdu frakcija vismaz daļēji bija labvēlīga osteoporozes ārstēšanā. Tāpēc pašreizējais eksperiments tika izstrādāts, lai apstiprinātu mūsu hipotēzi, izmantojot ovariektomizētu (OVX) žurku modeli; papildus kaulu rezorbcijas un veidošanās marķieriem, kas jānovērtē, antioksidācijas indekss, kā arī RANKL/RANK/TRAF6- inducētie PI3K/AKT un NF-κB signalizācijas ceļi tika izmantoti arī, lai izpētītu galvenos antiosteoporotiskās bioaktivitātes mehānismus. .

2. Materiāli un metode

2.1. Augu materiāli un sagatavošana.

Kopā 2015. septembrī no Yongning apgabala tika savākti 30 kg Cistanche deserticola YC Ma stublāji ar koordinātām 106.026597 un 38.262816, Ningxia province, Ķīna. Šo augu identificēja Dr Lin Dong (Ningsijas Medicīnas universitātes Farmakognozijas katedra), un attiecīgais paraugs (nr. 20150901) tika saglabāts ASV departamentā. Farmaceitiskā analīze. Vispirms tika ekstrahēti 30,0 kg pulverveida C. deserticola, izmantojot atteces metodi ar 70% etanolu kā šķīdinātāju; materiāla attiecība pret šķīdinātāju tika iestatīta kā 1:10, un atteces laiks bija 2 stundas 3 reizes. Pēc tam visi filtrāti tika apvienoti un kondensēti pazeminātā spiedienā 60°C. Otrkārt, iepriekšējai atdalīšanai tika izmantotas AB-8 makroporaino sveķu kolonnas un dažādas etanola attiecības ūdenī (0%, 20%, Eluēšanai tika izmantoti 30%, 40%, 50% un 60%, katrs 60 l). Treškārt, 40% un 50% eluenti tika apvienoti un tālāk attīrīti, izmantojot atkārtotas AB-8 makroporaino sveķu kolonnas ar eluentiem 0%, 20%, 30%, 40% un 50% etanola ūdenī, un katrs eluents bija 12 l. Visbeidzot, 40% frakcija tika savākta un kondensēta pazeminātā spiedienā, lai iegūtu 150 g gaiši dzeltenas C. deserticola feniletanoīda glikozīda frakcijas (CDP, iznākums bija 0,5%). In vivo eksperimentiem CDP izšķīdināšanai izmantoja 0,5% CMC-Na šķīdinātāju; perorāla ievadīšana dzīvniekiem tika iestatīta kā 1 ml/100 g ķermeņa svara; in vitro Western blot analīzei CDP tika izšķīdināts ar DMSO un pēc tam atšķaidīts ar DMEM, lai iegūtu galīgās koncentrācijas 0, 1 mg / ml, 0, 01 mg / ml un 0, 001 mg / ml. 

DABĪGS CISTANŠES Ekstrakts KAULU AUGŠANAIFENILETANOĪDI GLIKOZĪDI 75% EHINAKOZĪDS 30% AKTEOZĪDS 12%

2.2. Ķīmiskās vielas un šķīdinātāji.

Estradiola valerāts (EV) bija no Delpharm Lille SAS, Francija; sārmainās fosfatāzes (ALP), kaulu gla-proteīna (BGP), tartrātu rezistentās skābes fosfatāzes (TRAP) un deoksipiridinolīna (DPD) šķērssaites ELISA komplekti no Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Šanhaja, Ķīna, 201605; malondialdehīda (MDA, 20181221), superoksīda dismutāzes (SOD, 20121218) un glutationa (GSH, 20181221) reaģentu komplekti no Nanjing Jiancheng Bioloģiskās inženierijas institūta, Nanjing, Ķīna; lntact parathormona (l-PTH, NEWASHE7UZ), kalcitonīna (2L9ISN7AIU) un ar estrogēnu saistīto alfa receptoru (ERR, Y3AY8QEWB3) šķērssaites ELISA komplekti no Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Vuhana, Ķīna; katepsīna K ELISA reaģenta komplekts no BioVision, Amerika, 1l300141; primārās antivielas pret RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κB p65 (AH04138226), PI3 alfakināzi (p66AC085) , AKT 1 (AF05173234), -aktīns (17AV0411) un sekundārās antivielas no mārrutku peroksidāzes konjugētā kazas anti-trušu IgG no ZSGB-BIO, Ķīna, 136080; kopējā BCA proteīna testa komplekts un komerciālais komplekts kaulu oklastu veidošanās un liellopu augļa seruma noteikšanai un Dulbecco modificētā Ērgļa barotne (DMEM) no HyClone, Logan, UT, ASV; polivinilidēnfluorīda (PVDF) membrāna no Millipore Life Sciences, Billerica, MA, ASV; penicilīns un streptomicīns no Gibco, Rockville, MD, ASV. Visas pārējās izmantotās ķīmiskās vielas bija AR kategorijas.

2.3. HPLC CDP kvantitatīva noteikšana.

Lai identificētu un kvantitatīvi noteiktu CDP sastāvu, tika izmantots Agilent 1220 HPLC instruments. Hromatogrāfijas apstākļi bija šādi: C18 kolonna (TSK-GEL, 4.6.id × 250 mm, 5 μm); gradienta eluēšana saturēja šķīdinātājus A (acetonitrils) un B (ūdens, kas satur 0,5% etiķskābes) (0-10 min: 17-20% A; 10-30 min: 20-25% A; un 30-40 min: 25-30% A); noteikšanas viļņa garums bija 333 nm; apkārtējās vides temperatūra; plūsmas ātrums bija 1,0 ml/min; parauga injekcijas tilpums bija 5 μL. Tika identificēti astoņi PhG savienojumi, proti, cistanīds F, ehinakozīds, 6′-acetilakteozīds, cistanīds C, cistanīds A, akteozīds, 2′-acetilakteozīds un izoakteozīds; izmantojot atbilstošās standartvielas un ārēju standarta metodi, iepriekšminēto 8 PhG saturu kvantitatīvi noteica ar HPLC analīzi (1. attēls).

1. attēls: CDP HPLC pirkstu nospiedums. Šajā frakcijā tika atrasti astoņi feniletanoīdu glikozīdu savienojumi, un kopējais saturs tika noteikts kā 50,7%. Savienojumi un to saturs bija šādi: (1) akteozīds F (3,6%), (2) ehinakozīds (8,8%), (3) cistanozīds A (5,0%), (4) akteozīds (13,3%), (5) izoakteozīds (3,3 %), (6) akteozīds C (3,6 %), (7) 2′-acetilakteozīds (9,9 %) un (8) 6′-acetilakteozīds (3,2 %).

2.4. Dzīvnieku eksperimentu protokols.

Pavisam 6 0 pieaugušas Sprague-Dawley žurku mātītes, kuru vecums bija 3 mēneši, tika iegūtas no Ningsijas Medicīnas universitātes izmēģinājumu centra ar dzīvniekiem, kuru vidējais sākotnējais ķermeņa svars bija aptuveni 234 ± 25 g. Žurkas tika izmitinātas standarta specifiskā, patogēnu brīvā vidē, lai aklimatizētos 1 nedēļu. Pēc tam visas žurkas tika anestēzijas (hlorhidrāts, 100 mg/kg, ip) tikai vai fiktīva olnīcu izņemšana (SHAM), vai arī divas olnīcas tika izņemtas un pēc tam nejauši sadalītas 5 apakšgrupās: iekšķīgi apstrādātas ar nesēju (0,5% CMC- Na) tika noteikta kā modeļa grupa (OVX), estradiola valerāts (1 mg/kg/dienā) kā pozitīvā grupa (EV) un 60, 120 un 240 mg/kg/dienā CDP kā zems (CDPL), vidējas (CDPM) un augstas (CDPH) devu grupas. Visas žurkas tika ievadītas perorāli katru dienu, un tās ilga 3 mēnešus ar devu, kas tika pielāgota ik pēc 2 nedēļām, kas bija atkarīga no visa ķermeņa svara izmaiņām. Eksperimenta ar dzīvniekiem pēdējā dienā 24-stundu urīns tika iegūts, izmantojot vielmaiņas būrus; serums tika savākts no anestēzētu žurku augšstilba artērijas; labais augšstilba kauls, stilba kauls un visi orgāni tika izgriezti un uzglabāti -80 ° C temperatūrā turpmākai analīzei. Mūsu veiktos eksperimentus ar dzīvniekiem apstiprināja Ningsijas Medicīnas universitātes Institucionālā dzīvnieku aprūpes un lietošanas komiteja.

2.5. Kaulu minerālu blīvuma noteikšana un mikro-CT analīze.

Pirmkārt, lai novērtētu katras žurkas labā augšstilba kaula kopējo minerālo blīvumu, tika izmantota divu enerģiju rentgena absorbcijas aparāts (Lunar, ASV); otrkārt, tas pats augšstilba kauls tika izmantots, lai novērtētu trabekulārā kaula mikroarhitektūras 3D attēlu, izmantojot mikro-CT skenera aparātu (GE, Amerika). Izotropā izšķirtspēja tika iestatīta kā 14 μm, lai iegūtu ideālu 3D attēlu; interesējošais reģions (ROI) tika izvēlēts, katra parauga augšstilba kaula augšanas plāksnē iestatot vienādas koordinātas; un kaulu morfometriskie parametri, tostarp trabekulārā atdalīšana (Tb.Sp), trabekulārais skaitlis (Tb.N), trabekulārais biezums (Tb.Th), kaulu minerālvielu saturs (BMC), audu minerālvielu blīvums (TMD) un audu minerālvielu saturs (TMC). ) tika iegūti, analizējot IA.

2. attēls. OVX un 12 nedēļu ārstēšanas ar CDP vai EV ietekme uz kopējo kaulu minerālo blīvumu žurku labajā augšstilba kaulā, kas novērtēta, izmantojot dubultās enerģijas rentgena absorbcijas metodi (n=10/grupā). Dati tika parādīti kā vidējais ± SD; ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 un ∗∗∗p < 0 001 pret OVX grupu; ###p < 0 001 pret SHAM grupu.

3. attēls. Ar CDP ārstētu žurku labā augšstilba kaula mikroarhitektūras mikro-CT skenēšanas attēli; parādītās fotogrāfijas reprezentēja 4 dažādas žurkas katrā grupā: (A) OVX grupa; (B) SHAM grupa; (C) EV grupa; (D) CDPH grupa; (E) CDPM grupa; (F) CDPL grupa. Mērītajos parametros ietilpstkaulu minerālvielu saturs(BMC), audu minerālvielu saturu (TMC), audu minerālo blīvumu (TMD), trabekulāro atdalīšanu (Tb.Sp), trabekulāro skaitu (Tb.N) un trabekulāro biezumu (Tb.Th). OVX žurkām bija ievērojams mikroarhitektūras laukuma un trabekulārā skaita samazinājums. Ar CDP ārstētām žurkām un ar EV ārstētām žurkām pēc 12 ārstēšanas nedēļām iepriekš minētie atklājumi daļēji tika mainīti tādā pašā pakāpē. Visas vērtības tika uzrādītas kā vidējais ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 un ∗∗∗p < 0 001 pret OVX grupu; ###p < 0 001 pret SHAM grupu.

4. attēls. OVX un 12 nedēļu ārstēšanas ar CDP vai EV ietekme uz urīnu un Ca un P, kā arī PTH un kalcitonīnu žurkām (n=10/grupā). Visi dati tika izteikti kā vidējais ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 un ∗∗∗p < 0 001 pret OVX grupu; # p < 0 05, ##p < 0 01 un ###p < 0 001 pret SHAM grupu.

2.6. Seruma un urīna bioķīmiskā pārbaude.

Seruma katepsīna K, TRAP, SOD un GSH aktivitātes, kā arī seruma PTH, kalcitonīna, ERR , MDA, BGP un urīna DPD saturs tika noteikts, izmantojot atbilstošus reaģentu komplektus saskaņā ar ražotāja norādījumiem un Sārmainās fosfatāzes (ALP) līmenis un kalcija (Ca) un fosfora (P) saturs serumā un urīnā tika novērtēts, izmantojot automātisko iekārtu (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, ASV).

2.7. Western Blot analīze.

Osteoklasti tika ierosināti, izmantojot RAW 264.7 šūnas, kurām pievienots makrofāgu koloniju stimulējošais faktors (MCSF) un RANKL. Īsumā, 1 × 107 RAW 264.7 šūnas tika kultivētas 6-iedobes plāksnē 30 ng/mL MCSF un 25 ng/ml RANKL klātbūtnē. Pēc 6 dienu indukcijas nobriedušās osteoklastu šūnas tika identificētas, izmantojot TRAP iekrāsoto metodi ar atbilstošo komplektu, pēc tam apstrādātas ar CDP (0,1, 0,01 un 0,001 mg/ml). attiecīgi) 24 stundas; pēc tam šūnas tika lizētas ar līzes buferi, kas satur 0,5 mmol fenilmetilsulfonilfluorīda, proteāzes un fosfatāzes inhibitorus. Pēc tam lizāts tika atdalīts, izmantojot 10% SDS-PAGE, un pārnests uz PVDF membrānu, kas tika pārbaudīts ar AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3K p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos un -aktīnu ( 1 : 400) pēc bloķēšanas ar 5% beztauku pienu 2 stundas. Tās pašas membrānas tika noņemtas un vēlreiz pārbaudītas ar iepriekš minētajām 9 atbilstošajām antivielām, un pēc tam tās beigās atklāja programmatūra Image Lab. Eksperimenti tika atkārtoti trīs reizes.

2.8. Statistiskā analīze.

Visi in vivo un in vitro eksperimentos iegūtie dati, kas aprakstīti kā vidējais ± SD, tika analizēti, izmantojot vienvirziena ANOVA, kam sekoja Daneta tests (SPSS 22.0 programmatūra, SPSS, ASV); p < 0 05 bija statistiski nozīmīgs.

3. Rezultāti

3.1. CDP ķīmiskais sastāvs.

Izmantojot HPLC metodi, astoņifeniletanoīdu glikozīdu savienojumitika atrasti šajā frakcijā, kā parādīts 1. attēlā. Izmantojot standarta atsauces un ārējā standarta metodi, savienojumi un to saturs tika identificēti un kvantificēti šādi: (1) akteozīds F (3,6%), (2) ehinakozīds (8,8%), (3)cistanozīdsA (50%), (4) akteozīds (13,3%), (5) izoakteozīds (3,3%), (6) akteozīds C (3,6%), (7) 2′-acetilakteozīds (9,9%) ), un (8) 6′-acetilakteozīds (3,2%). Šo astoņu komponentu kopējais saturs tika noteikts kā 50,7%.

DABĪGA TUBE CISTANŠES EKSTRAKTSKAULU AUGŠANAIFENILETANOĪDI GLIKOZĪDI 75% EHINAKOZĪDS 30% AKTEOZĪDS 12%

3.2. CDP ietekme uz kaulu minerālu blīvumu un trabekulas mikroarhitektūru.

Žurku kopējais kaulu minerālais blīvums dažādās apakšgrupās ir parādīts 2. attēlā. OVX modeļa operācijas žurkām tika novērota kaulu minerālā blīvuma satura samazināšanās tendence, salīdzinot ar SHAM grupas žurkām (p < {{ 1}}). Visām ar CDP ārstētajām žurkām kaulu minerālais blīvums bija ievērojami palielināts attiecīgi par 11,2%, 12.0% un 10,7% (p < 0 01), salīdzinot ar OVX modeļa grupas žurkām. Turklāt saskaņā ar datiem par kopējo kaulu minerālo blīvumu, mikro-CT rekonstrukcija, kā arī augšstilba kaula histomorfometriskā noteikšana parādīja, ka OVX grupas žurkām bija acīmredzama trabekulārās arhitektūras pasliktināšanās, par ko liecina ievērojami samazināts trabekulu skaits un laukums. kā arī ievērojami palielinājās Tb.Sp, salīdzinot ar SHAM grupas žurkām. Ārstēšana ar CDP novērsa OVX izraisīto trabekulārās arhitektūras pasliktināšanos; kā parādīts 3. attēlā, BMC, TMC un Tb.N vērtības tika ievērojami palielinātas, un Tb.Sp laukums bija ievērojami samazināts, savukārt TMD un Tb.Th vērtības OVX darbība un mūsu CDP iejaukšanās.

5. attēls. OVX un 12-nedēļas ārstēšanas ar CDP vai EV ietekme uz seruma TRAP, katepsīna K, DPD, ALP un BGP aktivitātēm OVX žurkām (n=10/grupa). Visas vērtības tika uzrādītas kā vidējais ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 un ∗∗∗p < 0 001 pret OVX grupu; # p < 0 05, ##p < 0 01 un ###p < 0 001 pret SHAM grupu.

3.3. CDP ietekme uz urīna un seruma bioķīmiskajiem parametriem.

Kā parādīts 4. attēlā, OVX modeļa grupas žurkām tika konstatētas nozīmīgas P līmeņa un seruma kalcitonīna satura samazināšanās tendences, kas bija gandrīz par 30% un 60% mazākas nekā SHAM žurkām (p < 0 001 ), savukārt starp OVX un SHAM grupām netika novērotas acīmredzamas Ca un seruma Ca līmeņa palielināšanās vai samazināšanās tendences urīnā, kā arī P un seruma PTH līmenis. Ārstēšana ar CDP būtiski novērsa P un Ca zudumu serumā OVX žurkām, par ko liecina ievērojami paaugstināts P un Ca līmenis serumā (p < 0 05), salīdzinot ar OVX modeļa grupas žurkām. Turklāt, salīdzinot ar OVX modeļa grupu, tika novērotas paaugstinātas, bet nestatistiski nozīmīgas kalcitonīna tendences gan CDP zemo, gan lielo devu grupās.

6. attēls. OVX un 12-nedēļas ārstēšanas ar CDP vai EV ietekme uz žurku ERR ekspresiju, ķermeņa svaru un dzemdes un maksts svaru (n=10/grupā). Dati tiek parādīti kā vidējais ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 un ∗∗∗p < 0 001 pret OVX grupu; ###p < 0 001 pret SHAM grupu.

3.4. CDP ietekme uz kaulu veidošanos un kaulu rezorbcijas marķieriem.

CDP labvēlīgā ietekme uz kaulu veidošanās indeksu, kā arī inhibīcija ietekmēkaulu rezorbcijamarķieri ir aprakstīti 5. attēlā. Attiecībā uz kaulu veidošanās marķieriem seruma BGP līmeni gandrīz neietekmēja operācija ar olnīcu izņemšanu, par ko liecina nenozīmīgas izmaiņas, kas novērotas visās ārstētajās grupās, savukārt statistiski nozīmīgi seruma ALP uzlabojumi tika iegūti gan zemā (6 0 mg/kg) un mērenas (120 mg/kg) devas CDP intervences grupām, salīdzinot ar SHAM grupas žurkām (p < 0 01). Attiecībā uz kaulu rezorbcijas indeksu seruma katepsīna K un DPD, kā arī TRAP līmenis OVX modeļu grupas žurkām bija ievērojami paaugstināts par attiecīgi aptuveni 75,0%, 41,4% un 21,0%, salīdzinot ar SHAM žurkām. , un, ārstējot ar CDP, īpaši ar zemo devu 60 mg/kg, katepsīna K un DPD, kā arī TRAP īpašības OVX modeļu grupā tika ievērojami inhibētas attiecīgi par 67,3%, 41,4% un 25,9%. salīdzinot ar žurkām OVX modeļu grupā.

DABĪGA TUBE CISTANČE KAULU AUGŠANAIFENILETANOĪDI GLIKOZĪDI 75% EHINAKOZĪDS 30% AKTEOZĪDS 12%

3.5. CDP ietekme uz maksts un dzemdes, kā arī visa ķermeņa svaru.

Nenozīmīgas atšķirības žurku sākotnējā veselā ķermeņa svarā pirms ārstēšanas tika novērotas sešās grupās (6. attēls). Tomēr operācija ar olnīcu izņemšanu izraisīja ievērojamu žurku galīgā ķermeņa svara palielināšanos OVX modeļu grupā, kas ir gandrīz par 36.0%, savukārt dzemdes un maksts mitrā masa krasi samazinājās par gandrīz 9{{4} }.0% un 60,0% attiecīgi, salīdzinot ar SHAM žurkām (p < 0 001). Lai gan ERR saturs neuzrādīja būtiskas atšķirības starp OVX un SHAM grupām, visas ārstēšanas grupas, tostarp CDP un EV, ievērojami palielināja ERR līmeni. Turklāt, ārstējot ar EV, iepriekš minētās OVX žurku ķermeņa masas palielināšanās, kā arī maksts un dzemdes svara zudums daļēji tika novērsts (p < 0 001), bet CDP iejaukšanās to neietekmēja.

3.6. CDP ietekme uz seruma MDA, SOD un GSH līmeni.

Starp SHAM un OVX modeļu grupām nebija statistiski nozīmīgas atšķirības seruma SOD un GSH īpašībās; kā aprakstīts 7. attēlā, starp iepriekšminētajām divām grupām var novērot GSH pieauguma tendenci. Turklāt OVX modeļa grupas žurkām seruma MDA līmenis tika strauji paaugstināts par gandrīz 50%, salīdzinot ar SHAM žurkām. CDP apstrāde neietekmēja SOD aktivitāti, turpretim GSH īpašības būtiski uzlaboja CDP iejaukšanās, un CDP ievērojami samazināja MDA līmeni par 33,9% un 42,4% pie attiecīgi 60 un 240 mg/kg devās ( p < 0 001).

3.7. CDP ietekme uz proteīna ekspresijas līmeņiem.

Mūsu dati, kas parādīti 8. attēlā, liecināja, ka CDP ārstēšana ievērojami samazināja TRAF6, RANK un RANKL olbaltumvielu līmeni salīdzinājumā ar kontroli. Pakārtotie signālu ceļi, tostarp NF-κB, tika nomākti, un PI3K / AKT stimulēja CDP iejaukšanās, par ko liecina NF-κB-p65 pazeminātas regulēšanas izpausme, savukārt PI3K p85 un AKT1 tika regulēti. Līdz ar to NFAT2 ekspresija bija ievērojami samazināta un c Fos palielinājās pēc apstrādes ar CDP koncentrācijā 0.001-0,1 mg/ml. Ierosinātais mehānisms ir aprakstīts 9. attēlā, kur CDP pazemināja RANKL un RANK līmeni, samazinot šī liganda saistīšanās daudzumu ar tā receptoriem. RANKL savienojumu ar RANK vēl vairāk samazināja TRAF6 pazemināšana, kam sekoja pakārtoto ceļu nomākšana, ieskaitot NF-κB ceļu. Turpretī tika stimulēts PI3K / AKT signāla ceļš, kas beidzot noveda pie NFAT2 ekspresijas samazināšanās un c-Fos līmeņa paaugstināšanās.

4. Diskusija

Feniletanoīdu glikozīdiir dabiski ūdenī šķīstoši komponenti, kas plaši sastopami ārstniecības augu valstībā [11]. Līdz šim feniletanoīdu glikozīdu savienojumi ir piesaistījuši arvien vairāk pētnieku, jo tiem ir acīmredzama loma dažādu cilvēku slimību un anomāliju ārstēšanā [13]. No vairākiem desmitiem dabisko ārstniecības augu tika identificēts un izolēts antiosteoporozes bioaktīvo frakciju un savienojumu skaits, ieskaitot polifenolu un feniletanoīdu glikozīdus [5, 10, 12, 16, 17].

8. attēls. Dažādu CDP koncentrāciju ietekme uz TRAF6 (a), RANKL (b), RANK (c), PI3K (d), AKT (e), NF-κBIA (f), NFAT2 (g) proteīnu ekspresiju, un c-Fos (h) (n=3/grupa); proteīna ekspresija tika normalizēta līdz -aktīnam, un katra signāla proteīna kvantitatīvie dati tika parādīti procentos no kontroles vērtības. Dati tika aprakstīti kā vidējais ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 un ∗∗∗p < 0 001 pret kontroles grupu.

C. deserticola ir labi pazīstama kā "tuksneša žeņšeņs", kas norāda uz šī ēdamā TCM drošības profilu [18, 19]. Kā vispārējs tonizējošais augs un dabīgs veselīgs ēdiens, ko jau sen izmanto Āzijas valstīs, C. deserticola uzrādīja labvēlīgu funkciju nieru darbības uzlabošanai. Tika atklāts, ka TCM, ko tradicionāli izmanto nieru esences uzmundrināšanai un uzturēšanai, parasti lieto osteoporozes ārstēšanai, gan in vitro, gan in vivo publicētie dati ir pierādījuši C. deserticola antiosteoporotisko aktivitāti [20–23], un feniletanoīdu glikozīdu sastāvdaļas, tostarp ehinakozīds un akteozīds, ir galvenie bioaktīvie komponenti, kas pastāv šajā ēdamajā ārstniecības augā; tas viss liecināja, ka ne tikai ehinakozīds un akteozīds, bet arī citi C. deserticola saturošie feniletanoīdu glikozīdu komponenti tika uzskatīti par atbildīgiem par šī auga antiosteoporotisko īpašību. Mūsu pašreizējā pētījumā tika izmantoti labvēlīgi droši makroporainie sveķi, lai izolētu un bagātinātu feniletanoīdu glikozīdu frakciju no C. deserticola, un, izmantojot HPLC metodi, astoņas galvenās feniletanoīda glikozīda sastāvdaļas, proti, akteozīds F, ehinakozīds, cistanozīds A, Akteozīds, izoakteozīds, akteozīds C, 2′-acetilakteozīds un 6′-acetilakteozīds tika atrasti izolētajā feniletanoīda glikozīda frakcijā, un to saturs bija 3,6%, 8,8%, 5,0%, 13,3%, 3,3%, 3. attiecīgi 9,9% un 3,2%. Ir pierādīts, ka ehinakozīdam, vienam no galvenajiem C. deserticola reģistrētajiem savienojumiem [14], piemīt antiosteoporotiska iedarbība; tomēr 270 mg/kg deva bija tik liela, ka ierobežoja tās turpmāko klīnisko pielietojumu [24]. Pašreizējos eksperimentos OVX žurkām tika izmantota kopējā feniletanoīda glikozīda frakcija ar mazāku devu 60-240 mg/kg ķermeņa svara dienā, un identificēto sastāvdaļu saturs šajā frakcijā bija gandrīz 50% tīrs, izmantojot HPLC metode.

Bija labi zināms, ka OVX var izraisīt osteoporozi, un tika uzskatīts, ka OVX žurka ir klasisks un piemērots modelis cilvēka pēcmenopauzes osteoporozes modelēšanai. Tajā pašā laikā pēc ovariektomijas operācijas tika novērota ievērojama kaulu minerālā blīvuma, trabekulārā kaula mikroarhitektūras, dzemdes un maksts mitrās masas un estrogēnu līmeņa samazināšanās, kā arī acīmredzama kaulu rezorbcijas un ķermeņa masas uzlabošanās. daļa estrogēna zuduma dēļ [25]. Mūsu līdz šim iegūtie dati skaidri parādīja, ka OVX patiešām izraisīja pēcmenopauzes osteoporozi un to vienmēr pavada strauja kaulu kvalitātes, kaulu mikroarhitektūras un dzemdes un maksts mitrā svara samazināšanās. Tā kā EV ir vispārējs hormonu aizstājējs, kas ir izmantots klīniskajā praksē, tas tika izmantots kā pozitīva kontrole mūsu in vivo eksperimentā, un tika konstatēts palielinātais ķermeņa svars un atrofētais dzemdes svars, kā arī kaulu minerālā blīvuma un trabekulārā kaula mikroarhitektūras pasliktināšanās. paredzams, ka to mainīs EV papildinājums. Atšķirībā no pozitīvās kontroles, samazināto maksts un dzemdes svaru, kā arī palielināto visa ķermeņa svaru žurku OVX modeļu grupā CDP ārstēšana neietekmēja, kas nozīmēja, ka CDP varētu uzlabot kaulu veidošanos, neizraisot blakusparādības. uz ķermeņa un dzemdes organiskajiem audiem. Lai gan CDP terapija ievērojami palielināja ERR līmeni, gluži kā fitoestrogēna iedarbībai netika novērotas nekādas blakusparādības uz dzemdes un maksts organiskajiem audiem. Turklāt CDP ārstēšana ievērojami uzlaboja kaulu kvalitāti OVX žurkām, kuras pasliktināja olnīcu izņemšanas operācija.

Turklāt P un Ca līmeņi OVX žurku urīnā un serumā tika izmantoti arī, lai atspoguļotu antiosteoporotisko efektu, un Ca un neorganiskā P koncentrācija parasti bija atkarīga no kalcitonīna un PTH līmeņa [26]. Šajā pētījumā, lai gan nav būtiskas samazināšanās vai pieauguma tendences Ca izdalīšanās ar urīnu līmenī,

9. attēls. Hipotēzes molekulārais mehānisms: CDP varētu novērst kaulu zudumu OVX žurkām, izmantojot RANKL/RANK/TRAF6-inducētu NF-κB inaktivāciju un PI3K/AKT ceļu aktivāciju, kā arī c-Fos stimulāciju un NFAT2 nomākšanu. , par ko liecina TRAF6, RANKL, RANK, NF-κBIA un NFAT2 ekspresijas līmeņu pazemināšanās, turpretim c-Fos, AKT un PI3K tika ievērojami paaugstināti ar CDP ārstēšanu, salīdzinot ar kontroles grupu.

OVX modeļa grupas žurkām tika iegūti seruma P, seruma Ca un PTH, un tika novērots ievērojams P un kalcitonīna līmenis urīnā (p < 0 001). Saskaņā ar publicētajiem datiem, ka estrogēna deficīts, ko izraisīja olnīcu izņemšana, vienmēr izraisīja kalcitonīna līmeņa pazemināšanos asinīs, šis pazeminātais kalcitonīna līmenis serumā beidzot izraisīja paaugstinātu PTH līmeni, kur Ca tika uzskatīts par galveno PTH sekrēcijas regulatoru. Tā kā PTH koncentrācija šajā pētījumā neuzrādīja būtisku atšķirību starp OVX un SHAM grupām, Ca līmenis gan serumā, gan urīnā arī neuzrādīja acīmredzamas izmaiņas starp iepriekš minētajām divām grupām. Tomēr tika iegūta ievērojami pazemināta tendence uz kalcitonīna līmeni starp OVX un SHAM grupām, un līdz ar to P saturs OVX urīnā tika ievērojami samazināts. Mēs uzskatām, ka iepriekš minētie dati var izskaidrot pretrunīgo parādību, kāpēc Ca līmeņa izdalīšanās urīnā OVX žurkām neuzrādīja acīmredzamas izmaiņas salīdzinājumā ar SHAM žurkām, un šī parādība var būt saistīta arī ar palielinātu kaulu apmaiņas ātrumu [27] . Pēc ārstēšanas ar CDP P un Ca līmenis serumā tika ievērojami paaugstināts, un P saturs urīnā tika pazemināts OVX žurkām, kas atspoguļoja, ka CDP var ne tikai novērst kaulu minerālu elementu izdalīšanos, bet arī palielināt šo dzīvnieku seruma saturu. elementi, tādējādi netieši nomācot kaulu zudumu.

Turklāt, lai izskaidrotu CDP pamatā esošos antiosteoporozes mehānismus, tika izmantoti arī kaulu veidošanās un rezorbcijas marķieri, kā arī antioksidantu enzīmi, tostarp SOD un GSH. Līdzīgi kā publicētajos datos, ALP līmenis OVX modeļa grupas žurkām uzrādīja statistiski nenozīmīgu pieauguma tendenci, kas liecina par paātrinātu kaulu apmaiņas ātrumu pēcmenopauzes osteoporozes gadījumā [10]. Tomēr pēc ārstēšanas ar CDP (60, 120 un 240 mg / kg / dienā) ALP īpašības tika ievērojami uzlabotas. Bija labi zināms, ka OVX izraisīja strauju estrogēna līmeņa pazemināšanos, kas parasti izraisa pārmērīgu kaulu rezorbciju un oksidatīvo stresu [28], par ko liecina TRAP, katepsīna K un DPD, kā arī MDA līmenis, kas ievērojami paaugstināts žurkām. OVX modeļu grupa. Tomēr šos pasliktināšanos daļēji uzlaboja CDP iejaukšanās. Turklāt OVX žurku apstrāde ar CDP (60 un 240 mg/kg) uzrādīja ievērojamu GSH aktivitātes pieaugumu (p < 0 05). Iepriekš minētie rezultāti liecināja, ka CDP bija terapeitiska iedarbība uz OVX izraisītu osteoporozi, un šie efekti bija gan, uzlabojot kaulu veidošanos un nomācot kaulu rezorbciju, gan uzlabojot kaulu antioksidantu sistēmu.

RANK aktivizēšana ar tā ligandu RANKL stimulēja NFAT2 un c-Fos izpausmes, izmantojot PI3K/AKT un NF-κB signālu pārraidi [29]. Izrādījās, ka NF-κB ir būtisks osteoklastoģenēzē, jo NF-κB traucējumi var izraisīt osteoklastu diferenciācijas traucējumus ar osteoporotisku fenotipu, un NF-κB pārregulēja c-Fos un pazemināja NFAT2 ekspresijas RANKL / RANK / TRAF izraisītas osteoklastoģenēzes laikā. Lai novērtētu CDP labvēlīgo ietekmi uz NFAT2 un c-Fos mediēto osteoklastoģenēzi, tika analizēti RANKL un RANK ekspresijas līmeņi. Paredzams, ka CDP ievērojami inhibēja NFAT2 un stimulēja c-Fos līmeni, samazinot RANKL un RANK izpausmes. Tikmēr pašam RANK trūka iekšējās kināzes īpašību, ja vien to nepievienoja TRAF6, lai aktivizētu pakārtoto signalizāciju [3]. CDP arī pazemināja TRAF6 ekspresiju, kā rezultātā ievērojami samazinājās RANKL un RANK saistīšanās daudzums. Hipotēzes CDP antiosteoporotiskais mehānisms OVX žurkām aptvēra iepriekš minētos signalizācijas ceļus, un regulatori ir aprakstīti 9. attēlā. Konspektīvi, CDP samazināja TRAF6, RANKL un RANK līmeni, tādējādi nomācot pakārtotos signalizācijas ceļus, tostarp PI3K/AKT un NF-κB. tiek iedarbinātas RANKL / RANK, un visbeidzot samazināja galveno osteoklastogēno proteīnu NFAT2 un c-Fos izpausmes un aktivitātes. Tāpēc vairākas datu norādes liecināja par CDP labvēlīgo ietekmi uz OVX žurku kaulu metabolismu, galvenokārt izmantojot RANKL/RANK/TRAF6-mediētos PI3K/AKT un NF-κB ceļus.

5. Secinājums

Rezumējot, kopējiem feniletanoīdu glikozīdiem, kas izolēti no C. deserticola, bija nozīmīga labvēlīga ietekme uz OVX žurku osteoporozi pēcmenopauzes periodā, un terapeitiskais potenciāls kaulu zuduma nomākšanā galvenokārt bija, stimulējot kaulu veidošanos un kavējot kaulu rezorbciju, kā arī uzlabojot kaulu antioksidantu. sistēma; mehānismi var būt saistīti ar RANKL/RANK/TRAF{0}}inducētu NF-κB aktivāciju un PI3K/AKT inaktivāciju, kā arī c-Fos stimulāciju un NFAT2 nomākšanu, un, visbeidzot, tika kavēta osteoklastu diferenciācija.

DABĪGA TUBE CISTANČE KAULU AUGŠANAIFENILETANOĪDI GLIKOZĪDI 75% EHINAKOZĪDS 30% AKTEOZĪDS 12%