Beta Vulgaris Rubra L. (biešu) mizas metanola ekstrakts samazina oksidatīvo stresu un stimulē šūnu proliferāciju, palielinot VEGF ekspresiju H2O2 izraisītās oksidatīvā stresa izraisītās cilvēka nabas vēnu endotēlija šūnās

Lūdzu sazinietiesoscar.xiao@wecistanche.comlai iegūtu vairāk informācijas

Abstract:Uztura līdzekļos esošo polifenolu un flavonoīdu antioksidanta spēja palīdz apturēt reaktīvo skābekļa sugu (ROS) attīstību un aizsargāt endotēlija gludās muskulatūras šūnas no oksidatīvā stresa / izraisītas nekrozes. Bietes (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) ir plaši patērēts dārzenis, kas ir bagātīgs antioksidantu avots. Biešu mizas bioaktīvie savienojumi un to loma cilvēka nabas vēnu endotēlija šūnās (HUVEC) joprojām ir nepietiekami izpētīti. Šajā pētījumā tika sagatavots biešu mizas metanola ekstrakts (BPME), un tika analizēta tā ietekme uz bioefektivitāti, kodola integritāti, mitohondriju membrānas potenciālu, asinsvadu šūnu augšanu un ar imūnregulāciju saistīto gēnu ekspresijas līmeni HUVEC ar inducētu oksidatīvo stresu. . Gāzu hromatogrāfijas-masspektroskopijas (GC-MS) rezultāti apstiprināja, ka BPME satur 5-hidroksimetilfurfurolu (32,6 %), metilpiruvātu (15,13 %), furfurolu (9,98 procenti) un 2,3-dihidro{{. 14}},5-dihidroksi-6-metil-4H-pirān-4-ons (12,4 procenti). BPM ekstrakts efektīvi uzlaboja šūnu proliferāciju un tika apstiprināts ar MTT testu; kodola integritāte tika apstiprināta ar propīdija jodīda (PI) krāsošanas testu; mitohondriju membrānas potenciāls (Aψm) tika apstiprināts ar JC-1 krāsošanas testu. Aneksīna V tests apstiprināja, ka ar BPME apstrādātajiem HUVEC tika uzrādīti 99 procenti dzīvotspējīgu šūnu, bet tikai 39,8 procenti dzīvotspēja tika parādīta HUVEC, kas tika apstrādāti tikai ar H2O2. Turklāt HUVEC BPME apstrāde 48 stundas samazināja lipīdu peroksīda (LPO) mRNS ekspresiju un palielināja NOS-3, Nrf-2, GSK-3, GPX, endotēlija slāpekļa oksīda sintāzi (eNOS). ) un asinsvadu šūnu augšanas faktora (VEGF) mRNS ekspresijas līmeni. Mēs atklājām, ka BPME terapija samazināja proinflammatoriskus procesus (kodolfaktors-k (Fk), audu nekrozes faktors (TNF-), nodevām līdzīgs receptors-4(TLR-4), interleikīns-1 ( IL-1 )) un asinsvadu iekaisums (intracelulārā adhēzijas molekula (ICAM), asinsvadu šūnu adhēzijas molekula (VCAM), EDN, IL-1 ) saistītas mRNS izpausmes. Noslēgumā jāsaka, ka biešu mizas apstrāde efektīvi palielināja asinsvadu gludo šūnu augšanas faktorus un mikrotubulu attīstību, bet samazināja asinsvadu iekaisuma regulatorus. BPM var būt labvēlīgs asinsvadu gludo šūnu reģenerācijai, audu atjaunošanai un pretnovecošanās potenciālam.

Atslēgvārdi:bietes; oksidatīvais stress; mitohondriji; angioģenēze; iekaisums

1. Ievads

Angioģenēze ir fizioloģisks vaskuloģenēzes process no organisma esošās asinsvadu sistēmas [1. Tas ir būtiski ne tikai embriju attīstībai un reprodukcijai, bet arī šūnu ciklam un audu atjaunošanai[2,3]. Tomēr tas ir saistīts ar dažādu slimību patoģenēzi, piemēram, audzēju augšanu, reimatoīdo artrītu un dažādām išēmiskām un iekaisuma slimībām [3-5]. Asinsvadu endotēlijam ir svarīga loma asinsvadu hemostāzes uzturēšanā, regulējot asinsvadu tonusu un imūnās un iekaisuma reakcijas [6,7].puritāni c vitamīnsEndotēlija šūnas (EC) ir plāni vienšūnu slāņi, kas izklāj visas asinsvadu iekšējās virsmas un ražo dažādas molekulas, kas darbojas lokāli vai attālās vietās [7]. Endotēlijs ir būtisks ķermeņa homeostāzei, un jebkuras izmaiņas endotēlija šūnu reakcijā izraisa primāros iekaisuma un asinsvadu slimību procesus, piemēram, aterosklerozi un hipertensiju [6, 8, 9]. Šīs slimības izraisa oksidatīvo stresu, kas maina EK struktūru un funkciju integritāti un izraisa endotēlija disfunkciju [9]. Cilvēka nabas vēnu EC (HUVEC) ir plaši izmantoti kā paraugs ar cilvēka asinsvadu endotēliju saistītiem pētījumiem. Turklāt tie ir noderīgs modelis galveno endotēlija funkcijā iesaistīto bioloģisko ceļu izpētei [10].

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

Bioaktīvie savienojumi un fitoķīmiskās vielas ir bagātīgi atrodamas augļos, dārzeņos, zaļajos augos un daudzos augos, kam piemīt daudzas veselības priekšrocības, piemēram, pretiekaisuma, antioksidanta, pretkancerogēna un angiogēnas īpašības [11-13]. Šajā ziņā sarkanā biete (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) pieder pie Amaranthaceae dzimtas un tiek klasificēta kā viens no labākajiem augsta līmeņa antioksidantu avotiem [14,15. Konkrēti, tas satur vairākas bioloģiski aktīvas fitoķīmiskas vielas, tostarp betalaīnus, flavonoīdus, polifenolus, terapeitiskos fermentus, askorbīnskābi, dehidroaskorbīnskābi (DHAA) un neorganisko nitrātu (NO3)[16-18]. Turklāt tas nodrošina vērtīgas būtiskas uzturvielas, piemēram, kāliju, kalciju, magniju, nātriju, dzelzi, cinku, fosforu, varu un mangānu [19]. Vairākos pētījumos ir ziņots, ka sarkano biešu ekstraktam (saknei) ir daudz labvēlīgu efektu, jo tam piemīt hipoglikemizējošas, lipīdu līmeni pazeminošas, pretiekaisuma, antihipertensīvas un antiproliferatīvas īpašības [20-22].sistancheVisas šīs labvēlīgās īpašības var būt saistītas ar bioaktīvo savienojumu brīvo radikāļu attīrīšanas spējām. Tādējādi sarkano biešu patēriņš ir saistīts ar daudziem uztura un veselības ieguvumiem. Tā uzturvērtības dēļ to var izmantot kā funkcionālu pārtikas avotu pret oksidatīvo stresu, kas izraisa hroniskas vielmaiņas slimības, piemēram, 2. tipa diabētu un sirds un asinsvadu slimības [23].

Pamatojoties uz literatūras apskatu, Beta vulgaris piemīt spēcīgas antioksidanta, imūnregulējošas un angiogēnas īpašības. Apigenīns ir atrasts biešu lapās; tam ir antiproliferatīva iedarbība aknu un zarnu šūnās, un tas var uzlabot augsta tauku satura diētas izraisītu aptaukošanos, izmantojot AMPK aktivāciju [24,25]. De Silva et al., (2020) [26] atklāja, ka Beta vulgaris aizsargā asinsvadu EC no ārēji izraisīta oksidatīvā stresa, kas var būt saistīts ar vairāku šajā augā esošo bioaktīvo savienojumu kopējo iedarbību. Līdz šim Beta vulgaris sakņu mizas mehāniskā darbība EK proliferācijas un angiogēzes iedarbībai ir bijusi nepietiekami izpētīta. Līdz ar to mūsu mērķis bija veikt šo pētījumu, lai pārbaudītu asinsvadu šūnu proliferāciju, mikrotubulu attīstību, oksidatīvo stresu un angiogēzes spēju saistībā ar Beta vulgaris sakņu mizu, izmantojot šūnu morfoloģiju un gēnu ekspresijas analīzi HUVEC. Tiek pētīta sarkano biešu mizas metanola ekstrakta angiogēnā iedarbība, kas saistīta ar kodola integritāti, mikrotubulu attīstību, mitohondriju efektivitāti un šūnu cikla stimulāciju cilvēka asinsvadu EC.

2. Materiāli un metodes

2.1.Biešu (Beta vulgaris rubra L.) metanola ekstrakta sagatavošana

Svaigu biešu (Beta Vulgaris var. Rubra L.; BVr.) paraugi sākotnēji tika iegūti dārzeņu veikalos Rijādā, Saūda Arābijas Karalistē (KSA). Svaigas bietes tika mazgātas ar destilētu ūdeni, lai noņemtu stublājus un piesārņotājus. Ārējo ādu nomizo, lai noņemtu un sagrieztu mazos gabaliņos. Paraugi tika žāvēti karstā gaisa krāsnī 40 grādu temperatūrā un pēc tam sasmalcināti pulverī, izmantojot elektronisko blenderi. Pēc tam 500 g pulvera tika ekstrahēti sterilā pudelē, kas satur 1 l metanola (Sigma, Sentluisa, MO, ASV) 24 stundas istabas temperatūrā kratītājā un atkārtoja trīs reizes. Pēc tam ekstrakta filtrēšanai tika izmantots Whatman filtrs (Whatman, Clifton, NJ, ASV). Visbeidzot, samazinot spiedienu, šķīdinātājs tika atdalīts no ekstrakta, un pēc metanola iztvaicēšanas ekstrakts tika savākts kā cieta sausa viela. Ekstrahēto paraugu uzglabāja ledusskapī 4C temperatūrā līdz turpmākai lietošanai.

2.2. Gāzu hromatogrāfija un masas spektroskopijas analīze

Biešu mizas metanola ekstrakts (BPME) tika ievadīts GC-MS instrumenta (Agilent 6890N/5973I) silīcija dioksīda kapilārā kolonnā (30 m × 0,25 mm ID × 0,25 um plēves biezums). , Kalifornija, Kalifornija, ASV) ar masas selektīvo detektoru ķīmisko sastāvu noteikšanai. Instrumenta temperatūra tika iestatīta kā sākotnēji 70 grādi, turot 2 min, līdz 305 grādiem pie 20 grādiem / min, kam sekoja turēšana 1 minūti. Kopējais GC darbības laiks tika iestatīts uz 45 minūtēm ar hēlija gāzi (99,999 procenti) kā nesējgāzi (konstants plūsmas ātrums 1,2 ml/min), 250 grādi kā inžektora temperatūra un 230 grādi kā jonu avota temperatūra. Pamatojoties uz GC-MS spektru, tika aprēķināta atbilstošā komponenta relatīvā procentuālā daļa, un nezināmā komponenta masas spektri tika identificēti, salīdzinot ar zināmajiem 62,{22}} modeļiem, kas pieejami Nacionālajā standartu un tehnoloģiju institūtā. datoru bibliotēka (NIST08).

Cistanche var novērst novecošanos

2.3. Šūnu kultūras materiāli un ķīmiskās vielas

HUVEC tika iegādāti no Amerikas tipa kultūras kolekcijas (ATCC, Manasasa, VA, ASV). Šūnu kultūras materiāli, piemēram, Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), EDTA, tripsīns un citi, tika iegūti no Gibco (Paislija, Apvienotā Karaliste). Penicilīns-streptomicīns (PS) un liellopu augļa serums (FBS) tika iegādāti no Hyclone Laboratories, ASV.kas ir cistancheMolekulārās bioloģijas eksperimentā izmantotās ķīmiskās vielas tika iegūtas no Sigma-Aldrich, īpaši MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolija bromīds], PI un JC-1 traipu. SYBR Green PCR Master Mix un cDNS sintēzes komplekts tika iegūti no Qiagen (Hilden, Vācija).

2.4.HUVECs

HUVEC tika kultivēti DMEM un papildināti ar 1% PS un 10% FBS kompleksu. Šūnas tika inkubētas mitrinātā atmosfērā 37 ° C temperatūrā, 5% CO, un subkultivēja aptuveni ik pēc 3 dienām.

2.5. Šūnu dzīvotspēja un šūnu proliferācija ar MTT testu

HUVEC (1 × 104 šūnas/iedobē) kultivēja ar uzturošo barotni un ļāva tām pielipt nakti 96-iedobes kultūras plāksnē. Pēc tam barotne tika aizstāta ar jaunu barotni, kas satur arvien lielāku BPME(0,0.05,{{10}}.1,0.2) koncentrāciju. ,0,4, 0,8, 1,6 un 3,2 ug/mL) saskaņā ar MTT testa plates karti un inkubēja 24 un 48 stundas; neapstrādātas šūnas tika izmantotas kā kontroles. Pēc inkubācijas perioda eksperimentālās šūnas tika apstrādātas ar 20 μL/iedobē 5 mg/ml MTT （3-【4,5-dimetiltiazol-2-il】-2, 5-difeniltetrazolija bromīds, kas tika izšķīdināts dimetilsulfoksīdā (DMSO)) un papildus inkubēts 4 stundas 37 grādu temperatūrā. Pēc tam barotne tika izmesta, un iegūtais purpursarkanais formazāns tika izšķīdināts 100 μl 100 procentu DMSO. Šķīduma absorbcija tika mērīta, izmantojot mikroplašu lasītāju (Thermo Scientific, Waltham, MA, ASV) pie viļņa garuma 570 nm. Šūnu proliferācijas procentuālā daļa (procenti) tika aprēķināta, izmantojot šādu vienādojumu: (parauga absorbcija/kontroles vidējā absorbcija) × 100.

2.6. Eksperimentālais dizains

Pašreizējais šūnu proliferācijas tests pārbaudīja zemāku BPME koncentrāciju ({{0}},1 un 0,2 ug/mL) un uzrādīja proliferējošu HUVEC un mikrotubulu morfoloģiju bez toksicitātes. Tika atlasīti 0,1 un 0,2 ug/mL BPME devas apjomi un apstrādāti ar normāliem HUVEC un 10 mM H, O izraisītu oksidatīvā stresa izraisītu HUVEC 48 stundas, lai noteiktu šūnu proliferāciju, pretiekaisuma līdzekli. , angiogēnais un apoptotiskais potenciāls (1. attēls). Transportlīdzekļa kontrole arī tika saglabāta 48 stundas abās grupās. Kvercetīns (10 μM) tika izmantots kā atsauces kontrole abās eksperimentālajās grupās.Pretnovecošanās cistanchePēc inkubācijas neapstrādātajām un eksperimentālajām šūnām tika analizēta šūnu un kodola morfoloģija un mitohondriju membrānas potenciāls, izmantojot BDM MitoScreen (C-1) Kit; apoptoze tika noteikta ar aneksīna V / apoptozes bāzes šūnu šķirošanas metodi plūsmas citometrijā. Tika pētīts oksidatīvais stress un proinflammatoriskais un ar angiogēzi saistītais gēnu ekspresijas līmenis.

2.7. Propīdija jodīda krāsošanas tests kodolbojājumu noteikšanai

Šūnu morfoloģijas raksturīgiem kodola bojājumiem, piknozei vai apoptotiskām morfoloģiskām izmaiņām pēc apstrādes ar {{0}},1 un 0,2 ug/mL BPME (ar vai bez H, O2) HUVEC tika noteiktas, izmantojot PI krāsošanas analīzi. apgrieztās fluorescences mikroskopijā, kā aprakstījuši Leite et al. [27].

2.8. Mitohondriju membrānas potenciāla (△中m) tests ar JC-1 krāsvielu krāsošanu

Mitohondriju membrānas potenciāls (△!m) tika noteikts ar JC{{0}} testu, lai novērtētu mitohondriju efektivitāti nesēja kontrolē un 0.1 un 0,2 ug/mL BPME apstrādāto HUVEC. (ar un bez H2O2). Īsumā, JC-1 krāsošanas šķīdums tika sajaukts ar līdzīgu barotnes tilpumu un pēc tam pievienots eksperimentālajiem HUVEC un inkubēts tumsā 20 minūtes 37 grādu temperatūrā. Pēc tam nesaistītā JC-1 krāsviela tika maigi mazgāta divas reizes, izmantojot 200 μL JC-1 krāsošanas mazgāšanas buferšķīduma 4 grādu temperatūrā. Pēc tam fluorescences mikroskopijā, izmantojot fluorescences mikroskopu, tika novērota j-agregāta uzkrāšanās pret JC-1 krāsošanu, un tika uzņemti attēli. Turklāt mitohondriju membrānas potenciāls tika mērīts plūsmas citometrijā, izmantojot BDIM MitoScreen (JC-1) komplektu.

2.9. Aneksīna vlapoptozes analīze, izmantojot plūsmas citometriju

Uz plūsmas citometriju balstītā aneksīna V/PI noteikšanas komplekta (Sigma Chemicals, ASV) metode tika izmantota, lai kvantitatīvi noteiktu dzīvotspējīgas, proapoptotiskas, agrīnas apoptotiskas un nekrotiskas šūnas. Oksidatīvā stresa izraisīti HUVEC (1 × 10 grādi / iedobē) tika ievietoti 24-iedobju plāksnēs un inkubēti ar BPME (0.1 un 0,2 ug/mL) vai nesēja kontroli. 48 h. Pēc inkubācijas šūnas tika inkubētas 400 μL 5 μL aneksīna V-fluoresceīna izotiocianāta (FITC) un 5 μl PI, kas satur saistīšanas buferšķīdumu; pēc tam šūnas tika turētas 15 minūtes istabas temperatūrā (RT) tumsā. Šūnas tika analizētas ar plūsmas citometriju (BD Biosciences, Sanhosē, CA, ASV), lai identificētu apoptotiskās (PInegatīvās un aneksīna V pozitīvas) un vēlīnās apoptotiskās (PI pozitīvas un aneksīna V pozitīvas) šūnas [28].

2.10. Kvantitatīvā reālā laika PCR analīze

Fastlane@ Cell to cDNS komplekts (Qiagen, Hilden, Vācija) tika izmantots, lai iegūtu kopējo RNS un sintezētu cDNS no nesēja kontroles, ar BPME apstrādātiem HUVEC (ar un bez H-O2), izmantojot kvantitatīvu PCR (qPCR) pusautomātisku instrumentu (Applied Biosystems). , Foster City, CA, ASV). Oksidatīvā stresa izpausmes līmeņi ir (lipīdu peroksīds, NOS-3), antioksidanti (Nrf-2, GSK-3 un GPx), proinflammatori (kodolfaktors-k (NF-k)), audzēja nekrozes faktors (TNF-), interleikīns-1 (IL-1), asinsvadu šūnu augšanas faktors (VEGF), nodevām līdzīgs receptors-4(TLR-4), un asinsvadu iekaisums (intracelulārā adhēzijas molekula (ICAM), asinsvadu šūnu adhēzijas molekula (VCAM), EDN1 un endotēlija slāpekļa oksīda sintāzes (eNOS)) saistītie gēni un atsauces gēns -aktīns tika analizēti HUVEC un kvantitatīvi noteikti ar metodi Yuan et al. [29]. Amplifikācijas vērtības (ACt) tika aprēķinātas pēc starpības starp Ct (apstrādātais) un Ct (kontrole). Gēnu ekspresija tika attēlota, izmantojot 2-AACt vērtības izteiksmi.

2.11.Statistikas analīze

Visi eksperimenti tika atkārtoti, un iegūtie dati tika izteikti kā vidējās vērtības ± standarta novirze (SD). Atšķirību statistiskā analīze starp grupām tika veikta ar vienvirziena dispersijas analīzi (ANOVA), izmantojot SPSS programmatūru (versija 28.5, SAS Institute Inc., Cary, NC, ASV).cistanche benefíciosPēc tam, ja tika konstatētas būtiskas atšķirības, tika veikts Tukey vairāku salīdzināšanas tests. Visi rezultāti tika parādīti kā vidējais ± SD sešām replikācijām katrā grupā. P vērtība < 0,05="" tika="" uzskatīta="" par="" nozīmīgu="">

3. Rezultāti

3.1.Bioaktīvās molekulas BPME

BPME ķīmiskās sastāvdaļas tika apstiprinātas, izmantojot GC-MS (Turbomass, PerkinElmer). Biešu mizas ekstrakta ķīmiskais sastāvs tika noteikts, salīdzinot pieejamos masas spektrus ar Nacionālā standartu un tehnoloģiju institūta (NIST) spektrālo datubāzi. GC-MS rezultāti apstiprināja, ka BPME satur hidroksiacetonu (8,18%), 5-hidroksimetilfurfurolu (32,6 %), metilpiruvātu (15,13 %), beta-d-allopiranozi (1,48 %), furfurolu (9,98 %),{ {15}}hidroksi-gamma-butirolaktons (1,32 procenti) un 2,3-dihidro-3.5-dihidroksi-6-metil-4H-pirāns{ {27}}viens(12,4 procenti ; 2.a attēls, 1. tabula).

3.2. Šūnu proliferācija

BPME šūnu proliferācijas potenciāls in vitro pret HUVEC ir parādīts 2.b attēlā. Salīdzinot ar nesēja kontroli, eksperimentālajās grupās netika novērota nozīmīga šūnu augšanas inhibīcija. Šis pētījums apstiprināja, ka ar HUVEC ārstētā BPME koncentrācijas palielināšana palielināja šūnu proliferāciju un dzīvotspēju pēc 48 stundām (112 procenti), salīdzinot ar 24 stundu (103 procentiem) ārstēšanu. Turklāt ar BPME apstrādāto HUVEC gaismas mikroskopiskie attēli pēc 48 stundām apstiprināja normālas šūnas ar vienādu pielipušo šūnu morfoloģijas formu, bija redzams palielināts proliferējošo (replikācijas) šūnu skaits bez bojājumiem (2.c attēls).

3.3. Šūnu un kodola morfoloģijas, mikrotubulu veidošanās un JC analīze-1 Uzturēšanās HUVECS

3. attēlā parādīta mikrotubulu attīstības morfoloģija fluorescences mikroskopiskajos attēlos. H2O2-inducētie oksidatīvā stresa izraisītie HUVEC uzrādīja vāju pielipušo šūnu proliferāciju un neregulāru morfoloģiju, salīdzinot ar kontroles HUVEC. Parastajiem HUVEC, kas tika apstrādāti ar 0,2 ug/mL BPME, tika konstatētas šūnu proliferācijas, izmantojot replikāciju vai neoģenēzi ar mikrotubulu morfoloģiju. Tikmēr 0,1 ug/ml ar BPME apstrādāto šūnu deva uzrādīja 1{{10}}0 procentus pielipušo šūnu ar agrīnām mikrotubulu stadijām. Oksidatīvā stresa pakļautie HUVEC, kas apstrādāti ar 0, 2 ug / ml BPME, identificēja jaunas šūnas ar mikrotubulu morfoloģiju un samazinātu oksidatīvo šūnu bojājumu. Turklāt 0, 1 ug / ml BPME arī palielināja normālu asinsvadu šūnu morfoloģiju ar proliferējošām šūnām.

4.a attēlā parādīta kodola struktūras normālā morfoloģija ar sfērisku formu kontroles un BPME（0.1 vai 0.2 ug/mL） apstrādātajos HUVEC. 4.b attēlā parādīti attēli PI krāsojumam normāliem un HUVEC ar oksidatīvo stresu, ko izraisa H, O. H2O2-apstrādātajos HUVEC ir redzami neregulāras formas kodoli, kuros pēc 3{{10} ir kondensācija un piknoze. } min. Tomēr 0.2 ug/mL BPME apstrādes HUVEC oksidatīvā stresa apstākļos parādīja apļveida kodolus ar normālu morfoloģiju. Salīdzinot ar 0,2 ug/ml BPME ekstrakta, 0,1 ug/ml BPME bija mazāka aizsargājoša iedarbība pret H2O2-inducēto oksidatīvo stresu HUVEC.

5.a attēlā parādīti JC-1 krāsošanas rezultāti HUVEC, ieskaitot kontroles un BPME apstrādātās šūnas; attēlā parādītas veselas šūnas ar aktīviem mitohondrijiem, ko apstiprina negatīvi lādētā mitohondriju uzņemšana ārpus mitohondriju lipofīlā katjona JC-1 (zaļa krāsa) un J-agregāti, kas pārvērsti sarkanā krāsā intramitohonā. 5.b attēlā parādīti JC-1 krāsošanas rezultāti 0,2 ug/mL BPME, kas ievadīts HUVEC ar oksidatīvo stresu, ko izraisa H2O2; rezultāti apstiprināja, ka gandrīz 94 procenti negatīvi lādētu mitohondriju pārveidoja lipofīlo katjonu JC-1(zaļā krāsa) sarkanās krāsas J-agregātos, salīdzinot ar 0,1 ug/ml BPME (61,4 procenti) ārstēšanu. vai

H O izraisīts oksidatīvais stress HUVEC (2 procenti). Tika novērots, ka mitohondriju membrānas potenciāls (MMP) ir augstāks ar BPME apstrādātajām šūnām, salīdzinot ar atsauces zāļu kvercetīnu.

3.4. FACS-assistēta mitohondriju membrānas potenciāls (△pm; BD MitoScan) un aneksīna V/apoptozes analīze HUVECs

Figure 6 shows the mitochondrial membrane potential capacity in BD MitoScan analysis after 0.2 ug/mL of BPME treatment of normal HUVECs and HUVECs with oxidative stress induced by H>O, mēs atklājām, ka 0,2 ug/ml BPME apstrādes palielināja MMP(Aum) līdz 92,7 procentiem ± 3,7 procentiem, salīdzinot ar HUVEC, kas tika ārstēti tikai ar HO2 (27,9 procenti ±7,2 procenti). Turpretim ar kvercetīnu apstrādātajām šūnām MMP (Aum) palielinājās par 41,4 procentiem ± 1,6 procentiem, salīdzinot ar HUVEC, kas apstrādātas tikai ar BPME un H2O2 vai H2O2.

3.5. Gēnu ekspresijas līmeņu kvantitatīva noteikšana HUVEC

Oksidatīvais stress (LPO3), antioksidants (NOS-3, Nrf-2, GSK-3 un GPX), iekaisumu veicinošs (IL-1, TNF-, NF-joslas TLR{ {7}}), ar asinsvadu iekaisumu (VCAM, ICAM, EDN, eNOS) saistītie un VEGF mRNS ekspresijas līmeņi tika kvantificēti transportlīdzekļa kontrolē, 0.1 un 0.2 ug/ml Ar BPME un kvercetīnu (10 μM) apstrādāti HUVEC pēc 48 stundām (8. attēls). Mēs ievērojami atklājām (lpp<0.001) increased="" levels="" of="" lpo,="" nos-3,="" and="" nf-kb.il-1.tnf-α,="" vcam,="" icam,="" edn,="" and="" enos="" expression="" and="" decreased="" nrf-2,="" gsk-3β,="" and="" gpx="" levels="" in="" ho,-induced="" huvecs.="" treatment="" with="" 0.2="" ug/ml="" of="" bpme="" significantly="" decreased="" oxidative="" stress="" and="" vascular="" inflammation="" and="" increased="" antioxidant="" factor-related="" mrna="" expression="" when="" compared="" with="" oxidative-stressed="" huvecs.="" vegf="" expression="" levels="" showed="" a="" significant="" two-fold="" increase="" in="" 0.2="" ug/ml="" of="" bpme-treated="" cells="" only="" when="" compared="" to0.1="" ug/ml="" of="" bpme.="" vegf="" expression="" was="" not="" detected="" in="" huvecs="" with="" oxidative="" stress="" induced="" by="" h2o2.="" the="" observed="" effect="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" 0.1="" ug/ml="" bpme="" or="" quercetin="" (10="">

4. Diskusija

Ekstracelulārā vai intracelulārā stresa gadījumā reaktīvo skābekļa sugu (ROS) biopieejamība pārspēj antioksidantu aizsardzību, un oksidatīvais stress izjauc redokssignalizāciju un kontroli [31]. Oksidatīvā stresa attīstība ir saistīta ar hronisku traucējumu patoģenēzēm, piemēram, neirodeģeneratīvām slimībām, diabētu un aterosklerozi. Piemēram, oksidatīvais stress izraisa endotēlija disfunkciju un veicina sistēmisku iekaisumu un makrofāgu piesaisti [32]. Aktivētās imūnās šūnas migrē uz asinsvadu sistēmu un atbrīvo citokīnus un ķemokīnus, kas saistīti ar vazokonstrikciju un gludo muskuļu šūnu asinsvadu remodelāciju un iekaisumu, kas ietekmē asinsvadu gludās muskulatūras šūnas un asinsvadu sieniņu [33]. Paaugstināts asinsvadu oksidatīvais stress beidzas ar asinsvadu bojājumiem, gludo muskuļu šūnu stīvumu un strukturālām elastīna anomālijām. Turklāt asinsvadu oksidatīvais stress ir stimulēts citos patoloģiskos apstākļos, piemēram, viscerālā aptaukošanās vai aterosklerozes gadījumā, jo palielinās NADPH oksidāzes (NOX-2) aktivitāte perivaskulārajos taukaudos [34]. Asinsvadu oksidatīvais stress izraisa galvenās epiģenētiskās izmaiņas, kas notiek novecošanas laikā, un tas beidzas ar agrīnu novecošanas procesu [35].

ROS veidošanās un oksidatīvā stresa attīstība bioloģiskajā sistēmā lielā mērā ir atkarīga no mitohondriju disfunkcijas, papildus NOX-2, endotēlija ksantīna oksidāzei, nesaistītai eNOS un lipoksigenāzei [36]. Diētisko līdzekļu antioksidanta īpašības var neitralizēt ROS veidošanos, palielinot antioksidantu spēju [26]. Ginkgo Biloba ekstrakts aizsargā pret aterosklerozes attīstību, samazinot ROS veidošanos un lipoksigenāzes aktivitāti OxiLDL izraisītas endotēlija disfunkcijas gadījumā [37]. Turklāt dažādiem fenola savienojumiem un flavanoīdiem no ēdamiem augiem un graudiem ir īpašība novērst ROS un lipīdu peroksidāciju [38]. Biešu mizas (Beta vulgaris) metanola ekstraktam piemīt antioksidanta potenciāls, jo tajā ir daudz šķiedrvielu, antocianīnu un flavonoīdu, piemēram, viteksīna un betanīna [39]. Šajā pētījumā BPME tika izvēlēts, lai identificētu no mitohondriju atkarīgo mehānisko pieeju, lai atklātu tās ietekmi uz mitohondriju membrānas potenciālu, LPO slāpēšanu un ar asinsvadu iekaisumu saistīto mRNS ekspresijas līmeņu inhibīciju.

MTT tests apstiprināja, ka BPME ievērojami palielināja šūnu proliferāciju, ko apstiprina palielinātā kodola integritāte PI krāsošanā ar efektīvu devu {{0}},2 ug/mL BPME, salīdzinot ar pārbaudīto 0. 1 ug/ml BPME. Efektīvas devas ar zemu koncentrāciju un visaugstāko aktivitāti noteikšanu var uzskatīt par fizioloģiski drošu. Mēs atklājām JC-1 fluorescences mikroskopisku krāsojumu, un mitohondriju membrānas potenciāls tika atjaunots gan normālos, gan H O izraisītos ārēji stimulētos oksidatīvā stresa izraisītos HUVEC pēc 0,2 ug/ml BPME apstrādes. Mitohondriju disfunkcija maina oksidatīvo fosforilāciju, kas nespēj pārveidot skābekļa (O, .-) radikāļus par H, O un H, Oby glutationa peroksidāzi. Nepietiekamas ROS detoksikācijas vai nekontrolētas ROS ražošanas dēļ palielināts mitohondriju oksidatīvais stress ir saistīts ar aterosklerozi [40]. Biešu mizas ekstrakti efektīvi atjaunoja mitohondriju membrānas potenciālu, kas veiksmīgi palielināja ROS detoksikāciju un H2O2 veidošanos. Aneksīna V / PI krāsošanas analīze apstiprināja, ka ārstēšana ar BPME saglabāja dzīvotspējīgo šūnu procentuālo daudzumu un uzlaboja šūnu proliferācijas stadiju gan normālos HUVEC, gan HUVEC ar oksidatīvo stresu, ko izraisīja H O. Šajā kontekstā Choo et al. [41] apstiprināja, ka pēc pārmērīga ROS vai eksogēna H O ģenerēšanas išēmiskajā vietā transplantētās mezenhimālās cilmes šūnas (MSC) var pasliktināt pašproliferāciju un vairāku līniju spēju. Reģeneratīvajā medicīnā asinsvadu gludās muskulatūras šūnas ir galvenie saraušanās tonusa artēriju regulatori, uzturot artēriju perifēro pretestību, asinsspiediena regulatorus, asins plūsmu un artēriju labošanu [42]. Turklāt vecuma izraisīta EC fenotipa modulācija ir saistīta ar samazinātu šūnu kontraktilitāti un palielinātu šūnu novecošanos. Pastāvīga stresa vai samazinātas mehāniskās jutības dēļ novecojušās gludās muskulatūras šūnās tiek konstatēta samazināta mikrovides signālu adaptācija[43]. Šie rezultāti apstiprināja, ka BPME ārstēšana saglabāja dzīvotspējīgu šūnu populāciju, par ko liecina angiogēzes spēja.

Identificētā BPME proliferācijas spēja uz HUVEC ir atbalstīta ar LPO ekspresijas samazināšanos un palielinātu antioksidantu gēnu ekspresiju. Sākotnēji ROS un LPO tiek ģenerēti no mitohondriju kompleksa (I un I) un NOX{0}} šūnu proliferācijas vai diferenciācijas laikā [44]. Pārmērīga ROS reaģē un bojā biomolekulas, īpaši mainot genoma DNS integritāti, kas ir būtiska šūnu proliferācijai un funkcijām [45]. Tomēr ir apstiprināts, ka antioksidantu polifenolu, piemēram, epigallokatehīna un tokoferola, uzņemšana ar uzturu aizsargā šūnas no oksidatīvā stresa un palielina proliferācijas spēju [46]. Mūsu pētījumā LPO mRNS ekspresijas līmenis samazinājās, un tika konstatēts, ka NOS-3, Nrf-2 un eNOS palielinājās divas reizes HUVEC ar oksidatīvo stresu, ko izraisīja Hoo. eNOS ir dominējošā NOS izoforma, kas ir atbildīga par lielāko daļu NO produktu gludās muskulatūras šūnās un asinsvadu audos. NĒ. paplašina visu veidu asinsvadus un aizsargā trombocītu agregāciju un leikocītu adhēziju EC[47]. Līdz šim ir bijuši daudzi pretrunīgi ziņojumi par sirds un asinsvadu riska faktoriem, un endotēlija disfunkcija ir saistīta ar samazinātu vai palielinātu eNOS ekspresiju [48]. Paaugstināta eNOS ekspresija tika novērota pēc asinsvadu slimībām, kas, iespējams, ir pārmērīgas H-Oz ražošanas sekas. O2-7, dismutācijas produkts, var palielināt eNOS ekspresiju, izmantojot transkripcijas un pēctranskripcijas mehānismus [49]. Asinsvadu slimības patoģenēzi pavada paātrināta NO degradācija. pēc reakcijas ar O2-7 un, visbeidzot, ONOO- formu, kas noved pie eNOS atsaistes un NOX enzīma disfunkcijas [50]. Oksidatīvo stresu nomāc antioksidantu enzīmi, un pēc ārstēšanas ar BPME ir paaugstināts GSK-3 un GPX mRNS līmenis. BPME satur vairākas bioloģiski aktīvas fitoķīmiskas vielas, tostarp betalaīnus, flavonoīdus, polifenolus, terapeitiskos enzīmus, askorbīnskābi, dehidroaskorbīnskābi (DHAA) un neorganisko nitrātu (NOg), un tie var būt iesaistīti HUVEC antioksidantu kapacitātes regulēšanā. Šajā kontekstā Cha et al. (2014) [51] ziņoja, ka hlorogēnskābe efektīvi aizsargā pret oksidatīvā stresa izraisītiem DNS bojājumiem cilvēka keratinocītos.

Endotelīns -1 (Edn-1), no endotēlija iegūts vazokonstriktors, veic gludo muskuļu šūnu migrāciju un darbojas kā antiapoptotisks faktors šūnās ar slāpekļa oksīda izraisītu stresu[52,53]. Asinsvadu remodelācijas, migrācijas, proliferācijas un ekstracelulārās matricas uzkrāšanās procesus stimulēja gan Edn-1, gan NO [54,5]. Mēs novērojām palielinātu Edn-1 ekspresiju pēc BPME apstrādes HUVEC ar oksidatīvo stresu. Pēc oksidatīvā stresa vai LPO uzkrāšanās asinsvadu iekaisuma agrīnā stadija ir leikocītu saķere ar endotēlija gludo muskuļu šūnām, kas ir pamanāma išēmijas un aterosklerozes kritiskajiem notikumiem [56]. To nodrošina VCAM un ICAM izteiksmes; to ir stimulējuši daudzi ķīmokīni un ķīmotaksiskie līdzekļi, piemēram, NF-kB, IL-1 un TNF- ekspresijas[57]. IL-1 aktivācijas inhibēšana, kam seko adhēzijas molekulu ekspresija, ir panākta ar uztura fenola savienojumu ellagīnskābi [58]. Ārstēšana ar BPME ārēji stimulētiem HUVEC ar oksidatīvo stresu ievērojami samazināja asinsvadu šūnām raksturīgos proinflammatoriskos faktorus, piemēram, VCAM, ICAM, NF-KB, IL-1 un TNF-x ekspresijas līmeni. Šajā kontekstā Crespo et al. [59] ziņoja, ka kaempferols un kvercetīns inhibēja pro-iekaisuma gēnus, piemēram, VCAM, ICAM, NF-kB un IL-1 ekspresijas, attiecīgi. Kopumā BPME oksidatīvā stresa un ar asinsvadu iekaisumu saistītā gēnu ekspresijas potenciāla kavēšana veicināja asinsvadu šūnu augšanas faktoru ekspresiju un potenciāli veicināja asinsvadu šūnu proliferāciju un augšanu.

5. Secinājumi

Šie atklājumi apstiprina, ka palielināta antioksidantu gēnu ekspresija bija saistīta ar oksidatīvā stresa remdēšanu, palīdzot pārvarēt HUVEC proliferācijas un angiogēzes traucējumus. Melnie ķiploki, kas satur hidroksimetilfurfurolu, nomāc TNF izraisītu monocītu šūnu adhēzijas pie HUVEC iekaisuma efektu un vēl vairāk nomāc ROS veidošanos, VCAM-1 ekspresiju un NF-kB aktivāciju [60]. Turklāt He et al. [61] apstiprināja, ka hidroksimetilfurfurāls spēj pasargāt no hipoksijas. Ir konstatēts, ka biešu miza satur arī flavonoīdus, furānu un antioksidantus, piemēram, 5-hidroksimetilfurfurolu, metilpiruvātu, furfurolu un 2,3-dihidro-3,5- dihidroksi-6-metil-4H-pirān-4-ons; šīs sastāvdaļas ir atbildīgas par paaugstinātu antioksidantu spēju un proinflammatorisko asinsvadu gludo muskuļu šūnu adhēzijas molekulu nomākšanu. Biešu miza ir izmantota kā stimulants antioksidantu baseiniem, lai remdētu peroksidatīvā šūnu stresa ārējo stimulu vai iekšējo patoloģisko stimulu. Mūsu atklājumi liecināja, ka biešu komponenti palīdz samazināt vielmaiņas stresu un iekaisumu HUVEC, kas var būt labvēlīgi asinsvadu šūnu proliferācijai un angioģenēzei.

Šis raksts ir izvilkts no Genes 2021, 12, 1380. https://doi.org/10.3390/genes12091380 https://www.mdpi.com/journal/genes