Īsa sevoflurāna ieelpošana var samazināt glia rētu veidošanos pēc hipoksiskas-išēmiskas smadzeņu traumas jaundzimušo žurkām 1. daļa

Abstrakts

Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka sevoflurāna pēckondicionēšana var nodrošināt neiroaizsardzību pēc hipoksiskas-išēmiskas traumas un uzlabot mācīšanos un atmiņas funkciju grauzēju smadzeņu attīstībā.

Hipoksiski išēmisks ievainojums attiecas uz patoloģisku stāvokli, ko izraisa smadzeņu išēmija, hipoksija, vielmaiņas traucējumi un nervu šūnu bojājumi, ko izraisa sirds un asinsvadu un smadzeņu asinsvadu sistēmas traucējumi. Līdz ar sociālo progresu un dzīvesveida izmaiņām hipoksiski-išēmisks ievainojums kļūst arvien izplatītāks. Šis stāvoklis var nodarīt daudz ļaunuma cilvēka veselībai, tostarp ietekmēt intelektu un atmiņu.

Lai gan hipoksija un išēmija var izraisīt smadzeņu darbības pasliktināšanos, tas nenozīmē, ka atmiņa tiks negatīvi ietekmēta. Gluži pretēji, mēs varam uzlabot atmiņu un palielināt smadzeņu efektivitāti, izmantojot pareizās metodes. Šeit ir daži veidi, kā uzlabot atmiņu:

1. Veselīgs uzturs: diētas ietekme uz atmiņu ir ļoti svarīga. Pārtika, kas bagāta ar olbaltumvielām, vitamīniem un minerālvielām, var palīdzēt uzturēt veselīgu nervu sistēmu un domāšanas funkciju.

2. Vingrojiet vairāk: fiziskie vingrinājumi var veicināt asinsriti, palielināt skābekļa plūsmu, uzlabot ķermeņa imunitāti un samazināt slimību risku. Izmantojot vingrinājumus, jūs varat uzlabot savu atmiņu.

3. Stiprināt pašapziņu: Pārliecība ir svarīgs faktors cilvēka atmiņā. Ja uzskatāt, ka varat izpildīt noteiktu uzdevumu, jūs viegli sasniegsit vēlamos rezultātus, kā arī varat efektīvi uzlabot atmiņu.

Var redzēt, ka hipoksiski išēmisks ievainojums nav stāvoklis, kas neizbēgami kaitēs cilvēka atmiņai. Kamēr mēs apgūstam pareizās metodes un rūpīgi rūpējamies par savām smadzenēm, mēs varam pieņemt veselīgu nākotni ar pozitīvu attieksmi. Var redzēt, ka mums ir jāuzlabo atmiņa, un Cistanche deserticola var ievērojami uzlabot atmiņu, jo Cistanche deserticola ir tradicionāls ķīniešu ārstniecības materiāls, kam ir daudz unikālu efektu, no kuriem viens ir atmiņas uzlabošana. Cistanche deserticola iedarbīgumu nodrošina vairākas tajā esošās aktīvās sastāvdaļas, tostarp miecskābe, polisaharīdi, flavonoīdu glikozīdi utt. Šīs sastāvdaļas var veicināt smadzeņu veselību, izmantojot dažādus ceļus.

Noklikšķiniet uz zināt 10 veidus, kā uzlabot atmiņu

Klasiskais Rice-Vannucci modelis tika izmantots, lai izraisītu hipoksisku-išēmisku ievainojumu, un jaundzimušas (7. pēcdzemdību diena) žurkas tika ārstētas ar 2, 4% sevoflurānu 30 minūtes pēc hipoksiski išēmiskas traumas.

Mūsu rezultāti parādīja, ka sevoflurāna pēckondicionēšana ievērojami uzlaboja žurku mācīšanās un atmiņas funkciju, samazināja astrogliozi un glialscar veidošanos, palielināja dendritisko muguriņu skaitu un aizsargāja hipokampa histomorfoloģiju. Mehāniski sevoflurāna pēckondicionēšana samazināja fon Hipela-Lindau hipoksijas izraisītā faktora -1 ekspresiju un palielināja DJ-1 ekspresiju.

1,52 ug hipoksijas izraisītā faktora -1 inhibitora YC-1 (Lificiguat) injicēšana kreisajā sānu kambarī 30 minūtes pirms hipoksiski išēmiska ievainojuma mainīja sevoflurāna izraisīto neiroprotekciju. Šis atklājums liecina, ka sevoflurāns var efektīvi atvieglot astrogliozi hipokampā un samazināt mācīšanās un atmiņas traucējumus, ko izraisa glia rētas veidošanās pēc hipoksiski išēmiskiem bojājumiem.

Pamatmehānisms var būt saistīts ar paaugstinātu DJ-1 ekspresijas regulēšanu, hipoksijas izraisītā faktora-1 samazinātu ubikvitināciju un stabilizētu hipoksijas izraisītā faktora-1 ekspresiju. Šo pētījumu 2016. gada 9. novembrī apstiprināja Ķīnas Medicīnas universitātes laboratorijas dzīvnieku aprūpes komiteja Ķīnā (apstiprinājuma Nr. 2016PS337K).

Atslēgas vārdi: smadzeņu traumas; smadzenes; Centrālā nervu sistēma; in vivo; ievainojums; modelis; plastiskums; žurka; atveseļošanās; reģenerācija; remontsĶīnas bibliotēkas klasifikācijas Nr. R453; R741; R614.{3}}.

Ievads

Jaundzimušo hipoksiski išēmiskā encefalopātija (HIE) ir bieži sastopama komplikācija jaundzimušo periodā, ko izraisa daudzi faktori, piemēram, jaundzimušā asfiksija, intrauterīnās ciešanas un hialīna membrānas slimība (Douglas-Escobar and Weiss, 2015; Barkhuizen et al., 2017).

HIE ir galvenais zīdaiņu nāves cēlonis un primārais neiroloģisko seku avots (Edwards et al., 2010; Descloux et al., 2015). Deviņdesmit procentiem HIE izdzīvojušo ir ilgstoša neiroloģiska disfunkcija, piemēram, mācīšanās, kognitīvās un motoriskās disfunkcijas un epilepsija (Doi et al., 2012; Davies et al., 2019). Pašreizējā HIE ārstēšana galvenokārt ir vērsta uz simptomātisku ārstēšanu, tostarp mehānisko ventilāciju, hipotensijas korekciju, glikozes papildināšanu un šķidruma uzņemšanas ierobežošanu, ja nepieciešams.

Tomēr ir nepieciešama efektīva ārstēšana, kas spēj novērst vai samazināt ilgstošus smadzeņu bojājumus (Stankowski un Gupta, 2011; Davidson et al., 2015). Kā galvenā mācīšanās un atpazīšanas sastāvdaļa ir hipokamps, tostarp dentate gyrus (DG) , CA1 un CA3 reģioni, piedalās perifērās informācijas pārveidošanā un integrēšanā nervu centros (Morris et al., 2012; Jung et al., 2020).

Hipokampam ir paaugstināta jutība pret hipoksiski išēmiskiem (HI) bojājumiem, kas var izraisīt hipokampu neironu apoptozi, stimulēt pārmērīgu reaktīvo gliozi un izraisīt glialscar veidošanos (Hopkins un Haaland, 2004; Wang et al., 2012). Astrocītu proliferācijai ir izšķiroša nozīme, lai noslēgtu infarkta vietu, pārveidotu hipokampa struktūru un īslaicīgi kontrolētu lokālās imūnās atbildes reakcijas akūtās fāzes laikā (Rolls et al., 2009).

Tomēr hipertrofija un glia rētu veidošanās veicina novirzes no neiroģenēzes, kavē dendrītu mugurkaula augšanu un kavē sinapses formu, vēl vairāk pasliktinot mācīšanās un atpazīšanas funkcijas (Yiuand He, 2006; Wanner et al., 2008; Burda un Sofroniew, 2014; Pekny et al. , 2014; Shi et al., 2017).

Glija fibrilārais skābais proteīns (GFAP) un hondroitīna sulfāta proteoglikāni, piemēram, neirokāns, ir patoloģiski astrogliozes un glialrētu marķieri, kuru ekspresiju var regulēt augsti aktivizēti astrocīti (Pekny un Nilsson, 2005; Choudhuryand Ding, 2016). Tādējādi astrogliozes un glialu rētu inhibīcija var būt terapeitisks mērķis HIE un tā ilgtermiņa neiroloģiskām sekām.

Ir pierādīts, ka sevoflurāna lietošana mazina HI bojājumus grauzējiem. Pētījumos, kas pēta sevoflurāna pēckondicionēšanas (SPC) nozīmi HI bojājumu mazināšanā, palielinot hipoksijas izraisīto faktoru -1 (HIF-1) pieaugušiem grauzējiem un jaundzimušo žurkām, ir identificēti vairāki iespējamie mehānismi (Wang et al., 2019b; Yanget). al., 2019; Du et al., 2020; Liu and Gong, 2020).

Kā galvenais fizioloģiskais hipoksijas sensors HIF-1 ir transkripcijas faktors ar simtiem pakārtotu molekulu, kas iesaistītas ininēmiskās tolerances mehānismos, piemēram, asinsvadu endotēlija augšanas faktors un eritropoetīns (Na et al., 2015). Ir pārbaudīts, ka hipoksiskā pēckondicionēšana samazina astrocītu un mikrogliju aktivāciju pēc HI jaundzimušo žurku smadzenēs (Teo et al., 2015).

Tāpēc mēs izvirzījām hipotēzi, ka HIF-1 var veicināt glia rētu un astrogliozes veidošanos. HIF-1 var konstitutīvi pastāvēt neironos, tādējādi ātri pastiprinot ekspresiju un uzkrājoties hipoksijas apstākļos. Tomēr, kad skābeklis atgriežas normālā stāvoklī, HIF1 ekspresiju nevar uzturēt pietiekami augstā līmenī, lai nepārtraukti radītu neiroprotektīvu efektu, jo notiek no skābekļa atkarīga noārdīšanās ar prolilhidroksilāzes proteīniem un sekojoša ubikvilitācija ar fon Hipela-Lindau (VHL) proteīniem (Berra et al., 2003; Zhang et al., 2018).

Tiek ziņots, ka DJ-1 (kodē Park7) ir neiroprotektīvs proteīns, īpaši oksidatīvos apstākļos (Aleyasin et al., 2007, 2010). VHL proteīns fiziski mijiedarbojas ar DJ-1, ko nosaka objektīvs masas spektrometrijas ekrāns un apstiprināts Parkinsona slimības (PD) modelī. Turklāt Parsanejad et al. (2014) parādīja, ka DJ-1 inhibē no VHL atkarīgo visuresamību un stabilizē HIF-1 ekspresiju.

Tādējādi mēs izvirzījām hipotēzi, ka sevoflurāns stabilizē HIF-1 proteīnu hipokampā, pārregulējot DJ-1, lai kavētu HIF-1 visuresamību, tādējādi uzlabojot ilgtermiņa mācīšanās un atmiņas funkciju.

Lai izpētītu HIF-1 lomu attiecībās starp sevoflurānu un astrogliozi, mēs izmantojām YC-1 (Lificiguat), HIF-1 selektīvo antagonistu, lai pilnībā inhibētu HIF-1 ekspresiju plkst. pēctranskripcijas līmenī. Šajā pētījumā tika pētīta HIF{5}a nozīme SPC ārstētu HIE jaundzimušo žurku neiroaizsardzībā.

Materiāli un metodes

Dzīvnieki
Pētījumi ar dzīvniekiem tika veikti žurku attīstības sinaptiskajā stadijā, kas sākas 7. pēcdzemdību dienā (P7), kas atbilst cilvēka zīdaiņu augšanas periodam no vēlīnas grūtniecības līdz 3 gadiem pēc dzimšanas (Jevtovic-Todorovic et al., 2003). Septiņas dienas vecas Sprague-Dawley žurkas, kas sver 12–16 g, tika atlasītas no 20 grūsnām žurkām (iegādātas Ķīnas Medicīnas universitātes Šendzjinas slimnīcas laboratorijā, Ķīnā; tēviņu/mātīšu attiecība 1:1).

Visas žurkas varēja brīvi piekļūt ūdenim un barībai, un laboratorijā tās tika uzturētas standarta mitrumā un temperatūrā ar 12-stundu gaismas/tumsas (8:00/20:00) cikliem. Visi eksperimenti ar dzīvniekiem tika veikti saskaņā ar Nacionālo veselības institūtu (Bethesda, MD, ASV) Laboratorijas dzīvnieku kopšanas un lietošanas vadlīnijām.

Ķīnas Medicīnas universitātes Laboratorijas dzīvnieku aprūpes komiteja oficiāli apstiprināja aprakstītos eksperimentus (Šeņjana, Ķīna; apstiprinājuma Nr. 2016PS337K) 2016. gada 9. novembrī.

No 25 grūsnām žurkām tika izvēlētas 249 P7 žurkas un nejauši sadalītas grupās, pamatojoties uz nejaušu skaitļu tabulu (Wang etal., 2019a). Mūsu galīgajā analīzē tika iekļauts 201 jaundzimušais; mirstības līmenis pēc HI ārstēšanas bija 19%.

Šīs 201 jaundzimušās žurkas nejauši tika iedalītas četrās grupās: viltus (n=54), HI (n=54), HI + sevoflurāns (HIS) (n=54) un HIS+ YC{{ 6}} (n=39) grupas. Katrā grupā 24 žurkas tika izmantotas Western blot testam, 5 tika izmantotas imūnhistoķīmijai un Golgi krāsošanai, un 10 tika izmantotas uzvedības testiem. Atlikušās 45 žurkas fiktīvajās, HI un HIS grupās tika izmantotas reversās transkripcijas polimerāzes ķēdes reakcijai (RT- PCR).

Eksperimentāls dizains un anestēzijas iedarbība

Izmantotais HIE modelis tika aprakstīts iepriekš (Zhao etal., 2007; Grandvuillemin et al., 2017). Pamatojoties uz attālumu starp anālo atveri un reproduktīvajiem orgāniem, pēcdzemdību žurku dzimumidentifikācija tika pabeigta. Lai izveidotu HIE modeli, katras P7 žurkas galva tika ievietota caurspīdīgā plastmasas caurulē, kas tika noslēgta ar kokvilnu pirms sevofluranewa izlaišanas (Wang et al., 2019a; Xue et al., 2019).

Katras žurkas kreisā kopējā miega artērija tika pastāvīgi sasaistīta, un starp abām saitēm artērija tika pārgriezta; katra operācija tika pabeigta 5 minūšu laikā. Pēc tam žurkas pamodās bez anestēzijas un tika ievietotas atpakaļ viņu māšu būros uz 2 stundām. SPC ievadīšanai žurkas tika ievietotas caurspīdīgā kamerā (Lingzhi Company, Hangzhou, Ķīna), kas savienota ar asevoflurāna iztvaicētāju; viens kanāls palīdzēja ventilēt, bet otrs nogādāja gāzes paraugu no kameras uz monitoru.

Kambaru vēdināja ar 30% O2 un 70% N2 fiktīvajai grupai 2 stundas, savukārt HI grupai 2 stundas ievadīja 8% O2 un 92% N2. SPC tika noteikts uzreiz pēc HI: 2,4% sevoflurāna (1 minimālā alveolārā koncentrācija) žurkas ieelpoja kamerā ar 30% O2 un 70% N2 atmosfēru un gaisa plūsmas ātrumu 2 l/min 30 minūtes. Apkures baseins stabilizēja temperatūru kamerā pie 37 grādiem.

Zāļu administrēšana

Tieši 30 minūtes pirms HI, kreisajā sānu kambarī tika injicēts 1,52 ug HIF-1 inhibitora (YC1; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ASV) (Paxinos un Franklin, 2013). 5-μLHamilton šļirce (Yingweida Technology, Pekina, Ķīna). Kā aprakstīts iepriekš, YC-1 tika izšķīdināts mākslīgā mugurkaula šķidrumā koncentrācijā 0,304 ug/μL (Shen et al., 2012; Na et al., 2015).

Western blot analīze

P7 žurkas tika anestēzētas ar 2% sevoflurānu, un hipokampu audi tika iegūti no mazuļiem 12, 24 un 48 stundas un 28 dienas pēc operācijas. Pēc ekstrakcijas audi nekavējoties tika novietoti uz ledus.

Kopējie supernatanta proteīni tika izolēti, pievienojot radioimunoprecipitācijas testa līdzekli (Beyotime, Haimen, Ķīna). Olbaltumvielu koncentrācija tika noteikta ar One BCA komplektu (Beyotime).

Pēc tam paraugi tika atdalīti uz 12,5% nātrija dodecilsulfāta-poliakrilamīda gēliem un pārnesti uz nitrocelulozes membrānām. Pēc bloķēšanas ar 5% liellopu seruma albumīna (Sigma-Aldrich) 4 grādu temperatūrā membrāna tika inkubēta ar atbilstošām primārajām antivielām, tostarp anti-gliceraldehīda 3-fosfāta dehidrogenāzi (GAPDH; 1:2000; Cat# 5174S; CellSignaling Technology). , Danvers, MA, ASV), anti-DJ-1 (1:1000;Cat# ab18257; Abcam, Cambridge, UK), anti-VHL (1:5000;poliklonāls; Cat# ab77262; Abcam), anti -HIF-1 (1:900;poliklonāls; Cat# ab2185; Abcam), pret neirokānu (1:200;monoklonāls; Cat# sc-33663; Santa Cruz Biotechnology, Dalasa, Teksasa, ASV) , anti-postsinaptiskā blīvuma proteīns 95 (PSD95; 1:1000; monoklonāls; kat. Nr. 3409S; šūnu signalizācijas tehnoloģija), ar augšanu saistīts proteīns 43 (GAP43; 1:2000; poliklonāls; Cat# 16971-1-AP; Proteintech Biotechnology , Čikāga, IL, ASV) un anti-GFAP (1:5000, poliklonāls, Cat# ab53554; Abcam).

Pēc tam bloti tika inkubēti ar anti-trušu IgG (1:5000; Cat Nr. ZB-2301; Zhongshanjinqiao, Pekina, Ķīna) oranti-peles IgG (1:5000; Cat Nr. ZB-2301; Zhongshanjinqiao) 2 stundas istabas temperatūrā.

Olbaltumvielu bloti tika vizualizēti ar uzlabotiem hemiluminiscences noteikšanas reaģentiem (SuperSignal West Pico; Pierce, Rockford, IL, ASV). Olbaltumvielu joslas tika kvantificētas ar ImageJ programmatūru (Nacionālie veselības institūti). Western blot analīzei dati tika normalizēti atbilstoši GAPDH.

Imūnhistoķīmija

Divdesmit astoņas dienas pēc operācijas žurkām tika ievadīts anestēzijas līdzeklis, izmantojot iepriekš aprakstīto metodi, perfūzijas ar 4% formalīnu, un to smadzenes tika noņemtas, lai iegūtu imunofluorescences krāsojumu.

Smadzenes tika iegremdētas 4% paraformaldehīdā 4 grādu temperatūrā 48 stundas, pēc tam dehidrētas pakāpeniskā etanola sērijā un visbeidzot iestrādātas parafīnā. Pēc tam parafīnā iestrādātie audi tika sagriezti 2.5-μm biezās daļās ar vibratomu, un iegūtās sekcijas tika uzglabātas istabas temperatūrā.

Katras smadzenes tika nepārtraukti sadalītas, un tika atlasītas trīs pārtrauktas smadzeņu sekcijas NeuN (neironu marķieris), GFAP (astrocītu marķieris) un neirokānu (glia rētas marķieris) krāsošanai. Divkāršai marķēšanai audu sekcijas tika inkubētas ar divām jauktām primārajām antivielām, tostarp kazu anti-antivielām. GFAP (1:250; poliklonāls; Cat# ab53554; Abcam), trušu antigēni (1:100; Cat# 12943; Cell Signaling Technology) un/vai peles anti-neirokans (1:200; monoklonāls; Cat# sc{{ 10}};Santa Cruz Biotechnology) 4 grādos nakti mitrinātā kamerā.

Pēc tam sekcijas tika mazgātas ar 0,1 mfosfātu buferšķīdumu un inkubētas 2 stundas istabas temperatūrā ar atbilstošām sekundārajām antivielām, tostarp anti-trušu IgG, kas konjugēts ar Alexa Fluor-594 (1:200;Life). Technologies, Grand Island, NY, ASV), anti-peļu IgG, kas konjugēts ar Alexa Fluor-594 (1:200; Life Technologies), un anti-kazu IgG, kas konjugēts ar fluoresceīna izotiocianātu (1:200; Life Technologies).

Šūnu kodolu pretkrāsošana tika veikta ar 4′,6-diamidino-2-fenilindolu (Beyotime) 5 minūtes.

Iekrāsoto sekciju novērošanai tika izmantots Olympus BX51 mikroskops (OlympusCorporation, Tokija, Japāna). Trīs kreisā hipokampa redzes lauki tika nejauši atlasīti no katras šķēles fotografēšanai. Lai novērtētu kvantitatīvo kolokalizāciju un tādējādi aprēķinātu Mandersa pārklāšanās koeficientu, tika izmantota programmatūra ImageJ.

For more information:1950477648nn@gmail.com