Kalpastatīns novērš angiotenzīna II izraisītus podocītu bojājumus, uzturot autofagiju

lai iegūtu plašāku informāciju:ali.ma@wecistanche.com

Imane Bensāada^1,3, Blēzs Robins^1,3, Joe¨lle Perez², Jans Salemkūrs¹, Anna Čiponta¹, Marine Camus¹,Matilda Lemuāna¹, Lea Guyonnet¹, He´le`ne Lazareth¹, Emanuels Letavernjē², Kerola Henike¹,Pjērs Luiss Tara¹un Olīvija Lenuāra¹

¹Université de Paris, PARCC, Inserma, Parīze, Francija; un²Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, Parīze, Francija

Proteīnūrijas spēcīgā paredzamā vērtība hronisku glomerulāru patoloģiju gadījumā ir stingri noteikta, kā arī angiotenzīna II patogēnā loma, veicinot glomerulārās slimības progresēšanu ar mainītu glomerulu fi-filtrācijas barjeru, podocītu traumu un glomerulu rētu veidošanos. Šeit mēs noskaidrojām, ka hroniska angiotenzīna II izraisīta hipertensija kavējaautofagijaizplūde peles glomerulos. Atg5 (gēns, kas kodē proteīnu, kas saistīts ar autofagiju) dzēšana īpaši podocītos izraisīja paātrinātu dangio tenzīna II izraisītu podocitopātiju, pastiprinātu albuminūriju un glomerulosklerozi. Tas norāda, ka šajā stāvoklī autofagija ir galvenais podocīta aizsardzības mehānisms. Angiotenzīna-II izraisītā kalpaīna aktivitāte podocītos inhibēautofagijaizplūde. Podocīti no pelēm ar endogēnā kalpaīna inhibitora transgēnu ekspresijukalpastatīnsparādīti augstāki podocītiautofagijasākumā, kas bija rezistents pret angiotenzīna II atkarīgo inhibīciju. Arī ilgstoša autofagija arkalpastatīnsierobežoti podocītu bojājumi un albuminūrija. Šie atklājumi liecina, ka hipertensijai ir patogēna ietekme uz glomerulāro struktūru un funkciju, daļēji aktivizējot kalpaīnus, kas izraisa podocītu autofagijas bloķēšanu. Šie atklājumi atklāj oriģinālu mehānismu, saskaņā ar kuru angiotenzīna II izraisīta hipertensija inhibē autofagiju, kalcija izraisītu kalpaīna piesaisti ar patogēnām sekām, ja rodas nelīdzsvarotība.kalpastatīnsaktivitāte. Tādējādi, novēršot kalpaīna izraisītu samazināšanosautofagijavar būt daudzsološa jauna terapeitiskā stratēģija nefropātijām, kas saistītas ar augstu renīna-angiotenzīna sistēmas aktivitāti.

ATSLĒGVĀRDI: angiotenzīns II;autofagija; kalpastatīns; hipertensija; podocīts

Tulkošanas paziņojums

Ņemot vērā autofagijas izšķirošo lomu attīstībānieresslimības, farmakoloģiskā modulācijaautofagijavarētu būt daudzsološa stratēģija vairāku slimību profilaksei un ārstēšanainieresslimības. Paralēli tika konstatēts, ka kalpaīna aktivitātes pārmērīgai aktivizēšanai podocītos ir kaitīga ietekme uz podocītu darbību, savukārt tās kaitīgie darbības mehānismi netika identificēti. Šeit mēs sniedzam pierādījumus tam, ka kalpaīns saista angiotenzīna II kaitīgo darbību ar kaitīgo angiotenzīna II blokādi.autofagijapodocītos un liecina, ka kalpaīna inhibīcija varētu būt daudzsološs terapeitiskais mērķis podocītu slimībām, daļēji saglabājot podocītu autofagiju.

Noklikšķiniet, laiCistanche deserticola ma hroniskas nieru slimības ārstēšanai

Hipertensija ir otrajā vietā aiz diabēta kā galvenais progresējošas hroniskas slimības cēlonisnieresslimība1–3 un pat neliels asinsspiediena paaugstināšanās ir neatkarīgs riska faktors nieru slimības beigu stadijā.4 Arvien vairāk eksperimentālo pētījumu ir uzsvēruši podocītu nozīmi nieru slimību attīstībā.nieresievainojums. Progresējošs podocītu zudums un mikrovaskulāras izmaiņas parādās agri līdz ar funkcionālu nieru mazināšanos eksperimentālās hipertensīvās nefropātijas gadījumā.5 Pacientiem tika pierādīts, ka dzīvotspējīgu podocītu izdalīšanās ar urīnu ir jutīgs un specifisks preeklampsijas marķieris6,7 un pacientiem ar nefrosklerozi bija ievērojama mazāks glomerulāro podocītu blīvums nekā tas bijanieresdonori.8,9 Turklāt angiotenzīna II (AngII) patogēnā loma glomerulārās slimības progresēšanas veicināšanā ir labi pierādīta ne tikai hipertensīvos stāvokļos, bet arī vairāku glomerulu slimību gadījumā.10–21.

Glomerulārā hipertensija izraisa glomerulāro kapilāru izstiepšanos, endotēlija bojājumus un paaugstinātu glomerulāro proteīnu filtrāciju, izraisot glomerulu kolapsu un glomerulosklerozi. Tas arī tieši iedarbojas uz glomerulārām struktūrām, izraisot signālu regulējošas reakcijas, kuru mērķis ir kompensēt. Aktivizēta sistēmiskā un lokālā renīna-angiotenzīna-aldosterona sistēma (RAAS) veicina mezangiālo hiperplāziju un asinsvadu caurlaidības faktoru sintēzi. Vienlaikus podocīti parāda kalcija signālu22, 23 un maina savu formu pēc AngII 1. tipa receptoru (AT1) atkarīgas stimulācijas.24–28 Šie adaptīvie mehānismi ilgtermiņā kļūst slikti adaptīvi, beidzot izraisot glomerulosklerozi. AT1 veicina ievērojamu RAAS iesaistīšanos asinsspiedienā un sāls un ūdens homeostāzē. Angiotenzīnu konvertējošā enzīma inhibitorus un AT1 blokatorus klīniski izmanto hipertensijas un sirds mazspējas ārstēšanai pacientiem. Interesanti, ka abiem blokatoriem ir arī aizsargājoša iedarbība uznieresfunkciju.

Tika pierādīts, ka autofagija ir būtiska šūnu homeostāzes uzturēšanai, īpaši postmitotiskajās šūnās29,30 un īpaši podocītos.31–34Autofagijair ar lizosomu saistīta degradācijas sistēma ilgstošiem citoplazmas proteīniem un disfunkcionāliem organelliem 35, 36, un tā ietver proteīnu un organellu sekvestrāciju autofagosomās. Autofagosomu veidošanās ir atkarīga no vairāku gēnu, tostarp Map1lc3a/b, Beclin 1 un Tags, indukcijas. 37 Ir arvien vairāk pierādījumu tam, ka autofagiskā ceļa disregulācija ir saistīta ar nieru novecošanās patoģenēzi un vairākāmnierestādas slimības kā akūts nieru bojājums, policistiska nieru slimība, novecošana un diabētiskā nefropātija.31,32,38–41

gada regulējumsautofagijapodocītos fizioloģiskais un, galvenais, patoloģiskā kontekstā, nav labi zināms. Nesen mēs parādījām, ka podocītu autofagija ir neatkarīga no rapamicīna (mTOR) regulēšanas mehāniskā mērķa fizioloģiskos apstākļos, padarot šo šūnu tipu par izņēmumu.42 AT1 aktivācija stimulē proteīnu sintēzi un olbaltumvielu apriti šūnās. Tādējādi mēs pamatojām, ka RAAS aktivizēšana var ietekmēt arī olbaltumvielu apgrozījuma stimulāciju un proteostāzi.

Šajā pētījumā mēs koncentrējāmies uz AngIIsignaling lomu podocītosautofagijaregulējumu. Mēs identificējām kalcija aktivētās proteāzes kalpaīnus, kas mediē hronisku AngII bloķējošo iedarbību uz podocītiemautofagija. Turklāt mēs noskaidrojām, ka endogēnais kalpaīna inhibitorskalpastatīnsspēja novērst no AngII atkarīgo autofagijas inhibīciju un podocītu bojājumus hipertensijas laikā.

Šie atklājumi atklāj oriģinālu mehānismu, ar kura palīdzību AngII mediētā hipertensija inhibēautofagijaar kalcija izraisītu kalpaīna piesaisti ar patogēnām sekām kalpastatīna aktivitātes nelīdzsvarotības gadījumā.

METODES

Dzīvnieki

Kalpastatīnstransgēnās (CSTTg) peles laipni apgādāja Dr. E. Letavernjē.43 Peles ar podocītiem specifisku Atg5 gēna bojājumu (Nphs2.cre Atg5lox/lox) tika ģenerētas, kā aprakstīts iepriekš31, krustojot Nphs2.cre peles44 ar Atg5lox/lox. peles45 uz C57BL6/J fona. Šajā pētījumā tika izmantotas Nphs2.cre Atg5lox/lox peles un kontroles metieni tēviņi vecumā no 10 līdz 12 nedēļām. Hipertensijas modelis tika ierosināts ar AngII (Sigma-Aldrich, A9525) sc infūziju devā 1 mg/kg/min 4 līdz 6 nedēļas, izmantojot osmotiskos minisūkņus (Alzet Corp, 2006. gada modelis). Sūkņi tika implantēti sc uz muguras starp lāpstiņām un gurniem. Peles pārtikā saņēma sāls piedevu (3 procenti NaCl). Atg5lox/lox (savvaļas tipa [WT]) peles tika izmantotas kā kontroles visos pētījumos. Attiecībā uz deoksikortikosterona acetāta (DOCA) sāli ar nefronu samazināšanas modeli pieaugušiem peļu tēviņiem tika veikta vienpusēja kreisā nefrektomija. Divas nedēļas pēc nefrektomijas viņi saņēma DOC granulas ar 21-day release (Innovative Research of America) implantāciju sc. Otrā granula tika implantēta 3 nedēļas pēc pirmā implanta. Visas peles saņēma 0,9 procentus NaCl dzeramajā ūdenī ad libitum un tika nogalinātas pēc 6 nedēļu DOC ievadīšanas.46 Eksperimenti tika veikti saskaņā ar Francijas veterinārajām vadlīnijām un tām, ko Eiropas Kopiena formulējusi izmantošanai ar dzīvniekiem (L358-86/). 609EEC), un tos apstiprināja Francijas Pētniecības ministrija un vietējās universitātes pētniecības ētikas komiteja (APAFIS-7646 un -22373).

Primārās podocītu kultūras eksperiments

Diferencēti primārie podocīti tika kultivēti, kā aprakstīts iepriekš.47,48 Īsumā, tikko izolētā nieru garoza tika sajaukta un sagremota ar kolagenāzi I (Gibco, 17100-017) Roswell Park Memorial Institute 1640 (Life Technologies, 61870-044). Pēc tam audi tika izlaisti caur 70 mm un 40 mm šūnu sietiem (BD Falcon, 352340 un 352350). Glomeruli, kas pielīp pie 40 mm šūnu sietiņa, tika noņemti ar fosfātu buferšķīdumu (PBS; Life Technologies, 10010023) þ 0,5% liellopu seruma albumīna (Eurobio, HALALB07-65), kas injicēts zem spiediena, un pēc tam tika mazgāti divas reizes. PBS. Svaigi izolēti glomeruli tika ievietoti 6-iedobju trauciņos Roswell Park Memorial Institute 1640 (Gibco, 61870036), kas papildināti ar 10% teļa augļa seruma un 1% penicilīna/streptomicīna (Life Technologies, 15140122), lai ļautu izdalīties no glomeruliem. un augt. Podocītu bagātināšana tika pārbaudīta ar Western blot analīzi, kā aprakstīts iepriekš 31, 48, 49 (papildu attēls S1). Podocīti tika kultivēti 4 stundas bez bafilomicīna A1 (100 nmol/l, Sigma-Aldrich, B1793) vai tā klātbūtnē. Imunofluorescences eksperimentiem primārie podocīti tika uzklāti uz 4 trauku etiķetēm (Dutcher, 055071). Pēc tam podocīti tika fiksēti 4% paraformaldehīdā 10 minūtes un apstrādāti imunofluorescencei.

Kalpaīna aktivitātes tests

Intracelulārā kalpaīna aktivitāte tika noteikta primārajos podocītos, kā aprakstīts iepriekš.50–52 Kopā 100,000 šūnas tika kultivētas 24-iedobju audu kultūras trauciņos Roswell Park Memorial Institute 1640, kas papildināts ar 10 procentiem augļa. teļa serums un 1 procents penicilīna/streptomicīna. Pēc norādītā kultivēšanas perioda barotne tika aizstāta ar Krebs-Ringer HEPES bikarbonāta (KRH) šķīdumu (pH 7,4), kas satur 4 mM CaCl2, ar vai bez 10 mM kalpaīna inhibitora-1, un pirms pievienošanas inkubēja 10 minūtes. 50 mM kalpaīna substrāta N-sukcinil-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-metilkumarīna (Sigma-Aldrich, S6510). Pēc 90-minūtes inkubācijas perioda kalpaīna aktivitāte tika noteikta kā starpība starp FL fluorescenci (mērīta pie 360 ​​nm ierosmes un 430 nm emisijas) ar un bez kalpaīna inhibitora-1.

Western blot

Primārie podocīti tika saskrāpēti ar 80 ml radioimūnprecipitācijas testa buferšķīduma, kas satur fosfatāzi un proteāzes inhibitoru. Olbaltumvielu koncentrācija tika mērīta ar BCA Protein Assay Kit (Merck Biochemistry, 71285). Divdesmit mikrogramiem olbaltumvielu tika veikta elektroforēze uz Criterion XT saliekamā gēla (12 procenti Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). Olbaltumvielas tika pārnestas uz polivinilidēna difluorīda membrānu (Thermo Fischer Scientific, 88518). Pēc 5% piena bloķēšanas Tris buferšķīdumā 0,1% Tween (TBS-T), membrānas tika inkubētas ar trušu poliklonālo anti-LC3 (1:1 000, Cell Signaling Technology, 2575), trušu poliklonālo anti-ATG5. (1:2000, Cell Signaling Technology, 2630), jūrascūciņas poliklonālā anti-sekvestosoma 1 (SQSTM1)/P62 (1:10 000, PROGEN, GP62), trušu poliklonālais anti-kalpaīna 1 domēns IV (1:1000, Abcam, ab3 ), trušu poliklonālais anti-kalpaīna 2 aminoterminālais I domēna gals (1:1000, Abcam, ab39165), peles monoklonālais IgG1 anti-kalpaīns 4 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc-32325), trusis antipodocīna (1:1000, Abcam, ab50339), jūrascūciņu anti-nefrīna (1:500, PROGEN, GP-N2) un žurku monoklonālās antitubulīna (1:5000, Abcam,ab6160) antivielas. Pēc mazgāšanas membrānas inkubēja ar mārrutku peroksidāzi saistītu antivielu (1: 2000, Cell Signaling Technology, 7074, 7076, 7077). Konkrētu signālu noteikšana tika veikta, izmantojot ECL ķīmisko luminiscences komplektu (Bio-Rad, 170-5070) LAS 4000 ierīcē (Fuji). Kvantitatīvai noteikšanai tika izmantota densitometrijas analīze ar ImageJ programmatūru (Nacionālie veselības institūti).

Asinsspiediena mērījumi un fizioloģiskie novērtējumi

Sistoliskais asinsspiediens pelēm tika reģistrēts, izmantojot astes manžetes metodi (Visitech Systems Inc., BP-2000). No katras peles tika veikti desmit mērījumi, un pēc tam tika noteikta vidējā vērtība. Sistoliskais asinsspiediens tika mērīts sākumā (12 nedēļu vecumā) un pēc tam katru nedēļu līdz ārstēšanas perioda beigām. Visas peles tika ievietotas vielmaiņas būros ar brīvu piekļuvi ūdenim 6-stundu urīna savākšanai. Kreatinīna un plazmas urīnvielas koncentrācijas urīnā tika analizētas spektrofotometriski, izmantojot kolorimetrisko metodi (Olympus, AU400). Albumīna izdalīšanās ar urīnu tika mērīta, izmantojot īpašu ar enzīmu saistītu imūnsorbcijas testu albumīna kvantitatīvai noteikšanai peles urīnā (Crystal Chem, 80630).

Histoloģija

Nierestika novāktas un fiksētas 4% ar PBS buferētā formalīnā. Parafīnā iestrādātās sekcijas (3- mm biezas) tika iekrāsotas ar Masona strihromu, lai novērtētu nieru morfoloģiju. Anomālijas nierēs tika klasificētas, pamatojoties uz komponentu anomāliju klātbūtni un smagumu, tostarp glomerulosklerozi, mezangiālo paplašināšanos, tubulāru atrofiju vai ģipsi un fibrozi. Sklerotisko glomerulu īpatsvars tika novērtēts, aklo izmeklējot vismaz 50 glomerulus uz vienunieressadaļā.

Nieru sekciju un primāro podocītu imūnfluorescences krāsošana

Fiksētie primārie podocīti tika bloķēti TBS-T 3 procentu liellopu seruma albumīnā un inkubēti nakti 4 grādu temperatūrā ar primārajām antivielām jūrascūciņu anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C) un trušu antivielām. -zaļais FL fluorescējošais proteīns (GFP; 1:500, Abcam, ab290). Pēc TBS-T skalošanas ar FL fluoroforu konjugētās sekundārās antivielas veido ēzeļa anti-jūrascūciņu IgG AF594-konjugētās antivielas (JacksonImmunoResearch, 706-585-148) un ēzeļa anti-truša IgG AF488-konjugētās antivielas (konjugētas antivielas). Invitrogen, A21206) tika piemērots. Attēli tika uzņemti, izmantojot Zeiss 2 pēdu fluorescējošu mikroskopu, AxioCam HRccamera un Axiovision 4.3 programmatūru.

Formalīnā fiksētam parafīnā (FFPE)nieres, sekcijas (3 mm) tika deparafinētas un hidratētas, un antigēna iegūšana tika veikta karsētā citrāta buferšķīdumā (pH 6). Pēc tam sekcijas tika permeabilizētas ar Triton 0,1 procentu (Euromedex) un bloķētas TBS-T 3 procentu liellopu seruma albumīnā pirms antivielu inkubācijas 4 °C temperatūrā. Mēs izmantojām kazu anti-nefrīnu (1:100, PROGEN, GP). -N2), jūrascūciņas anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C), trušu anti-GFP (1:1000, Abcam, ab290), kazas anti-podokaliksīns (PODXL; 1: 1000, Bio-Techne, AF-1556), un truša anti-Vilmsa audzēja 1 (WT1;1:100, Abcam, ab192) antivielu. Sekundārās antivielas bija Alexa488– un Alexa 568–konjugētas antivielas no Invitrogen. Kodoli tika iekrāsoti zilā krāsā, izmantojot Hoechst. Priekšmetstikliņi tika uzstādīti, izmantojot fluorescējošu montāžas līdzekli (Dako, S3023). Mikrofotogrāfijas tika uzņemtas ar Zeiss Axiophot fotomikroskopu un Axiovision programmatūru. Nefrīna pozitīvo un PODXLþ apgabalu kvantitatīvai noteikšanai vienā glomerulārā sekcijā tika izmantota pusautomātiskā kvantitatīvā noteikšana Fidži vismaz 30 glomerulos uz vienu peli. Podocītu skaits tika skaitīts kā WT1þ kodolu skaits vienā glomerulārā sekcijā vismaz 30 glomerulos uz vienu peli.

Transmisijas elektronu mikroskopijas procedūra

Nelielus nieru garozas gabaliņus (1 mm3) fiksēja 3 procentu glutaraldehīda pakāpē (Electron Microscopy Sciences) 1 līdz 30 dienas un trīs reizes mazgāja PBS. Paraugi tika pēcfiksēti 1% osmija tetroksīda 0,1 M (elektronmikroskopijas zinātne) 0,1 M PBS (pH 7,4) un mazgāti ūdenī. Paraugi tika dehidrēti spirta kategorijās un 100% propilēna oksīdā (Elektronu mikroskopijas zinātne). Sveķu infiltrācija tika veikta šādi: samaisiet Epikote 812 un propilēna oksīdu proporcijā 1:1 30 minūtes, pēc tam samaisiet Epikote 812 un propilēna oksīdu proporcijā 1:2 uz nakti istabas temperatūrā. Paraugi tika iestrādāti 4 mm želatīna kapsulās 100 procentu Epikote 812 un polimerizēti krāsnī, kas uzkarsēta līdz 60 C. Īpaši plānas sekcijas tika izgrieztas ar UFC7 ultramikrotomu (Leica MicrosystemsGmbH) un noklātas uz Gilder Grids 200 sieta (Electron Microscopy Science). Tie tika iekrāsoti ar 7 procentu uranilacetātu (LFG sadalījums) un Reinolda svina citrātu (LFG). Paraugi tika pārbaudīti JEM1011 transmisijas elektronu mikroskopā (JEOL) ar Orius SC1000 CCD kameru (Gatan), kas darbojās ar Digital Micrograph programmatūru (Gatan), lai iegūtu.

Cistanche-nieru slimība

Kvantitatīvā polimerāzes ķēdes reakcijas masīvs

Svaigi izolēti glomeruli tika sasaldēti QIAzol Lysis reaģentā (Qiagen) -80 pakāpē. Kopējā RNS ekstrakcija, izmantojot fenola metodi, tika apstrādāta saskaņā ar ražotāja ieteikumiem. cDNS tika sintezētas, izmantojot RT2 First Strand Kit (Qiagen, 330401), un reāllaika polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) tika veikta, izmantojot Custom RT2 Profiler PCR Array (Qiagen, CLAM36771C) ar RT2 SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 330) . Kvantitatīvās PCR plāksnes tika darbinātas ar Applied Biosystems StepOnePlus cikleri. Katrs masīvs satur kvalitātes kontroli reversās transkripcijas efektivitātei un genoma DNS piesārņojumam. Kvantitatīvā PCR analīze tika veikta, izmantojot 2-DDCT metodi ar GeneGlobe datu analīzes centra (www. Qiagen. com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) palīdzību un izteikta. kā Log2 reizes izmaiņas gēnu ekspresijā.

In silico proteomiskā analīze

Kalpaīna šķelšanās vietas in silico prognozēšana tika veikta ar DeepCalpain (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org) un CaMPDB (http:// calpain.org/) tiešsaistes rīki. Peles proteīna aminoskābju secība tika iegūta no Uniprot (//www.uniprot.org). Rezultāti tiek atsākti S1 un S2 papildu tabulās.

Statistiskās analīzes

Visas diagrammas attēlo atsevišķas vērtības un vidējo ± SEM. Statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot GraphPad Prism programmatūru, 9. versiju. Salīdzinājums starp 2 grupām tika veikts, izmantojot parametricStudent t-testu, kad paraugi izturēja Andersona-Dārlinga un D'Agostino normalitātes testus un F testu dispersijas vienlīdzības noteikšanai. Pretējā gadījumā tika izmantots neparametrisks Mann-Whitney tests. Salīdzinājums starp vairākām grupām tika veikts, izmantojot 1-veidu vai 2-veidu dispersijas analīzi, kam sekoja vairāku salīdzināšanas tests ar Simak korekciju. Vērtības P < 0.05="" tika="" uzskatītas="" par="" nozīmīgām.*p="">< 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>

1. attēls|Angiotenzīna II (AngII) D augsta sāls diēta (HSD) izraisīta hipertensija kavē glomerulāruautofagija. (a–c) Podokaliksīna (PODXL; sarkans) un P62 (zaļš) imunofluorescence glomerulos (a,a0) no savvaļas tipa (WT) pelēm, (b,b0 ) no WT pelēm pēc 6 nedēļām AngII þ HSD un (c,c0 ) no Nphs2.cre Atg5lox/lox pelēm, kas parāda P62 uzkrāšanos podocītos hipertensijas laikā un podocītiem specifiskā ATG{{1{{12 }}}}deficīta peles. Bultiņu galviņas norāda P62þ punktus WT (a0 ). Kodoli tika iekrāsoti ar Hoechst (zilu). Attēlu apakšdaļas ar galveno norāda lielāku palielinājumu. Stieņi=50 mm. d) saistītā P62þ laukuma kvantitatīvā noteikšana, kas izteikta procentos no glomerulārās zonas. n=4 WT peles un n=5 WT ar AngII þ HSD un Nphs2.cre Atg5lox/lox pelēm. Vērtības tiek parādītas kā atsevišķi diagrammas un vidējais±SEM. Manna-Vitnija tests: *P=0.0159. Lai optimizētu šī attēla skatīšanu, lūdzu, skatiet šī raksta tiešsaistes versiju vietnē www.nieres-international.org.

REZULTĀTI

AngII D augsta sāls diētas izraisīta hipertensija inhibēja podocītu autofagiju

Podocīti uzrāda augstu līmeniautofagijain vivo, kā liecina spēcīga GFP ekspresija transgēnās pelēs ar GFP saplūšanu ar LC3 (GFP-LC3 peles), kas ir galvenais autofagijas marķieris (papildu attēls S2A). Autofagija ir dinamisks process ar pastāvīgu autofagosomu veidošanos un autofagolizosomu degradāciju. Autofagosomu degradācijas bloķēšana ar hlorokvīnu izraisīja GFP punktu uzkrāšanos, kas norāda uz augstu autofagisko izplūdi podocītos (papildu attēli S2A un B). Apstiprinājumu, ka GFPþ punkti bija autofagosomas, parādīja dubultā imūn-FL fluorescence GFP un SQSTM1/P62, šaperona proteīnam, ko degradējaautofagija(Papildu attēls S2C un D). Atkal ārstēšana ar hlorokvīnu izraisīja GFP P62 punktu uzkrāšanos, parādot svarīgu autofagisko izplūdi podocītos. Visbeidzot, augsta autofagiskā izplūde tika saglabāta in vitro, kā liecina GFP un P62 ekspresija primārajos podocītos, kas izolēti no GFP-LC3 pelēm, un spēcīga GFPþ un P62þ punktu uzkrāšanās, ārstējot ar bafilomicīnu A1, kas ir vēl viens autofagosomu degradācijas bloķētājs (papildu attēls S2E – H). .

Pēc tam tika novērtēta hipertensijas spēja modulēt podocītu autofagiskās reakcijas pelēm, kurām 6 nedēļas tika ievadītas AngII ar diētu ar augstu sāls saturu (HSD), un nehipertensīvām kontrolēm. Kā parādīts 1. attēlā, AngII þ HSD izraisīja P62 uzkrāšanos glomerulos ar spēcīgu uzkrāšanos podocītos, tādējādi liekot domāt, ka AngII þ HSD bija atbildīgs par podocītu.autofagijablokāde (1.a–d attēls). Interesanti, ka P62 uzkrāšanās podocītos bija līdzīga tai, kas novērota pelēm, kurām trūkst podocītu autofagijas (Nphs2.cre Atg5lox/lox pelēm). Citā hipertensijas modelī, DOC-sāls modelī, mēs novērojām arī progresējošu P62 uzkrāšanos podocītos slimības laikā (papildu attēls S3).

Atg5 dzēšana īpaši podocītos izraisa palielinātu albumīnūriju, podocītu zudumu un glomerulārus bojājumus AngII D HSD modelī

Pēc tam mēs pārbaudījām, vaiautofagijablokāde tikai podocītos (Nphs2.cre Atg5lox/lox pelēm) ietekmē glomerulāros bojājumus AngII þ HSD modelī. Vispirms mēs apstiprinājām, ka Nphs2. cre Atg5lox/lox pelēm bija normāls asinsspiediens, normālsnieresfunkcija un nav glomerulāru histoloģisku bojājumu līdz 10 mēnešu vecumam, kā ziņots iepriekš (papildu attēls S4).32 Pēc tam Atg5lox/lox (WT) un Nphs2. cre Atg5lox / lox pelēm 6 nedēļas tika ievadītas AngII ar HSD. Svarīgi ir tas, ka sistoliskais asinsspiediens bija līdzīgs 2 grupās pēc AngII infūzijas pētījuma laikā (2.a attēls), lai gan asinsspiediena mērīšanai izmantotā astes aproces metode, iespējams, nespēj atrisināt nelielas asinsspiediena atšķirības. AngII infūzija ar HSD ievērojami palielināja urīna albumīna un kreatinīna attiecību WT pelēm, un šis efekts vēl vairāk palielinājās Nphs2.cre Atg5lox/lox pelēm (2.b attēls). Hipertensīvām Nphs2.cre Atg5lox/lox pelēm arī bija ievērojami palielināta glomerulārā skleroze, salīdzinot ar WT metiena biedriem (2.c–e attēls). Saskaņā ar izmērīto proteīnūriju pelēm ar podocītu deficītu ATG5 olbaltumvielas un cauruļveida dilatācija bija ievērojami izplatītāka (attēls 2f – h).

2. attēls|Atg5 dzēšana īpaši podocītos izraisa ievērojamu albuminūrijas pieaugumu,nierestraumas un podocītu zudums pēc 6 nedēļu angiotenzīna II (AngII) infūzijas D augsta sāls satura diētas (HSD). (a) Sistoliskais asinsspiediens Atg5lox/lox un Nphs2.cre Atg5lox/lox pelēm 36 AngII þ HSD dienu laikā. n=9 peles vienam genotipam. Vērtības tiek parādītas kā vidējās±SEM. Divvirzienu dispersijas analīze (ANOVA): ns. (b–m) n=10 peles vienam genotipam. (b,g,h,k) vērtības ir parādītas kā atsevišķi diagrammas un vidējais±SEM. (b) AngII þ HSD (turpinājums)

2. attēls|(turpinājums) izraisīja dramatisku albuminūrijas pieaugumu Nphs2. cre Atg5lox/lox pelēm, salīdzinot ar Atg5lox/lox kontroles pelēm. Divvirzienu ANOVA: genotips, P=0.013; laiks, P=0.0018. (c–f) reprezentatīvi attēli ar Masona trihromu iekrāsotajām glomerulu sekcijām no Atg5lox/lox kontroles un Nphs2.cre Atg5lox/lox pelēm pēc 6 nedēļām AngII þ HSD. Stieņi =50 mm collas (c, d). Stieņi=100 mm collas (e,f). (g,h) Salīdzinājums (g) sklerotisko glomerulu īpatsvaram un (h) cauruļveida izmetumu skaitam mikroskopiskā laukā. Manna-Vitnija tests: **P=0,0026 collas (h), ***P=0,0003 collas (g). (i, j) Reprezentatīvi imūnfluorescences attēli Vilmsa audzēja 1 (WT1; sarkans) un Podocalyxin (PODXL; zaļš) ekspresijai glomerulos no Atg5lox/lox kontroles un Nphs2.cre Atg5lox/lox pelēm pēc AngII þ HSD 6 nedēļas. Kodoli tika iekrāsoti ar Hoechst (zilu). Stieņi=50 mm. k) WT1þ šūnu skaita kvantitatīva noteikšana vienā glomerulārā sekcijā. Manna-Vitnija tests: **P=0,0029 collas (l,m). Reprezentatīvi imūnfluorescences attēli CD44 (zaļa) ekspresijai glomerulos no Atg5lox/lox kontroles un Nphs2.cre Atg5lox/lox pelēm pēc AngII þ HSD 6 nedēļas. Kodoli tika iekrāsoti ar Hoechst (zilu). Stieņi=50 mm. (n, o) Reprezentatīvi transmisijas elektronu mikroskopijas fotomikroskopijas glomerulu sekcijām no Atg5lox/lox kontroles un Nphs2.cre Atg5lox/lox pelēm pēc AngII þ HSD 6 nedēļas, parādot podocītu pēdas procesa izdzīšanu (bultu galviņas) hipertensijas Nphs2 gadījumā. cre Atg5lox/lox peles. Stieņi=1 mm. n=3 peles vienam genotipam. Lai optimizētu šī attēla skatīšanu, lūdzu, skatiet šī raksta tiešsaistes versiju vietnē www.kidney-international.org.

3. attēls|Kalpaīna ekspresija un aktivitāte podocītos. (a) Western blot analīze kalpaīna -1, kalpaīna-2 un kalpaīna-4 ekspresijai primārajos podocītos. Tubulīna ekspresija kalpo kā normalizācija. ( b ) Kalpaīna aktivitāte tika mērīta primārajiem podocītiem, kas apstrādāti vai neapstrādāti ar angiotenzīnu II (AngII; 100 nM) 24 stundas ar kalpeptīnu (10 mM) vai bez tā. n=5 neatkarīgi eksperimenti. Vērtības tiek parādītas kā atsevišķi diagrammas un vidējais±SEM. Vienvirziena dispersijas analīze (ANOVA): apstrāde, P=0.0035. Sidaka daudzkārtējais salīdzināšanas tests: *P=0.0128 AngII pret bāzes līniju, ##P=0.0056 AngII þ kalpeptīns pret AngII. (c) Kalpaīna aktivitāte tika mērīta uz primārajiem podocītiem no savvaļas tipa (WT) vaikalpastatīnstransgēnām (CSTTg) pelēm, kuras 24 stundas apstrādātas vai neapstrādātas ar AngII (100 nM). n=7 neatkarīgi eksperimenti. Vērtības tiek parādītas kā atsevišķi diagrammas un vidējais±SEM. Divvirzienu ANOVA pārī ārstēšanai: genotips, P=0.0483. Sidaka daudzkārtējais salīdzināšanas tests: ***P=0.0009 WT AngII salīdzinājumā ar bāzes līniju, *P=0.0420 CSTTg AngII pret bāzes līniju, #P=0.0424 WT pret CSTTg AngII. Lai optimizētu šī attēla skatīšanu, lūdzu, skatiet šī raksta tiešsaistes versiju vietnē www.nieres-international.org.

Podocītu skaits vienā glomerulā bija ievērojami samazināts Nphs2. cre Atg5lox/lox pelēm, kas apstrādātas ar AngII þ HSD (2.i – k attēls). Podocītu bojājums Nphs2.cre Atg5lox/lox pelēm ar AngII infūziju þ HSD pat progresēja līdz fokālajai un segmentālajai glomerulosklerozei, kā liecina parietālo epitēlija šūnu (PEC) aktivācijas marķiera CD44 ekspresija glomerulos (2l un m attēls). Elektronu mikroskopijas analīze atklāja nozīmīgas izmaiņas, kas saistītas ar ATG5 deficītu pēc hroniskas AngII infūzijas ar HSD, ieskaitot pēdas procesa izzušanu hipertensīvā Nphs2 gadījumā. cre Atg5lox/lox peles. Turpretim WT peļu podocītos tika konstatēti daži ultrastrukturāli defekti pat pēc 10 nedēļu ilgas AngII infūzijas ar HSD (2.n un o attēls), norādot, ka podocītu autofagiskā aktivitāte ir nepieciešama to rezistencei pret AngII þ HSD izraisītiem bojājumiem. Kopumā mūsu rezultāti liecināja, ka AngII þ HSD modelīautofagijainhibīcija pasliktina podocītu bojājumus un zudumus un izraisa sekojošu fokālo un segmentālo glomerulosklerozi.

AngII D HSD aktivizē kalpaīna aktivitāti podocītos, kas veicina autofagijas blokādi

Tā kā tika konstatēts, ka kalpaīna aktivitāti (i) aktivizē AngII vairākos šūnu tipos un (ii) šķeļ vairākusautofagijaar olbaltumvielām,53 mēs domājām, vai AngII þ HSD mediētā autofagijas blokāde varētu būt saistīta ar palielinātu AngII izraisīto kalpaīna aktivitāti. Vispirms mēs noskaidrojām, ka primārie podocīti izteica 3 visuresošās kalpaīnu formas (3.a attēls). Pēc tam mēs parādījām, ka AngII stimulēja kalpaīna aktivitāti primārajos podocītos. Šo kalpaīna aktivitātes pieaugumu bloķēja selektīvs kalpaīna inhibitors (3.b attēls). Mēs izmantojām knock-in peli ar papildukalpastatīnstransgēna ekspresija (kas izraisa kalpaīna aktivitātes samazināšanos)43, lai novērtētu kalpaīnu lomu AngII þ HSD mediētajānieresievainojumi un autofagijas blokāde. Primārie podocīti no CSTTg pelēm uzrādīja samazinātu kalpaīna aktivitāti, reaģējot uz AngII, salīdzinot ar podocītiem no kontroles pelēm (3.c attēls). Tādējādikalpastatīnspārmērīga ekspresija podocītos samazināja AngII mediēto kalpaīna aktivāciju.

Tālāk mēs novērtējāmautofagijalīmenis podocītos no CSTTg pelēm. Mēs izveidojām CSTTg peles ar GFP-LC3 transgēnu. LC3-GFP reportieris ļāva skaitīt autofagosomas kā GFPþ/P62þ punktus. P62 uzkrājas agregātos šūnās, kad tiek bloķēta autofagiskā izplūde. Bāzes stāvoklī mēs saskaitījām mazāk GFPþ P62þ punktu (4.a, b un e attēls) un mazāk P62 uzkrāšanās (4.c, d un f attēls) CSTTg GFP-LC3 peļu podocītos nekā parasto GFP-LC3 peļu podocītos. , kas liecina par palielinātu autofagisko izplūdi peļu podocītos ar augstu kalpastatīna daudzumu.

4. attēls|Autofagiskās izplūdes novērtējums podocītoskalpastatīnstransgēnām (CSTTg) pelēm. (a, b) Reprezentatīvi imunofluorescences attēli zaļā FL fluorescējošā proteīna (GFP) (zaļā) un P62 (sarkanā) ekspresijai glomerulos no 12-nedēļu vecām GFP-LC3 un CSTTg GFP-LC3 pelēm. Bultu galviņas norāda uz GFPþ P62þ autofagosomām. (c, d) reprezentatīvi imūnfluorescences attēli P62 (zaļš) un Podokaliksīna (PODXL; sarkans) ekspresijai glomerulos no 12- nedēļu vecām GFP-LC3 un CSTTg GFP-LC3 pelēm. Attēlu apakšdaļas ar galveno norāda lielāku palielinājumu. Kodoli tika iekrāsoti ar Hoechst (zilu). Stieņi=50 mm. e) LC3þ P62þ punktu skaita noteikšana uz podocītu. Manna-Vitnija tests: **P= 0.0065. f) P62þ laukuma kvantitatīva noteikšana vienā glomerulārā sekcijā. Manna-Vitnija tests: *P=0.0420. (e,f) n=5 GFP-LC3 peles un n=8 CSTTg GFP-LC3 peles. Vērtības tiek parādītas kā atsevišķi diagrammas un vidējais±SEM. Lai optimizētu šī attēla skatīšanu, lūdzu, skatiet šī raksta tiešsaistes versiju vietnē www.nieres-international.org.

Autofagisko izplūdi var novērot, mērot LC3, LC3-I citoplazmatiskās formas pārvēršanos par autofagosomāli šķelto un ar fosfatidiletanolamīnu saistītu LC3 formu, LC3-II, izmantojot Western blot. . Podocīti no CSTTg pelēm uzrādīja palielinātu LC3-I pārvēršanos par LC3-II un samazinātu P62 ekspresiju gan bafilomicīna A1 klātbūtnē, gan bez tā (5.a un b attēls), kas liecina par palielinātu autofagisko izplūdi podocīti ar kalpastatīna pārmērīgu ekspresiju. Visbeidzot, GFPþ P62þ punktu uzkrāšanās podocītos pēc hlorokvīna ievadīšanas bija svarīgāka CSTTg GFP-LC3 pelēm nekā GFP-LC3 pelēm, tādējādi apstiprinot, kakalpastatīnspārmērīga ekspresija izraisa autofagisku izplūdi podocītos in vivo (5.c – e attēls). Kopumā mūsu dati liecina, ka AngII stimulē kalpaīna aktivitāti podocītos, tasautofagijatiek inhibēts kalpaīns podocītos, un endogēnās kalpaīna aktivitātes kavēšana ar kalpastatīna pārmērīgu ekspresiju ir pietiekama, lai stimulētu autofagisko izplūdi podocītos.

CSTTg peles ir aizsargātas no AngII D HSD izraisītiem podocītu bojājumiem

CSTTg pelēm neviens neuzrādījanieresizmaiņas līdz vismaz 12 mēnešu vecumam (papildu attēls S5). Mēs analizējām podocītu bojājumus CSTTg pelēm AngII þ HSD ārstēšanas laikā. Lai gan WT pelēm pēc 4 nedēļu ilgas hipertensijas attīstījās viegla glomeruloskleroze un podocītu ievainojumi, kā liecina patoloģiska podokaliksīna un nefrīna ekspresija, CSTTg pelēm bija mazāk sklerotisku glomerulāru bojājumu (6.a un b attēls) un saglabājās podokaliksīna un nefrīna 6 ekspresija (attēls). . Šādas atšķirības podocītu fenotipā tika novērotas stadijā, kad podocītu kodolu blīvums neatšķīrās starp WT un hipertensīvām CSTTg pelēm (6.i – k attēls).

5. attēls|Autofagosomu degradācijas bloķēšana apstiprināja palielinātu podocītu autofagisko izplūdikalpastatīnstransgēnām (CSTTg) pelēm. a) Western blot analīze par LC3, sekvestosomas 1 (SQSTM1)/P62 un ATG5 ekspresiju primārajos podocītos no savvaļas tipa (WT) vai CSTTg pelēm. Tubulīna ekspresija kalpo kā normalizācija. Podocīti tika ārstēti vai neapstrādāti ar bafilomicīnu A1 (BafA1; 100 nM) 4 stundas pirms kultūras apturēšanas. (b) LC{{10}}II/tubulīna un P62/tubulīna attiecību kvantitatīva noteikšana. n=10 WT peles un n=8 CSTTg peles. Vērtības tiek parādītas kā atsevišķi diagrammas un vidējais±SEM. Divvirzienu dispersijas analīze pārī ārstēšanai: LC3-II/tubulīnam: genotips, P=0.{{30}}008; ārstēšana, P < 0,0001;="" p62/tubulīnam:="" genotips,="" p="0.0884;" ārstēšana,="" p="">< 0,0001.="" sidaka="" daudzkārtējais="" salīdzināšanas="" tests:="" lc3-ii/tubulīnam:="" ***p="">< 0,0001="" wt="" plus="" bafa1="" pret="" wt="" þ="" bafa1,="" ***p="">< 0,0001="" csttg="" plus="" bafa1="" pret="" csttg="" þ="" bafa1,="" ##p{="" {34}}.0028="" wt="" þ="" bafa1="" pret="" csttg="" þ="" bafa1;="" p62/tubulīnam:="" ***p="">< 0,0001="" wt="" plus="" bafa1="" pret="" wt="" þ="" bafa1,="" ***p="">< 0,0001="" csttg="" plus="" bafa1="" pret="" csttg="" þ="" bafa1.="" (c,="" d)="" reprezentatīvi="" imunofluorescences="" attēli="" zaļā="" fl="" fluorescējošā="" proteīna="" (gfp;="" zaļā)="" un="" p62="" (sarkanā)="" ekspresijai="" glomerulos="" no="" 12-="" nedēļu="" vecām="" gfp-lc3="" un="" csttg="" gfp-lc3="" pelēm.="" attēlu="" apakšdaļas="" ar="" galveno="" norāda="" lielāku="" palielinājumu.="" kodoli="" tika="" iekrāsoti="" ar="" hoechst="" (zilu).="" stieņi="50" mm.="" peles="" 4="" stundas="" pirms="" nogalināšanas="" apstrādāja="" ar="" hlorokvīnu="" (cq;="" 80="" mg/kg).="" bultu="" galviņas="" norāda="" uz="" gfpþ="" p62þ="" autofagosomām.="" e)="" lc3þ="" p62þ="" punktu="" skaita="" noteikšana="" uz="" podocītu.="" n="5" peles="" vienam="" genotipam.="" vērtības="" tiek="" uzrādītas="" kā="" atsevišķas="" diagrammas="" un="" vidējās="">±SEM. Nepāra t-tests ar vienādu SD: *P=0.0302. Lai optimizētu šī attēla skatīšanu, lūdzu, skatiet šī raksta tiešsaistes versiju vietnē www.nieres-international.org.

6. attēls |Kalpastatīnspārmērīga ekspresija novērš angiotenzīna II (AngII) D augstu sāls diētu (HSD) izraisītu podocītu bojājumu. ( a, b ) Reprezentatīvi attēli ar Masona trihromu iekrāsotajām glomerulu sekcijām no savvaļas tipa (WT) un kalpastatīna transgēnām (CSTTg) pelēm pēc 6 nedēļu ilgas AngII þ HSD. Stieņi =50 mm. (c, d, f, g) reprezentatīvi imūnfluorescences attēli (c, d) podokaliksīna (PODXL) un (f, g) nefrīna (NPHS1) ekspresijai WT un CSTTg pelēm pēc 6 nedēļām AngII þ HSD un (e) ,h) saistītie kvantitatīvie rādītāji. Stieņi=50 mm. (i, j) reprezentatīvi imunofluorescences attēli Vilmsa audzēja 1 (WT1; zaļa) un PODXL (sarkana) ekspresijai glomerulos no WT un CSTTg pelēm pēc 6 nedēļām AngII þ HSD un (k) ar to saistītā WT1– skaita kvantitatīvā noteikšana. šūnas vienā glomerulārā sekcijā. Kodoli tika iekrāsoti ar Hoechst (zilu). Stieņi=50 mm. (e,h,k) vērtības ir parādītas kā atsevišķi diagrammas un vidējais±SEM. n=9 WT peles un n=7 CSTTg peles. Nepāra t tests ar vienādu SD: **P=0,0095 collā (e), *P=0,0249 collas (h), P=0,7891 collas (k). Lai optimizētu šī attēla skatīšanu, lūdzu, skatiet šī raksta tiešsaistes versiju vietnē www.nieres-international.org.

Līdzīgi, pēc 6 nedēļu ilgas hipertensijas, GFP-LC3 un CSTTg GFP-LC3 pelēm bija podocītu bojājumi, bet bojājumi bija izteiktāki GFP-LC3 pelēm (7. attēls). Albumīna un kreatinīna attiecība urīnā GFP-LC3 pelēm bija augstāka pēc 4 nedēļu ilgas AngII þ HSD (7.a attēls). Podocītu skaits neatšķīrās starp diviem genotipiem, bet nefrīna ekspresija bija ievērojami vairāk samazināta GFP-LC3 (kontroles) pelēm (7.b – e attēls). Korelē arkalpastatīns- mediēta aizsardzība, ultrastrukturālā analīze parādīja vieglu un fokusu podocītu pēdas procesa izsvīdumu GFP-LC3 pelēm, kas tika ārstētas ar AngII þ HSD, labāk saglabājot pēdas procesa izsvīdumu CSTTg pelēm, lai gan pēdas procesu skaita globālā kvantitatīvā noteikšana uz glomerulārā pagraba. membrānas (GBM) garums statistiski neatšķīrās, visticamāk, tāpēc, ka mūsu modelī podocītu bojājums ir fokuss un segmentāls (7.f – h attēls). Jāatzīmē makrofāgu un T-limfocītu infiltrācijanieresgrupās neatšķīrās (papildu attēls S6). Kopumā šie rezultāti to parādījakalpastatīnsnovērsa AngII þ HSD izraisītu podocītu bojājumu.

Kalpastatīna pārmērīga ekspresija atjauno autofagisko izplūdi peļu podocītos pēc AngII D HSD ārstēšanas

Visbeidzot, mēs domājām, vaikalpastatīns-mediētā glomerulārā aizsardzība AngII þ HSD modelī bija saistīta ar autofagijas uzturēšanu podocītos. Interesanti, ka AngII þ HSD izraisīta P62 uzkrāšanās podocītos tika novērsta CSTTg un GFP-LC3 CSTTg pelēm (8.a – d attēls), norādot, ka kalpastatīns novērsa podocītu bloķēšanu.autofagija. Jāatzīmē, ka autofagosomu GFPþ P62þ punktu marķējumu skaits bija līdzīgs podocītos no hipertensīvām GFP-LC3 un GFP-LC3 CSTTg pelēm, tādējādi liekot domāt, ka AngII þ HSD izraisīja podocītu autofagiskās izplūdes palēnināšanos, nevis pilnīgu apstāšanos (8. attēls). g).

Kalpaīna šķelšanās vietas in silico prognozēšana podocītu proteīnos

Mēs izmantojām vairākus in silico rīkus, lai prognozētu iespējamos kalpaīna mērķus podocītos (papildu tabulas S1 un S2). Tika salīdzinātas trīs tiešsaistes datubāzes: GPS-CCD,54 CaMPDB,55 un DeepCalpain.56 In silico analīzē tika identificēti vairāki podocītu proteīni, starp tiem nefrīns un podocīns, kurus varēja šķelt kalpaīni. Tādējādikalpastatīns-mediētā glomerulārā aizsardzība var būt saistīta ar kalpaīna fermentatīvās aktivitātes samazināšanos, kas samazina dažu podocītu proteīnu noārdīšanos.

Turklāt vismaz 3autofagijaar to saistītie proteīni ir tiešie kalpaīnu mērķi. ATG5 šķeļ kalpaīni, izraisot traucējumus ATG12-ATG5 kompleksa veidošanā.57,58 Kalpaīna inhibitoru ievadīšana in vivo novērsa arī autofagijas proteīna Beclin-1 šķelšanos.59 In silico analīze iespējamā šķelšanās vieta ar autofagiju saistītajiem proteīniem apstiprina hipotēzi, ka kalpaīns varētu regulēt autofagiju, izmantojot autofagijas proteīnu enzīmu šķelšanos.

Cistanche-nieru funkcija

Endoplazmatiskā retikuluma (ER) mRNS ekspresija un oksidatīvā stresa marķieri glomerulos no pelēm, kas ārstētas ar AngII plus HSD

Mēs novērtējām endoplazmatiskā tīkla (ER) stresu un oksidatīvo stresu ar kvantitatīvu PCR glomerulos AngII þ HSD ārstēšanas laikā (1. tabula). Sākumā mēs nenovērojām nekādas izmaiņas analizēto gēnu mRNS ekspresijā glomerulos no WT un Nphs2.cre Atg5lox/lox pelēm (papildu attēls S7). Pēc 6 hipertensijas nedēļām glomerulos no Nphs2. cre Atg5lox/lox pelēm bija atšķirīgs ER stresa un oksidatīvā stresa ceļu gēnu mRNS profils ar paaugstinātu Sod1, Prdx1, Atf4, Gpx1 un Hsp90b1 ekspresiju, salīdzinot ar WT glomeruliem, tādējādi liekot domāt, kaautofagijapodocītu izsīkums veicināja AngII þ HSD izraisītu ER stresu un oksidatīvo stresu. Un otrādi, CSTTg peļu glomerulos tika novērota vairāku ER stresa un oksidatīvā stresa ceļu gēnu pazemināšanās, kā arī dažu proapoptotisko gēnu ekspresijas samazināšanās (9. attēls).

Kopumā šie rezultāti liecina par tokalpastatīnspārmērīga ekspresija varētu novērst glomerulāru bojājumu, samazinot AngII þ HSD izraisīto ER un oksidatīvo stresu.

DISKUSIJA

Šajā pētījumā mēs parādījām, ka AngII þ HSD izraisītas hipertensijas gadījumā podocītu autofagija ir ievērojami samazināta. Turklāt pelēm ar podocītu specifisku Atg5 dzēšanu bija lielāka nosliece uz AngII þ HSD izraisītu glomerulosklerozi un podocītu zudumu, tādējādi parādot, kaautofagijapodocītos novērš hipertensīvas nefropātijas attīstību, uzsverot autofagijas kritisko lomu AngII þ HSD izraisītā podocītu ievainojumā. Ir maz zināms par ekstracelulārajiem stimuliem, kas regulē šūnu autofagiju, un šie rezultāti atklāj AngII podocītu autofagijas patofizioloģisko regulējumu.

Lielākajā daļā cilvēka glomerulopātiju podocītu pēdas procesa izsvīdums ir glomerulāra bojājuma pazīme, kas izraisa proteīnūriju. Autofagijai, visticamāk, būs būtiska loma podocītu funkcijas uzturēšanā, jo šīm galīgi diferencētajām šūnām ir augstsautofagijapat bez stresa. Iepriekšējais pētījums parādīja, ka AngII veicina autofagiju, veidojot reaktīvas skābekļa sugas nosacīti iemūžinātā peles podocītu šūnu līnijā.60 Reaktīvo skābekļa sugu veidošanās patiešām ir vispārējs autofagijas induktors daudzos šūnu veidos, un šādas neatbilstības iemesli mūsu atklājumiem ir šādi: neskaidrs. Atšķirībā no šī pēdējā pētījuma mēs izmantojām peļu primāri kultivētus podocītus, kas saglabā podocīna un nefrīna ekspresiju un in vivo pieejas, nevis peles šūnu līnijas. Mēs apstiprinām iepriekšējos ziņojumus, ka postmitotiskajiem podocītiem ir neparasti augsts konstitutīvas līmenisautofagija. Palielināta LC3-II daudzuma mērīšana pēc AngII stimulācijas lizosomu inhibitoru klātbūtnē vai bez tās ir nepieciešama, lai noteiktu, vai autofagiskā izplūde ir palielināta vai bloķēta. Iepriekšējos pētījumos šī parādība ir atstāta novārtā.60

7. attēls |Kalpastatīnspārmērīga ekspresija novērš angiotenzīna II (AngII) D augsta sāls daudzuma diētas (HSD) izraisītu podocītu bojājumu zaļās FL fluorescējošā proteīna (GFP) – LC3 pelēm. ( a ) AngII þ HSD izraisīja dramatisku albuminūrijas pieaugumu GFP-LC3 pelēm, salīdzinot ar CSTTg (kalpastatīna transgēnām) GFP-LC3 pelēm. n=8 līdz 13 pelēm katrā genotipā. Vērtības tiek parādītas kā atsevišķi diagrammas un vidējais±SEM. Divvirzienu dispersijas analīze: genotips, P=0.0429; laiks, P=0.0165. Sidaka daudzkārtējais salīdzināšanas tests: *P=0.0453 GFP-LC3 un CSTTg GFP-LC3 pelēm 28. dienā. (b,c) Reprezentatīvi imunofluorescences attēli Vilma audzēja 1 (WT1; zaļa) un nefrīna ekspresijai. (NPHS1) (sarkans) glomerulos no 18-nedēļu vecām GFP-LC3 un CSTTg GFP-LC3 pelēm pēc 6 nedēļas AngII infūzijas þ HSD. Kodoli tika iekrāsoti ar Hoechst (zilu). Stieņi=50 mm. (d) NPHS1þ laukuma kvantitatīva noteikšana vienā glomerulārā sekcijā un (e) WT1þ šūnu skaits vienā glomerulārā sekcijā 18-nedēļu vecām GFP-LC3 un CSTTg GFP-LC3 pelēm pēc 6 nedēļas AngII infūzijas þ HSD. n=19 GFP-LC3 peles un n=25 CSTTg GFP-LC3 peles. Vērtības tiek parādītas kā atsevišķi diagrammas un vidējais±SEM. Nepāra t tests ar vienādu SD: **P=0,0010 collas (d), P= 0,1158 collas (e). ( f, g ) glomerulu pārraides elektronu mikroskopijas attēli no GFP-LC3 un CSTTg GFP-LC3 pelēm pēc 6 nedēļu ilgas AngII þ HSD. Bultu galviņas norāda uz pēdas procesa izdzīšanu. Stieņi =1 mm. h) pēdas procesu skaita kvantitatīva noteikšana uz glomerulārās bazālās membrānas (GBM) mikrometru. n=3 peles vienam genotipam. Vērtības tiek parādītas kā atsevišķi diagrammas un vidējais SEM. Katrs grafiks attēlo vidējo podocītu skaitu uz GBM mikrometru uz 1 nepārtraukta GBM garuma. Nepāra t-tests ar vienādu SD: P=0.7512. Lai optimizētu šī attēla skatīšanu, lūdzu, skatiet šī raksta tiešsaistes versiju vietnē www.nieres-international.org.

Šeit mēs izmantojām hipertensijas modeli, kura pamatā ir AngII perfūzija un HSD. Podocīti uzrāda AT1 receptorus un ir pakļauti brīvi filtrētiem peptīdiem, piemēram, AngII.13,16,26,61–65. Tiek pieņemts, ka novērotā RAAS inhibīcijas renoprotektīvā iedarbība vismaz daļēji varētu būt saistīta ar šī podocītu bloķēšanu. specifisks RAAS. Tāpat in vivo pētījumi apstiprināja AngII ietekmi uz podocītu bojājumiem, un AT1 podocītu specifiskā gēnu mērķēšana parādīja, ka AT1 receptoru aktivācija glomerulos eksperimentālā lupus nefrīta gadījumā ir pietiekama, lai paātrinātu.nierestraumas, ja nav hipertensijas.66,67 Kalpaīna mediētsautofagijadisregulācija mūsu modelī var būt saistīta ar tiešu AngII-AT1 signalizāciju uz podocītiem vai būt hipertensijas sekas. Mēs varam sniegt ātru atbildi uz šo jautājumu. Patiešām, DOC-sāls modelī mēs konstatējām arī P62 uzkrāšanos podocītos no hipertensīvām pelēm (papildu attēls S3). Tas liek domāt, ka šajā modelī podocītos notiek autofagijas blokāde, kas, domājams, ir neatkarīga no AngII.68 Būtu jānosaka turpmāki pētījumi, kas novērtē podocītu bojājumus saistībā ar kalpaīna aktivitāti un autofagisko izplūdi pelēm, kurām selektīvi trūkst AT1 podocītos. podocītu autofagija ir atkarīga no tiešas vai netiešas AngII ietekmes.

8. attēls |Kalpastatīnspārmērīga ekspresija novērš angiotenzīna II (AngII) D diētu ar augstu sāls saturu (HSD)autofagijapodocītu pazemināšanās. ( a, b ) Reprezentatīvi imūnfluorescences attēli P62 (zaļš) un Podokaliksīna (PODXL; sarkans) ekspresijai glomerulos no zaļās FL fluorescējošā proteīna (GFP) – LC3 un CSTTg (kalpastatīnstransgēnas) GFP-LC3 pelēm pēc 6 nedēļu ilgas AngII þ HSD. Attēlu apakšdaļas ar galveno norāda lielāku palielinājumu. Kodoli tika iekrāsoti ar Hoechst (zilu). Stieņi =50 mm. (c, d) P62þ laukuma kvantitatīva noteikšana vienā glomerulārā sekcijā. n=9 savvaļas tipa (WT) peles un n=7 CSTTg peles (c) un n=16 GFP-LC3 peles un n=16 CSTTg GFP-LC3 peles d) apakšpunktā. Vērtības tiek parādītas kā atsevišķi diagrammas un vidējais±SEM. Manna-Vitnija tests: **P=0,0033 collā (c), **P=0,0011 collā (d). ( e, f ) reprezentatīvi imunofluorescences attēli GFP (zaļa) un P62 (sarkana) ekspresijai glomerulos no GFP-LC3 un CSTTg GFP-LC3 pelēm pēc 6 nedēļu ilgas AngII þ HSD. Attēlu apakšdaļas ar galveno norāda lielāku palielinājumu. Bultu galviņas norāda uz GFPþ P62þ autofagosomām. g) LC3þ P62þ punktu skaita noteikšana uz vienu podocītu. n=11 GFP-LC3 peles un n=16 CSTTg GFP-LC3 peles. Vērtības tiek parādītas kā atsevišķi diagrammas un vidējais±SEM. Nepāra t-tests ar vienādu SD: P=0.1014. Lai optimizētu šī attēla skatīšanu, lūdzu, skatiet šī raksta tiešsaistes versiju vietnē www.nieres-international.org.

1. tabula|Pielāgots RT2 Profiler PCR masīvs

Kalpaīns-1 un kalpaīns-2 ir visuresošas pro-iekaisuma proteāzes, kuru darbību kontrolēkalpastatīns, to specifiskais inhibitors. Patiešām, kalpastatīns selektīvi inhibē kalpaīnus un līdz šim nevienu citu proteāžu. Calpain aktivizēšana nesen tika saistīta arnierestraumas vairākos patoloģiskos kontekstos.69,70 Tika konstatēts, ka kalcija kanālu transportētāja pārejošā receptora potenciālais kanāls C6 aktivizē kalpaīnu-1 podocītos, izmantojot Ca2þ/kalcineirīna aktivāciju. Pacientu ar fokālo un segmentālo glomerulosklerozi nierēm bija palielināta pārejoša receptoru potenciāla kanāla C6 ekspresija, palielināta kalpaīna un kalcineirīna aktivitāte un samazināta kalpaīna mērķa talīna -1 ekspresija, kas ir ļoti svarīga podocītu citoskeleta stabilitātei.71 Pārejošs receptoru potenciāla kanāls. C6 arī tieši saistās ar kalpainu-1 un kalpainu-2. Šī mijiedarbība ir ļoti svarīga, lai regulētu talīna{11}} šķelšanos un kontrolētu podocītu kustīgumu.72

Transgēnās peles pārmērīgi ekspresēkalpastatīnsir aizsargāti pret asinsvadu remodelāciju un no AngII atkarīgu iekaisumu73; pret iekaisumu glomerulonefrīta,43 sepses,74 vai alotransplantāta atgrūšanas75 modeļos; un pret ar vecumu saistītu iekaisumu.76 Podocītu bojājums šīm pelēm nav izpētīts. Peltjē et al. parādīja, ka pārmērīgakalpastatīnsnovērsa no AngII atkarīgu perivaskulāru iekaisumu nierēs.43 Tādējādi nieru aizsardzību CSTTg pelēm vismaz daļēji varēja nodrošināt ar pretiekaisuma mehānismu. Mēs novērtējam makrofāgu un limfocītu infiltrāciju mūsu modelī un neatradām būtiskas atšķirībasnieresiekaisums starp CSTTg un kontroles pelēm, analizējot globālonieresleikocītu infiltrācija (papildu attēls S6).

Kalpains nesen bija iesaistīts autofagijas regulēšanā (nesen tika pārskatīts Weber et al.53) ar interesantām un bioaizsargājošām īpašībām kalpaīna inhibīcijai diabēta kontekstā, atjaunojotautofagija.77 Šeit mēs ziņojām, ka kalpaīna inhibīcija caurkalpastatīnspārmērīga ekspresija (i) novērsa podocītu bojājumus hipertensijas laikā un (ii) atjaunoja autofagiju podocītos, tādējādi izceļot jaunu kaitīgo kalpaīna aktivācijas lomu hipertensijas laikā, inhibējotautofagija.

Tika pierādīts, ka gandrīz visus ATG proteīnus in vitro šķeļ kalpaīni. 78 Šeit mēs to postulējāmautofagijauzturēšanu hipertensīvām CSTTg pelēm izraisīja kalpaīna inhibīcija. Lai atbalstītu mūsu hipotēzi, mēs parādījām, ka CSTTg podocītiem ir samazināta kalpaīna aktivitāte, ja tie tiek pakļauti AngII in vitro (3.c attēls). Mēs atklājām paaugstinātu ATG5 proteīna līmeni podocītos no CSTTg pelēm, kas liecina, ka kalpastatīna pārmērīga ekspresija šajā kontekstā novērsa kalpaīna izraisītu ATG5 šķelšanos (5.a attēls). Turpretim tika pierādīts, kakalpastatīns-mediētā kalpaīna inhibīcija var būt neatkarīga no to proteāzes aktivitātes inhibīcijas79; tādējādi mēs nevarējām izslēgt autofagijas regulēšanu ar kalpastatīnu neatkarīgi no kalpaīna fermentatīvās aktivitātes.

Rezumējot, šie atklājumi atklāja iepriekš neatzītu lomukalpastatīnspodocītu regulēšanāautofagijaun nodrošināja vadību jaunu terapeitisko stratēģiju izpētei, lai uzlabotu podocītu izdzīvošanu hipertensīvu nefropātiju laikā.

ATKLĀŠANA

Visi autori nav paziņojuši par konkurējošām interesēm.

PATEICĪBA

Šo darbu atbalstīja Institut National de la Santé Et de la recherche Médicale (Inserm) un Université de Paris. IB atbalstīja absolventu stipendija no Ministère de l'Education Nationale, de la Recherche et de la Technologie. OL tika finansēts, izmantojot Eiropas Diabēta izpētes fonda (EFSD) balvu, ko atbalstīja EFSD/Novo Nordisk programma Diabēta izpētei Eiropā un Société Francophone duDiabète (SFD) dotācija. BR un CH finansēja no Eiropas Pētniecības padomes un Eiropas Savienības (P-LT) sākuma dotācijas 107037. YS atbalstīja Fondation de France absolventu stipendija.

Mēs pateicamies Elizabetei Hucai, Nikolasam Peresam, Korinai Suldakai un ERIU970 komandai (Parīzes Universitāte, PARCC, Inserm, Parīze, Francija) par palīdzību dzīvnieku kopšanā un apstrādē, Nikolasam Sorhaindo par bioķīmiskiem mērījumiem (ICB-IFR2, Laboratoire de Biochimie, Hopital Bichat). , Parīze, Francija) un Alain Schmitt un Jean-Marc Massefor transmisijas elektronu mikroskopija (Institut Cochin, Parīze, Francija). Mēs pateicamies Morgane Le Gall (Kočinas proteomiskā iekārta 3P5, Parīze, Francija) par palīdzību in silico analīzē. Mēs atzīstam Veronique Oberweis, Bruno Pillard un Cyrille Mahieux (Parīzes Universitāte, PARCC, Inserm, Parīze, Francija) administratīvo atbalstu.

PAPILDU MATERIĀLS

Papildu fails (PDF)

S1 attēls. Primārā podocītu kultūra ekspresē podocītu marķierus. Western blot analīze podocītu marķieru NPHS1 un NPHS2 ekspresijai primārajā podocītu kultūrā no WT un CSTTg pelēm. Tubulīns (TUBA) kalpo kā iekraušanas kontrole. n=4 peļu pārstāvis katrā genotipā.

S2 attēls. Augsts bazālais podocītu līmenisautofagija. (A, B) Reprezentatīvi imūnfluorescences attēli GFP (zaļa) un NPHS1 (sarkana) ekspresijai glomerulos no GFP-LC3 pelēm, kas apstrādātas vai neapstrādātas ar CQ (80mg/kg) 4 stundas pirms nogalināšanas. Bultu uzgaļi parāda GFP autofagosomas. (C, D) Reprezentatīvi imūnfluorescences attēli GFP (zaļa) un P62 (sarkana) ekspresijai glomerulos no GFP-LC3 pelēm, kas apstrādātas vai neapstrādātas ar CQ (80 mg/kg) 4 stundas pirms nogalināšanas. Bultu galviņas parāda GFPþ P62þ autofagosomas. (A–D) (0 ) apzīmē lielāku palielinājumu. Kodoli tika iekrāsoti ar Hoechst (zilu). Stienis=50 mm. N=4 peles katrā stāvoklī (E–H) Reprezentatīvi imūnfluorescences attēli GFP (zaļš) un P62 (sarkans) ekspresijai primārajos podocītos no GFP-LC3 pelēm, kas apstrādātas (F, H) vai ne (E, G) ) ar bafifilomicīnu A1 (100 nM) 4 stundas. N=5 peles katrā stāvoklī.

S3 attēls. P62 uzkrājas podocītos hipertensijas DOC-sāls modelī. (A – C) Reprezentatīvi imūnfluorescences attēli P62 (zaļš) un PODXL (sarkans) ekspresijai WT pelēm pēc 2 līdz 6 nedēļām DOC-sāls modeļa. (0 ) apzīmē lielāku palielinājumu. Kodoli tika iekrāsoti ar Hoechst (zilu). Stienis ¼ 50 mm. (D) P62 laukuma kvantitatīva noteikšana uz podocītu laukumu (procentos). N=5–6 peles katrā stāvoklī. Vienvirziena dispersijas analīze: laiks P=0.0059, Sidaka vairākkārtējais salīdzināšanas tests: D42 pret D14 **P=0.0055, D28 pret D14 P=0.8590.

S4 attēls. Podocītsautofagijair neaizstājams podocītu attīstībai. (A) sistoliskais asinsspiediens, (B) urīna albumīna un kreatinīna attiecība un (C) urīnvielas slāpekļa līmenis asinīs Atg5lox/lox un Nphs2.cre Atg5lox/lox pelēm. N=5–6 peles vienam genotipam. Vērtības tiek uzrādītas kā atsevišķi sižeti un līdzekļi±SEM. Manna-Vitnija tests: P=0.7273 (A), P=0.4286 (B) un P=0.6623 (C). (D-E) Reprezentatīvi attēli no Masona trihromu iekrāsotajām glomerulu sekcijām no Atg5lox/lox un Nphs2.cre Atg5lox/lox pelēm. (F – G) Reprezentatīvi imunofluorescences attēli PODXL (zaļa) un WT1 (sarkana) ekspresijai Atg5lox/lox un Nphs2.cre Atg5lox/lox pelēm. Kodoli tika iekrāsoti ar Hoechst (zilu). (D–G) Stienis=50 mm. N ¼ 6 peles vienam genotipam. (H – I) Reprezentatīvi mikroskopu fotomikrogrāfi no glomerulu transmisijas elektronu mikroskopijas sekcijām no Atg5lox/lox un Nphs2.cre Atg5lox/lox pelēm. Stienis=1 mm. N=3 peles vienam genotipam.

S5 attēls.Kalpastatīnspārmērīga izpausme neietekmēnieresfunkcija sākotnējā stāvoklī. (A) urīnvielas slāpekļa līmenis asinīs un (B) plazmas albumīna līmenis 12-nedēļu vecām GFP-LC3 un CSTTg GFP-LC3 pelēm. N=5 GFP-LC3 un N=6 CSTTg GFP-LC3. Vērtības tiek uzrādītas kā atsevišķi sižeti un līdzekļi±SEM. Manna-Vitnija tests: P=0.6623 (A) un P=0.9307 (B). (C, D) Reprezentatīvi attēli no Masona ar trihromu iekrāsotajām glomerulu sekcijām no GFP-LC3 un CSTTg GFP-LC3 pelēm. (E – H) Reprezentatīvi imunofluorescences attēli PODXL (E, F) un NPHS1 (G, H) ekspresijai GFP-LC3 un CSTTg GFP-LC3 pelēm. (C–H) Stienis =50 mm. (I, J) Saistītā PODXL un NPHS1 laukuma kvantitatīvā noteikšana katrā glomerulārā sekcijā. N=5 GFP-LC3 un N=6 CSTTg GFP-LC3. Vērtības tiek uzrādītas kā atsevišķi sižeti un līdzekļi±SEM. Manna-Vitnija tests: P=0.1898 (A) un P=0.8413 (B).

Cistanche-nieru funkcija

S6 attēls.Kalpastatīnspārmērīga ekspresija neietekmē globālo nieru iekaisumu. Reprezentatīvā imūnhistoķīmija F4/80 (A, B) un CD3 (D – E) ekspresijai GFP-LC3 un CSTTg GFP-LC3 pelēm pēc 6 nedēļu angiotenzīna II þHSD lietošanas. Stienis=200 mm. (C, F) Saistītā F4/80 un CD3 laukuma kvantitatīvā noteikšana uz vienunieressadaļā. N=7 CSTTg GFP-LC3 un N=8 GFP-LC3 peles. Vērtības tiek parādītas kā atsevišķi diagrammas un nozīmē SEM. Manna-Vitnija tests: P=0.3969 (C) P= 0.3357 (F).

S7 attēls. Podocītsautofagijadeficiency does not induce ER stress or oxidative stress in young adults at baseline. qPCR analysis of the mRNA expression of genes of the ER stress, oxidative stress, and apoptosis pathway by Qiagen qPCR array in glomeruli from WT and Nphs2.cre Atg5lox/lox mice (A) and WT and CSTTg mice (B). N=4 mice per genotype. For Nox3, Ct >33.

S1 tabula. Kalpaīna šķelšanās vietu in silico pārbaude. Kalpaīna šķelšanās vietas tika prognozētas ar podocītiem saistītos un ar autofagiju saistītos proteīnos ar GPS-CCD (//ccd.biocuckoo.org), CaMPDB (HTTP:// calpain.org) un DeepCalpain Predict (//deepcalpain). vēzis. info/help.php). Papildu fails (Excel)

Papildu tabula S2. Pilns kalpaīna šķelšanās vietu in silico priekšskatījuma fails. Tika prognozētas kalpaīna šķelšanās vietas ar podocītiem saistītās unautofagija- saistīti proteīni ar GPS-CCD (http://ccd. biocuckoo.org), CaMPDB (http://calpain.org) un DeepCalpain Predict (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php). Prognozēšanas šķelšanās vietas tiek atsāktas katram proteīnam GPS-CCD un DeepCalpain Predict.

ATSAUCES

1. Coresh J, Selvin E, Stevens LA u.c. Hronisku izplatībanieresslimība Amerikas Savienotajās Valstīs. JAMA. 2007;298:2038–2047.

2. Collins AJ, Vassalotti JA, Wang C u.c. Kam vajadzētu būt vērstam uz HNS skrīningu? Diabēta, hipertensijas un sirds un asinsvadu slimību ietekme. Esmu J Nieres Dis. 2009;53:S71–S77.

3. Chang TI, Li S, Chen SC u.c. ESRD riska faktori indivīdiem ar saglabātu aprēķināto GFR ar un bez albuminūrijas: Nieru agrīnās novērtēšanas programmas (KEEP) rezultāti. Esmu J Nieres Dis. 2013;61:S4–S11.

4. Hsu CY, McCulloch CE, Darbinian J u.c. Paaugstināts asinsspiediens un beigu stadijas nieru slimības risks pacientiem bez sākotnējās nieru slimības. Arch Intern Med. 2005; 165:923–928.

5. Nagase M, Shibata S, Yoshida S u.c. Podocītu ievainojums ir Dāla sāls hipertensijas žurku glomerulopātijas pamatā, un to novērš aldosterona blokators. Hipertensija. 2006;47:1084–1093.

6. Garovičs VD, Vāgners SJ, Tērners ST u.c. Podocītu izdalīšanās ar urīnu kā preeklampsijas marķieris. Esmu J Obstet Gynecol. 2007;196, 320.e321–e327.

7. Craici IM, Wagner SJ, Bailey KR u.c. Podociturija ir pirms proteīnūrijas un preeklampsijas klīniskajām pazīmēm: garengriezuma perspektīvs pētījums. Hipertensija. 2013; 61:1289–1296.

8. Wang G, Lai FM, Kwan BC u.c. Podocītu zudums cilvēka hipertensīvās nefrosklerozes gadījumā. Esmu J Hipertensija. 2009;22:300–306.

9. Wang G, Kwan BC, Lai FM u.c. MiRNS intrarenālā ekspresija pacientiem ar hipertensīvu nefrosklerozi. Esmu J Hipertensija. 2010;23:78–84.

10. Ruggenenti P, Perna A, Gherardi G u.c. Hroniskas proteīnuriskas nefropātijas: rezultāti un atbildes reakcija uz ārstēšanu potenciālajā 352 pacientu grupā ar dažādiem nieru bojājumu modeļiem. Esmu J Nieres Dis. 2000;35:1155–1165.

11. Fukuda A, Wickman LT, Venkatareddy MP u.c. No angiotenzīna II atkarīgs pastāvīgs podocītu zudums no destabilizētiem glomeruliem izraisa beigu stadijas progresēšanunieresslimība. Kidney Int. 2012;81:40–55.

12. Tuncdemir M, Ozturk M. Angiotenzīna-II receptoru blokatoru ietekme uz podocītu bojājumiem un glomerulāro apoptozi eksperimentālās streptozotocīna izraisītas diabētiskās nefropātijas žurku modelī. Acta Histochem. 2011; 113:826–832.

13. Nijenhuis T, Sloan AJ, Hoenderop JG u.c. Angiotenzīns II veicina podocītu bojājumus, palielinot TRPC6 ekspresiju, izmantojot NFAT mediētu pozitīvas atgriezeniskās saites signālu ceļu. Esmu J Pathol. 2011;179:1719–1732.

14. EUCLID pētījumu grupa. Randomizēts placebo kontrolēts pētījums par lizinoprilu normotensīviem pacientiem ar insulīnatkarīgu diabētu un normoalbuminūriju vai mikroalbuminūriju. Lancete. 1997;349:1787–1792.

15. de Zeeuw D, Remuzzi G, Parving HH u.c. Proteīnūrija, renoprotekcijas mērķis pacientiem ar 2. tipa diabētisko nefropātiju: mācības no RENTAL. Kidney Int. 2004;65:2309–2320.

16. Benigni A, Gagliardini E, Remuzzi G. Angiotenzīna II izraisītās glomerulārās perm selektivitātes izmaiņas nozīmē podocītu disfunkciju un spraugas diafragmas proteīnu pārkārtošanos. Semins Nefrols. 2004; 24:131–140.

17. Wang L, Flannery PJ, Spurney RF. Angiotenzīna II receptoru apakštipu raksturojums podocītos. J Lab Clin Med. 2003; 142:313–321.

18. Langham RG, Kelly DJ, Cox AJ u.c. Proteīnūrija un podocītu spraugas diafragmas proteīna, nefrīna, ekspresija diabētiskās nefropātijā: angiotenzīnu konvertējošā enzīma inhibīcijas ietekme. Diabetoloģija. 2002;45:1572–1576.

19. Nakamura T, Ushiyama C, Suzuki S u.c. Angiotenzīnu konvertējošā enzīma inhibitora, angiotenzīna II receptoru antagonista un kalcija antagonista ietekme uz urīna podocītiem pacientiem ar IgA nefropātiju. Esmu J. Nefrols. 2000;20:373–379.

20. Henger A, Huber T, Fischer KG u.c. Angiotenzīns II palielina citozola kalcija aktivitāti žurku podocītos kultūrā. Kidney Int. 1997;52: 687–693.

21. Praga M, Hernandez E, Montoyo C u.c. Angiotenzīnu konvertējošā enzīma inhibīcijas ilgtermiņa labvēlīgā ietekme pacientiem ar nefrotisku proteīnūriju. Esmu J Nieres Dis. 1992;20:240–248.

22. Nitschke R, Henger A, Ricken S u.c. Angiotenzīns II palielina intracelulāro kalcija aktivitāti neskarta glomerula podocītos.NieresInt. 2000;57:41–49.

23. Gloy J, Henger A, Fischer KG u.c. Angiotenzīns II modulē podocītu šūnu funkcijas. Kidney Int Suppl. 1998;67:S168–S170.

24. Miceli I, Burt D, Taraba E u.c. Stretch samazina nefrīna ekspresiju, izmantojot angiotenzīna II-AT (1) atkarīgo mehānismu cilvēka podocītos: rosiglitazona iedarbība. Am J Physiol Renal Physiol. 2010;298:F381–F390.

25. Endlich N, Endlich K. Stretch, spriegums un adhēzija — aktīna citoskeleta adaptīvie mehānismi podocītos. Eur J Cell Biol. 2006;85:229–234.

26. Durvasula RV, Petermann AT, Hiromura K u.c. Vietējās audu angiotenzīna sistēmas aktivizēšana podocītos ar mehānisku celmu. Kidney Int. 2004;65:30–39.

27. Riser BL, Cortes P, Heilig C u.c. Cikliskais stiepes spēks selektīvi regulē transformējošās augšanas faktora beta izoformas kultivētās žurku mezangiālajās šūnās. Esmu J Pathol. 1996;148:1915–1923.

28. Kretzler M, Koeppen-Hagemann I, Kriz W. Podocītu bojājumi ir būtisks solis glomerulosklerozes attīstībā uni nefrektomizētām dezoksikortikosterona hipertensīvām žurkām. Virchows Archiv. 1994;425:181–193.

29. Jung HS, Chung KW, Won Kim J u.c. Autofagijas zudums samazina aizkuņģa dziedzera beta šūnu masu un darbību, kā rezultātā rodas hiperglikēmija. Šūnu Metab. 2008; 8:318–324.

30. Ebato C, Uchida T, Arakawa M u.c.Autofagijair svarīga saliņu homeostāzē un kompensējošā beta šūnu masas palielināšanā, reaģējot uz diētu ar augstu tauku saturu. Šūnu Metab. 2008;8:325–332.

31. Lenoir O, Jasiek M, Henique C u.c. Endotēlija šūnu un podocītu autofagija sinerģiski aizsargā no diabēta izraisītas glomerulosklerozes. Autofagija. 2015;11:1130–1145.

32. Hartleben B, Godel M, Meyer-Schwesinger C u.c. Autofagija ietekmē jutību pret glomerulārām slimībām un uztur podocītu homeostāzi novecojošām pelēm. J Clin Invest. 2010;120:1084–1096.

33. Sato S, Kitamura H, Adachi A u.c. Divu veidu autofagija podocītos nieru biopsijas paraugos: ultrastrukturāls pētījums. J Submicrosc Cytol Pathol. 2006; 38:167–174.

34. Asanuma K, Tanida I, Shirato I u.c. MAP-LC3, daudzsološs autofagosomu marķieris, tiek apstrādāts podocītu diferenciācijas un atgūšanas laikā no PAN nefrozes. FASEB J. 2003;17:1165–1167.

35. Mizushima N, Levine B, Cuervo AM u.c.Autofagijacīnās ar slimībām, izmantojot šūnu pašgremošanu. Daba. 2008;451:1069–1075.

36. Yang L, Li P, Fu S u.c. Bojāta aknu autofagija aptaukošanās gadījumā veicina ER stresu un izraisa insulīna rezistenci. Šūnu Metab. 2010; 11:467–478.

37. Xie Z, Klionsky dīdžejs. Autofagosomu veidošanās: kodola iekārtas un pielāgojumi. Nat Cell Biol. 2007; 9:1102–1109.

38. Kume S, Thomas MC, Koya D. Uzturvielu noteikšana, autofagija un diabētiskā nefropātija. Diabēts. 2012;61:23–29.

39. Kume S, Uzu T, Maegawa H u.c. Autofagija: jauns terapeitiskais mērķisnieresslimības. Clin Exp Nephrol. 2012; 16:827–832.

40. Huber TB, Edelstein CL, Hartleben B, et al. Jaunā lomaautofagijanieru darbībā, slimībās un novecošanā. Autofagija. 2012; 8:1009–1031.

41. Weide T, Huber TB. Autofagijas ietekme uz glomerulāro novecošanos un slimībām. Cell Tissue Res. 2011; 343:467–473.

42. Bork T, Liang W, Yamahara K u.c. Podocīti uztur augstu autofagijas bazālo līmeni neatkarīgi no mtor signalizācijas. Autofagija. 2020; 16:1932–1948.

43. Peltier J, Bellocq A, Perez J u.c. Kalpaīna aktivācija un sekrēcija veicina glomerulāru bojājumu eksperimentālā glomerulonefrīta gadījumā: pierādījumi nokalpastatīns- transgēnās peles. J Am Soc Nephrol. 2006;17:3415–3423.

44. Moeller MJ, Sanden SK, Soofifi A u.c. Cre rekombināzes podocītu specifiskā ekspresija transgēnās pelēs. Genesis. 2003;35:39–42.

45. Hara T, Nakamura K, Matsui M u.c. Bazālās autofagijas nomākšana nervu šūnās izraisa neirodeģeneratīvu slimību pelēm. Daba. 2006; 441: 885–889.

46. ​​Lazareth H, Henique C, Lenoir O u.c. Tetraspanīns CD9 kontrolē parietālo epitēlija šūnu migrāciju un proliferāciju un glomerulārās slimības progresēšanu. Nat Commun. 2019;10:3303.

47. Bollee G, Flamant M, Schordan S u.c. Epidermas augšanas faktora receptors veicina glomerulāru bojājumu un nieru mazspēju strauji progresējoša pusmēness glomerulonefrīta gadījumā. Nat Med. 2011;17:1242–1250.

48. Lenoir O, Milon M, Virsolvy A u.c. Tieša endotelīna-1 iedarbība uz podocītiem veicina diabētisko glomerulosklerozi. J Am Soc Nephrol. 2014;25:1050–1062.

49. Henique C, Bollee G, Lenoir O u.c. Kodolfaktora eritroīdā 2-saistītais 2. faktors veicina peroksisomu proliferatora aktivētā receptora g podocītiem specifisku ekspresiju, kas ir būtiska rezistencei pret pusmēness GN. J Am Soc Nephrol. 2016;27:172–188.

50. Perez J, Dansou B, Herve R u.c. T limfocītu izdalītie kalpaīni sašķeļ TLR2, lai kontrolētu IL-17 ekspresiju. J Immunol. 2016; 196:168–181.

51. Raimbourg Q, Perez J, Vandermeersch S u.c. Kalpains/kalpastatīnssistēmai ir pretēja loma melanomas augšanā un metastātiskā izplatīšanā. PLoS One. 2013;8:e60469.

52. Letavernier B, Zafrani L, Nassar D u.c. Kalpaīni veicina asinsvadu atjaunošanos strauji progresējošā glomerulonefrīta formā: to eksternalizācijas iespējamā loma. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012; 32:335–342.

53. Weber JJ, Pereira Sena P, Singer E u.c. Divu dusmīgu putnu nogalināšana ar vienu akmeni:autofagijaaktivizēšana, inhibējot kalpaīnus neirodeģeneratīvās slimībās un ne tikai. Biomed Res Int. 2019; 2019: 4741252.

54. Liu Z, Cao J, Gao X u.c. GPS-CCD: jauna skaitļošanas programma kalpaīna šķelšanās vietu prognozēšanai. PLoS One. 2011;6:e19001.

55. DuVerle D, Takigawa I, Ono Y u.c. CaMPDB: resurss kalpaīnam un modulējošai proteolīzei. Genoma informācija. 2010;22:202–213.

56. Liu ZX, Yu K, Dong J u.c. Precīza kalpaīna šķelšanās vietu un to novirzes prognozēšana, ko izraisa vēža mutācijas. Front Genet. 2019; 10: 715.

57. Yousefifi S, Perozzo R, Schmid I u.c. Kalpaīna izraisītā Atg5 šķelšanās pārslēdz autofagiju uz apoptozi. Nat Cell Biol. 2006; 8:1124–1132.

58. Xia HG, Zhang L, Chen G u.c. Bazālās autofagijas kontrole ar kalpaīna1 mediētu ATG5 šķelšanos.Autofagija. 2010;6:61–66.

59. Russo R, Berliocchi L, Adornetto A u.c. Kalpaīna izraisīta Beclin-1 šķelšanās un autofagijas deregulācija pēc tīklenes išēmiska bojājuma in vivo. Šūnu nāve Dis. 2011;2:e144.

60. Yadav A, Vallabu S, Arora S u.c. ANG II veicinaautofagijapodocītos. Am J Physiol Cell Physiol. 2010;299:C488–C496.

61. Flannery PJ, Spurney RF. Epidermas augšanas faktora receptoru transaktivācija ar angiotenzīna II palīdzību glomerulārajos podocītos. Nephron Exp Nephrol. 2006;103:e109–e118.

62. Harisons-Bernards LM, Navar LG, Ho MM u.c. ANG II AT1 receptoru imūnhistoķīmiskā lokalizācija pieaugušām žurkāmnieresizmantojot monoklonālās antivielas. Am J Physiol. 1997;273:F170–F177.

63. Liebau MC, Lang D, Bohm J, et al. Renīna angiotenzīna sistēmas funkcionālā ekspresija cilvēka podocītos. Am J Physiol Renal Physiol. 2006;290:F710–F719.

64. Pavenstadt H. Franz Volhard Award 2000: angiotenzīna II signalizācija podocītos. Kidney Blood Press Res. 2000;23:156–158.

65. Wennmann DO, Hsu HH, Pavenstadt H. Renīna-angiotenzīna aldosterona sistēma podocītos. Semins Nefrols. 2012; 32:377–384.

66. Jia J, Ding G, Zhu J u.c. Angiotenzīna II infūzija izraisa nefrīna ekspresijas izmaiņas un podocītu apoptozi. Esmu J. Nefrols. 2008; 28:500–507.

67. Crowley SD, Vasievich MP, Ruiz P, et al. Glomerulārie 1. tipa angiotenzīna receptori palielina nieru bojājumus un iekaisumu peļu autoimūna nefrīta gadījumā. J Clin Invest. 2009; 119:943–953.

68. Dziesma K, Stjuarts D, Ābrahams N u.c. Kanāla renīna savākšana neizraisa DOCA-sāls hipertensiju vai nieru bojājumus. PLoS One. 2016;11: e0159872.

69. Liu Z, Ji J, Zheng D u.c. Endotēlija kalpaīna nokaušanas aizsargājošā loma lipopolisaharīdu izraisītā akūtā gadījumānieresievainojums, vājinot p38-iNOS ceļu un NO/ROS veidošanos. Exp Mol Med. 2020; 52:702–712.

70. Seremwe M, Schnellmann RG, Bollag WB. Kalpaīna-10 aktivitāte ir angiotenzīna II izraisītas aldosterona ražošanas pamatā virsnieru glomuma rulosa šūnu modelī. Endokrinoloģija. 2015;156:2138–2149.

71. Verheijden KAT, Sonneveld R, Bakker-van Bebber M u.c. Kalcija atkarīgā proteāze kalpaīns-1 saista TRPC6 aktivitāti ar podocītu bojājumu. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2099–2109.

72. Farmer LK, Rollason R, Whitcomb DJ u.c. TRPC6 saistās ar kalpaīnu un aktivizē to neatkarīgi no tā kanāla aktivitātes un regulē podocītu citoskeletu, šūnu adhēziju un kustīgumu. J Am Soc Nephrol. 2019;30: 1910–1924.

73. Letavernier E, Perez J, Bellocq A u.c. Kalpaīna / kalpastatīna sistēmas mērķauditorijas atlase kā jauna stratēģija, lai novērstu sirds un asinsvadu remodelāciju angiotenzīna II izraisītas hipertensijas gadījumā. Circ Res. 2008; 102:720–728.

74. Zafrani L, Gerotziafas G, Byrnes C, et al.Kalpastatīnskontrolē polimikrobiālo sepsi, ierobežojot prokoagulantu mikrodaļiņu izdalīšanos. Am J Respir Crit Care Med. 2012; 185:744–755.

75. Letavernier E, Dansou B, Lochner M u.c. Kalpaīna / kalpastatīna līdzsvara kritiskā loma akūtā allotransplantāta atgrūšanā. Eur J Immunol. 2011; 41: 473–484.

76. Hanouna G, Mesnard L, Vandermeersch S u.c. Īpaša kalpaīna inhibīcija aizsargānierespret iekaisumu. Sci Rep. 2017;7:8016.

77. Ong SB, Lee WH, Shao NY u.c. Atjaunojas kalpaīna inhibīcijaautofagijaun novērš mitohondriju sadrumstalotību cilvēka iPSC modelī diabēta endo-liopātijai. Stem Cell Rep. 2019;12:597–610.

78. Norman JM, Cohen GM, Bampton ET. Augsto olbaltumvielu šķelšana in vitro ar šūnu nāves proteāzēm. Autofagija. 2010; 6:1042–1056.

79. De Tullio R, Averna M, Pedrazzi M u.c. Kalpaīna-kalpastatīna kompleksa diferenciālā regulēšana ar L-domēnukalpastatīns. Biochim Biophys Acta. 2014;1843:2583–2591.