Aleksandrīnas biomfalārijas bioķīmiskā un histopatoloģiskā reakcija uz RIPEX (augu augšanas regulatoru)Ⅰ

Abstrakts

Fons

Augu augšanas regulatorus plaši izmanto lauksaimniecībā augu augšanas un nogatavošanās paātrināšanai, taču tie apdraud ūdens ekosistēmu. Pašreizējā pētījumā tika novērtēta subletāla iedarbība uz RIPEX 48% EK koncentrāciju (8 un 16 µL/L) uz oksidatīvā stresa parametriem, dzimumhormoniem, imūnpotenciālajiem enzīmiem, diferenciālo hemocītu skaitu un gremošanas dziedzeru un ovotestu histopatoloģiju. Biomphalaria alexandrina gliemeži.

Noklikšķiniet, lai cistanche herba par testosteronu

Rezultāti

RIPEX iedarbība izraisīja vispārēju superoksīda dismutāzes un glutationa-S-transferāzes aktivitāšu pieaugumu B. Aleksandrīnā. Tomēr ekstrēma RIPEX iedarbība kavē SOD aktivitāti gliemežiem. Malondialdehīda aktivitāte liecināja par B. Alexandrina palielināšanos, kas tika pakļauta abām koncentrācijām pēc visiem iedarbības periodiem. RIPEX arī izraisīja ievērojamu testosterona līmeņa paaugstināšanos gliemežiem, kas pakļauti 16 µL/L, tomēr tas samazināja hormonu līmeni gliemežiem, kuri 7 dienās bija pakļauti 8 µL/L. Attiecībā uz estradiolu tika novērots ievērojams pieaugums pēc 3 dienu iedarbības līdz 16 µl/L un pēc 7 dienām pēc iedarbības līdz 8 µl/L. RIPEX iedarbība arī palielināja mieloperoksidāzes un adenozīndeamināzes enzīmu aktivitāti gliemežu gremošanas dziedzeros. Tas palielināja atklāto gliemežu kopējo hemocītu skaitu, kā arī granulocītu skaitu. Gliemežu gremošanas dziedzeri un ovotestis uzrādīja patoloģiskas izmaiņas pēc 7 dienu ilgas RIPEX iedarbības.

Secinājumi

Šie atklājumi liecina, ka RIPEX ir toksisks B. Aleksandrīnai un ka šo gliemezi var izmantot kā bioindikatoru vides piesārņojumam ar augu augšanas regulatoriem.

Atslēgvārdi

Biomfalārija aleksandrīna, RIPEX, testosterons, estradiols, mieloperoksidāze, adenozīndeamināze, histopatoloģija

1 Fons

Virszemes ūdeņu agroķīmiskais piesārņojums ir arvien lielāka globāla vides problēma, jo īpaši apgabalos, kur lauksaimniecība strauji paplašinās un intensificējas. Lai mainītu ražas daudzumu un kvalitāti, lai apmierinātu klientu vajadzības, tiek izmantotas dažādas sintētiskas ķīmiskas vielas, piemēram, pesticīdi vai mēslošanas līdzekļi [7, 40]. Augu augšanas veicinātāji ir izplatītas agroķīmiskās vielas daudzās valstīs [18].

Ja šīs ķīmiskās vielas tiek tieši ieelpotas vai patērētas kopā ar piesārņotiem dārzeņiem, tās kaitē cilvēku veselībai [39]. Organofosforu pesticīds etefons (2-hloretilfosfonskābe) ir etilēnu izdaloša sintētiska ķīmiska viela, ko parasti izmanto kā augu augšanas regulatoru (PGR), lai veicinātu ziedu indukciju, augļu nogatavošanos un citas fizioloģiskas reakcijas. Tas ir apstiprināts izmantošanai dažādiem pārtikas, barības, nepārtikas, siltumnīcu stādaudzētavu un dekoratīviem augiem, kas audzēti ārā [3, 50]. Laboratorijas etefona toksicitātes novērtējums parādīja, ka etefons izraisīja Daphnia magna otrās antenas, sensoro saru, astes mugurkaula un rostrum morfometriskas anomālijas, kas izraisīja funkcijas zudumu un nāvi [54].

Abd-El Azeem [1] reģistrēja augšanas ātruma samazināšanos, DNS bojājumus un apoptotiskos efektus gliemežu Deroceras reticulatum gremošanas dziedzeru šūnās pēc iedarbības ar etefonu. Daudzi autori apstiprināja Etefona toksicitāti žurkām un putniem [2, 17, 55]. Turklāt etefona iedarbība pelēm izraisīja genotoksicitāti, oksidatīvo stresu un reproduktīvo toksicitāti [16]. Teratogenitāte un dzimumdziedzeru sistēmas disfunkcija pelēm ir saistīta arī ar etefona iedarbību [2, 16]. Ir arī pierādīts, ka etefons ir imūntoksisks, tam ir mutagēna iedarbība [26], tas palielina oksidatīvo stresu un samazina dezoksiribonukleīnskābes un ribonukleīnskābes koncentrāciju [4].

Etefons ūdenstilpēs var apdraudēt ūdens faunu; tomēr datu par tā ietekmi uz ūdens organismiem ir maz. Lai noteiktu augu augšanas hormonus ūdens sistēmās, ir izmantotas vairākas ūdens sugas. Tomēr dažus no šiem organismiem ir sarežģīti manipulēt un uzturēt laboratorijā, tāpēc tos ir grūtāk izmantot ekotoksikoloģiskajos novērtējumos [54]. Ūdens mīkstmieši, tostarp gliemeži, pēdējā laikā ir ieguvuši uzmanību kā testa organismi, jo ir nepieciešams izstrādāt bezmugurkaulnieku modeļus ūdens piesārņotāju vides monitoringam [21, 45]. Gliemeži ir visizplatītākā mīkstmiešu grupa ūdens sistēmās. Gliemeži ir mazāk ekspluatējoša alternatīva augstākiem mugurkaulniekiem kā bioindikatori, jo tos var izmantot dažādos eksperimentos, nemeklējot ētisku apstiprinājumu, un to iegūšana un uzturēšana ir lēta [13].

Šajā ziņā Biomphalaria alexandrina gliemezis ir plaši izmantots kā indikatororganisms saldūdens piesārņojumam ar pesticīdiem [29, 30]. Papildus bioindikatora potenciālam šis gliemezis darbojas kā starpsaimnieks Schistosoma mansoni pārnēsāšanai [35]. Tāpēc agroķīmiskās koncentrācijas vidē var ietekmēt šistosomiāzes pārnešanu, tieši un netieši ietekmējot starpsaimnieka un parazītu blīvumu [27]. Šīs izmeklēšanas mērķis bija izpētīt subletālās iedarbības ietekmi uz augu augšanas regulatoru RIPEX 48% EC (etefona tirdzniecības nosaukums, 2-hloretilfosfonskābe) uz dažādiem B. alexandrina bioķīmiskiem, imunoloģiskiem un histoloģiskiem aspektiem. gliemeži kā bioindikatora organisms.

2 Metodes

2.1 Testa organisms

Biomphalaria alexandrina gliemeži tika savākti no Manzalah ezera, kas atrodas El-Matareya, Dakahlia gubernatorā, Ēģiptē (31 grāds 11′ N 32 grāds 2′ E) un tika turēts labi gāzētā krāna ūdenī nemainīgā 20 grādu temperatūrā. Viņus katru dienu baroja ar svaigām salātu lapām. Pēc 4 nedēļu ilgas apkopes laboratorijas apstākļos turpmākajos eksperimentos tika izmantoti veseli nobrieduši gliemeži (čaulas diametrs 10–12 mm).

2.2. Eksperimentālais materiāls un iedarbības apstākļi

Augu augšanas regulators RIPEX (šķīduma forma, kas satur 48 procentus etefona [2- hloretilfosfonskābes (C2H6ClO3P)] un 52 procentus inertu sastāvdaļu) tika iegādāts no Chema Industries (New Nubaria pilsēta, Behira, Ēģipte; reģistrācijas licences Nr. . 1840). Tika sagatavota virkne koncentrāciju. Tika eksponētas koku kopijas ar desmit gliemežiem katrā. Pēc 1-dienas iedarbības mirušie gliemeži tika skaitīti un noņemti, un LC50 un LC90 tika aprēķināti, izmantojot sociālo zinātņu statistikas programmatūru (SPSS; IBM Corp. Armonk, NY, ASV).

2.3. Eksperimentālais dizains

Tika izmantotas divas subletālas koncentrācijas, kas attēlo LC10 un LC20 (8 un 16 µL/L). 90 gliemeži tika sadalīti trīs grupās, katrai grupai bija trīs atkārtojumi (desmit gliemeži/atkārtojums): kontroles grupa, 8 µL/L iedarbībai pakļautā grupa un 16 µL/L eksponētā grupa. Ar 1-, 3- un 7-dienu intervāliem gremošanas dziedzerī tika novērtēti oksidatīvā stresa biomarķieri un imūnpotenciālie enzīmi. steroīdu hormoni tika novērtēti Ovotestis. Tika novērtēts diferenciālais hemocītu skaits un gremošanas dziedzeru un ovotestis histoloģija. Bioķīmiskiem pētījumiem 0,5 g audu (gremošanas dziedzeri vai ovotestis) no katras grupas tika homogenizēti 0,5 ml fosfāta buferšķīdumā (pH 6,5), izmantojot stikla homogenizatoru un centrifugēti pie 10, 000 × g, 4 grādiem 10 minūtes. . Iegūtie supernatanti tika izmantoti turpmākajām pārbaudēm.

2.4. Oksidatīvā stresa marķieru noteikšana

2.4.1. Superoksīda dismutāze (SOD, EK 1.15.1.1.)

SOD aktivitāte tika noteikta, izmantojot EnzyChrom™ Superoksīda dismutāzes testa komplektu (Kat. Nr.: ESOD{{0}}; BioAssay Systems, Hayward, CA, ASV) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Audu homogenātu, izmantojot aukstu līzes buferi (50 mM kālija fosfāts, 0,1 mM EDTA un 0,5 procenti Triton X-100), centrifugēja ar ātrumu 12, 000g 5 minūtes 4 grādu temperatūrā. , un supernatants tika savākts SOD noteikšanai [43]. SOD aktivitāte tika mērīta pie optiskā blīvuma (OD) pie 440 nm.

2.4.2. Glutationa S transferāze (GST, EC 2.5.1.18)

Šis enzīms katalizē GSH konjugāciju ar {{0}}hloru-2, 4-dinitrobenzolu (CDNB). To mēra spektrofotometriski pie 340 nm. Reakcijas maisījums satur kālija fosfāta buferšķīdumu 0,1 M, pH 6,5, GSH, kas izšķīdināts kālija fosfāta buferšķīdumā (140 mg/100 ml), un CDNB 4 mg/ml etilspirtā. Viena enzīma aktivitātes vienība ir definēta kā fermenta daudzums, kas katalizē 1 μmol S-konjugāta veidošanos minūtē [11].

2.4.3. Malondialdehīds (MDA)

Malondialdehīds veselos homogenātos tika noteikts kā tiobarbitūrskābes reaktīvās vielas (TBARS) saskaņā ar Ohkawa et al. standarta metodi. [37]. Reakcijas maisījums ietvēra 0,1 ml audu homogenāta, vienādu tilpumu nātrija dodecilsulfāta šķīduma, 0,75 ml etiķskābes, 0,75 ml tiobarbitūrskābes, un 0,3 ml destilēta ūdens. Šīs sastāvdaļas sajauca virpulī un 1 stundu inkubēja verdoša ūdens vannā, pēc tam atdzesēja līdz istabas temperatūrai. Desmit 0,5 ml destilēta ūdens un 2,5 ml n-butanola pievienoja katrai mēģenei un enerģiski sajauca ar virpuli, pēc tam rotēja centrifūgā ar ātrumu 2500 × g 10 minūtes. Absorbcija tika nolasīta pie 532 nm.

2.5. Hormonu noteikšana

2.5.1. Testosterons

Testosterons tika noteikts, izmantojot testosterona ar enzīmu saistīto imūnsorbcijas testu (ELISA) komplektu (kat. Nr.: ADI-900-065; Enzo Life Sciences, NY, ASV). Testosterons ir galvenais androgēns, kas ietekmē gan primāro, gan sekundāro seksuālo attīstību. dzimumtieksme. 100 µL standarta šķīdinātāja (testa buferis 3 vai audu kultūras barotne) tika pipeti ievadīts nespecifiskās saistīšanas un maksimālās saistīšanās (0 pg/ml standarta) iedobēs. Pēc tam 100 µL standarta #1 līdz #5 attiecīgajās iedobēs. Paraugu (100 µL) ar pipeti ievadīja attiecīgajās iedobēs un 50 µL testa bufera 3 nespecifiskās saistīšanas iedobēs. Katrā iedobē tika pievienoti arī 50 µL dzeltenas antivielas, izņemot tukšo, kopējās aktivitātes un nespecifiskās saistīšanās iedobes. Plāksnes inkubācija istabas temperatūrā uz plates kratītāja 1 stundu ar ātrumu 500 apgr./min. Pēc tam katrā iedobē tika pievienots 50 µL zilā konjugāta, izņemot kopējo aktivitāti un tukšās iedobes. Pēc iedobju iztukšošanas no satura mazgāšana tika veikta, katrai iedobei pievienojot 400 µL mazgāšanas šķīduma 3 reizes. Kopējās aktivitātes iedobēm tika pievienots zils konjugāts (5 µL), un katrā iedobē tika pievienots 200 µL p-nitrofenilfosfāta šķīduma un inkubēts 37 grādu temperatūrā 1 stundu bez kratīšanas. Plāksnes nolasīšana pie 405 nm tika veikta pēc tam, kad katrā iedobē tika pievienots 50 µL stop šķīduma [12, 48].

2.5.2. Estradiols

Estradiols tika noteikts, izmantojot estradiola ELIZA komplektu (kat. Nr.: 501890; Cayman Chemical, Mičigana, ASV) saskaņā ar ražotāja protokoliem. Šīs reakcijas princips ir balstīts uz to, ka estradiola acetilholīnesterāzes (AChE) marķiera koncentrācija ir nemainīga, bet dabiskā estradiola koncentrācija mainās, tāpēc estradiola acetilholīnesterāzes (AChE) marķiera daudzums, kas saistās ar estradiola antiserumu, ir apgriezti proporcionāls dabiskā estradiola koncentrācijai. akā. 100 µL ELISA buferšķīdums tika pievienots nespecifiskās saistīšanas un maksimālās saistīšanās iedobēm. 50 µL no 8. caurules pievieno abām zemākajām standarta iedobēm (8. standarts) un 50 µL no 7. mēģenes katrai nākamajai standarta iedobei (7. standarts). Katrai iedobei tika pievienots paraugs (50 µL). Estradiola AChE marķieris (50 µL) tika pievienots katrai kopējai aktivitātei un tukšajām iedobēm. Pēc tam katrā iedobē tika pievienots estradiola ELISA antiserums (50 µL), izņemot kopējo aktivitāti, nespecifisko saistīšanos un tukšās iedobes. Pēc orbitālās kratītāja inkubācijas (2 stundas istabas temperatūrā) absorbcija tika mērīta pie 414 nm [52].

2.6. Imūnpotenciālo enzīmu noteikšana

2.6.1. Mieloperoksidāze (MPO, EK 1.11.2.2.)

Viena MPO aktivitātes vienība tiek definēta kā fermenta daudzums, kas hidrolizē substrātu un ģenerē taurīna hloramīnu, kas 25 grādu temperatūrā patērē 1.0 μmol TNB minūtē. MPO tika noteikts, izmantojot mieloperoksidāzes kolorimetriskās aktivitātes testa komplektu (kat. Nr.: MAK068; Sigma-Aldrich, MO, ASV). Absorbcija tika mērīta pie 412 nm.

2.6.2. Adenozīna deamināze (ADA, EK 3.5.4.4.)

ADA ir enzīms, kas katalizē adenozīna un 2'-deoksiadenozīna pārvēršanos par inozīnu un 2'-deoksiinozīnu. ADA tika noteikta saskaņā ar tehniskā biļetena adenozīna deamināzes aktivitātes noteikšanas komplekta principiem (Kat. Nr.: MAK400; Merck KGaA, Darmštate, Vācija). Viena adenozīna deamināzes vienība ir fermenta daudzums, kas hidrolizē adenozīnu, iegūstot 1,0 μmol inozīna minūtē 37 grādu temperatūrā. Reaģenti ir 1 × ADA testa buferis (41 μL), ADA pārveidotājs (2 μL), ADA attīstītājs (2 μL) un ADA substrāts (5 μL).

2.7 Diferenciālais hemocītu skaits

Hemolimfa tika savākta no gliemeža (kontrole, eksponēta) saskaņā ar Sminia [47]. Pēc tam, kad ar Pastēra pipeti pieskārās galvai-pēdai, gliemezis bija spiests dziļi ievilkties savā čaulā un izspiest hemolimfu, kas tika savākta diferenciālam hemocītu skaitam. Izkliedēšanai uz mikroskopa priekšmetstikliņa tika uzsmērēta hemolimfa. Pēc fiksācijas 99,8% metanolā 5 minūtes priekšmetstikliņu pagrieza 45 grādu leņķī žāvēšanai istabas temperatūrā un 20 minūtes krāsoja ar Giemsa traipu. Tika noteikts, ka hemocītu diferenciācija ir proporcionāla 100 skaitīšanai.

2.8. Histoloģiskie pētījumi

Histoloģiskie izmeklējumi tika veikti pēc 7 dienu ilgas iedarbības ar 8 un 16 µL/L RIPEX. Gremošanas dziedzeri un ovotestis tika izgriezti un nekavējoties fiksēti Bouin᾿s šķidrumā. Pēc 1 dienas ilgas fiksācijas paraugi tika dehidrēti caur virkni spirtu un notīrīti ksilolā. Tika izgatavoti parafīna vaska bloki [42]. Desmit sektas. (5–7 μm biezums) tika sagriezti un iekrāsoti ar hematoksilīnu un eozīnu (Mayer's H un E). Pēc krāsošanas sekoja kārtīga mazgāšana ar krāna ūdeni. Histoloģiskās sekcijas tika fotografētas, izmantojot automatizētu fotokameru (Optika, Itālija).

2.9. Statistiskā analīze

Dati tika izteikti kā vidējā±standarta novirze un analizēti ar sociālo zinātņu statistisko programmatūru (SPSS; IBM Corp. Armonk, NY, ASV). Divvirzienu ANOVA dispersijas analīze tika izmantota, lai noteiktu atšķirības starp kontroles un iedarbības grupām, starp dažādām koncentrācijām un iedarbības laika punktiem. Nozīmīguma līmenis tika iestatīts uz p Mazāks vai vienāds ar 0.05.

Cistanche mehānisms pastiprina testosterona efektu

Ir konstatēts, ka Cistanche paaugstina testosterona līmeni vairākos veidos. Pirmkārt, tas satur savienojumus, kas pazīstami kā ehinakozīds un akteozīds, un ir pierādīts, ka tie uzlabo luteinizējošā hormona (LH) veidošanos hipofīzē. LH stimulē Leidiga šūnas sēkliniekos ražot testosteronu. Cistanche satur arī polisaharīdus un feniletanoīdu glikozīdus, kuriem ir pierādīts, ka tiem piemīt antioksidanta un pretiekaisuma īpašības. Tas var palīdzēt samazināt oksidatīvo stresu un iekaisumu sēkliniekos, kas var pasliktināt testosterona ražošanu. Turklāt ir konstatēts, ka Cistanche palielina testosterona sintēzē iesaistīto gēnu ekspresiju un samazina enzīmu, kas noārda testosteronu, aktivitāti, piemēram, {{1} }alfa-reduktāze. Kopumā tiek uzskatīts, ka šo mehānismu kombinācija veicina Cistanche testosterona līmeni paaugstinošo iedarbību.

Hoda H. Abdel-Azeem1*, Azza H. Mohamed1 un Mohamed R. Habib2