2. nodaļa: Krüpelam līdzīgs faktors 15 nomāc nieru glomerulāro mezangiālo šūnu proliferāciju, uzlabojot P53 SUMO1 konjugāciju

Lai iegūtu vairāk informācijas. kontaktpersonatina.xiang@wecistanche.com

3 REZULTĀTI

3.1|KLF15-saistošo gēnu skrīnings, izmantojot ChIP-Seq primārajos nieru glomerulārajos MC

Lai identificētu KLF15 tiešās saistīšanās partneru gēnus, mēs veicām ChlP-Seq analīzi un galu galā pārbaudījām 2478 gēnus. Šo gēnu GO analīze, izmantojot rīku vietnē www.uniprot.org (1.A, B attēls), atklāja molekulāro funkciju terminus, kas saistīti ar 1941 gēnu, šūnu komponentu terminus, kas saistīti ar 1662 gēniem, un bioloģiskā procesa terminus, kas saistīti ar 1766 gēniem. Tā kā mūsu mērķis bija noskaidrot, kā KLF15 ietekmē MC, mēs koncentrējāmies uz ar šūnu procesu saistītiem gēniem. No 1315 ar šūnu procesiem saistītajiem gēniem tika konstatēts, ka 74 gēni piedalās šūnu cikla procesos; konkrēti šie gēni piedalījās mitotiskajā šūnu ciklā, šūnu cikla fāzes pārejā un citos procesos (1.C, D attēls). Turklāt mēs analizējām augšanā iesaistītos gēnus un atklājām, ka tie ir saistīti ar attīstības augšanu, šūnu augšanu un citiem augšanas veidiem (1E attēls).

3.2|Diferenciāli regulētu gēnu skrīnings KLF15-pārāk ekspresējošos nieru glomerulāros MC, izmantojot SILAC un LC/MS

SILAC un LC/MS analīze HRMC, kas pārmērīgi ekspresē KLF15, salīdzinot ar vecāku šūnām, ļāva identificēt 1357 proteīnus. Mēs izmantojām DAVID un IPA, lai iegūtu SILAC identificēto kvantitatīvo proteīnu GO domēnus un bagātinātos ceļus. Interesanti, ka daudzi ar proteīnu bioloģiskajām funkcijām saistītie termini bija starp 30 labākajiem ievērojami bagātinātajiem GO terminiem, tostarp šūnu aminoskābju metabolisma procesa regulēšana, proteasomu komplekss, saistīšanās ar olbaltumvielām un transkripcijas un tulkošanas termini, kas visi ir cieši saistīti ar ubikvitinācija (2.A attēls). 2.B attēlā parādīti 30 labākie ievērojami bagātinātie ceļa termini. Vairāki bioloģisko procesu termini, tostarp proteasomu un neirodeģeneratīvo slimību termini, arī bija saistīti ar ubikvitināciju.

Noklikšķiniet, lai uzzinātu parcistanchepārdodu ar detaļām

3,3|KLF15-saistošo gēnu bioinformātikas analīze, kas ir potenciāli saistīti ar nieru glomerulāro MC proliferāciju

Lai izpētītu KLF{0}}saistošos gēnus, kas ir potenciāli saistīti arnieru glomerulāriMC proliferācija, mēs veicām ChIP-Seq datu un SILAC-LC/MS datu bioinformātikas analīzi. Tika pārbaudīti piecdesmit divi gēni (2. tabula un 2.C attēls) un pieci no šiem gēniem, tostarp SUMO1, makrofāgu migrācijas inhibējošais faktors (MIF), eikariotu iniciācijas faktors (EIF), insulīnam līdzīgs augšanas faktors (IGF) un retikulokalbīns (RCN). ), bija cieši saistīti aršūnu proliferācija. Tā kā diferenciāli ekspresēto proteīnu GO un ceļa analīze liecināja, ka skrīninga gēni galvenokārt bija saistīti ar ubikvitinācijas procesu, mēs secinājām, ka SUMO1, ubikvitīnam līdzīgo (UBL) proteīnu saimes loceklis, piedalās pēctranslācijas modifikācijā, kas ir līdzīga ubikvitinācija kā KLF15 mērķa gēns.

Arvien vairāk pierādījumu liecina, ka HG ir viens no galvenajiem faktoriem, kas izraisa diabētiskās nefropātijas attīstību, un tas veicina MC proliferāciju un pastiprinātu matricas sintēzi in vitro.25 Iepriekšējais pētījums parādīja, ka PDGF-BB ir būtiska MC proliferācijai pirms attīstības. glomeruloskleroze eksperimentālā glomerulonefrīta gadījumā.26 Pēc apstiprināšanas, ka MC stimulē HG vai PDGF-BB in vitro, mēs atklājām izmaiņas KLF15 un SUMO1 ekspresijā gan RNS, gan proteīnā.

līmeņos un konstatēja, ka šīm molekulām bija līdzīgas tendences (attēls 2D-l). Visbeidzot, mēs noteicām, ka SUMO1 ir KLF15 mērķa gēns.

3.4|KLF15 pārregulē SUMO-1 gēna ekspresiju, saistoties ar 16 bp CACCCA-SUMO-1 promotora reģionu un ar C un A bagātu motīvu

Mēs izmantojām MEME komplektu (http://meme-suite.org/tools/meme), lai raksturotu KLF15-saistošos motīvus 52 pārbaudītajiem gēniem no KLF15 ChlP-Seq datiem un identificējām KLF saistošo motīvu. (3.A attēls). Turklāt mēs analizējām vairāk nekā tūkstoti bāzu augšpus SUMO1 promotora un atklājām, ka KLF15 var atpazīt un saistīties ar 16 bp secību (nukleotīdi -205~-199), tostarp: CACCCA-(3.B attēls).ChIP-PCR apstiprināja, ka KLF15 ir saistīts ar SUMO1 promotoru, un rezultāti uzrādīja ievērojami augstāku SUMO1 ekspresiju anti-KLF15 antivielu grupā nekā fona kontroles grupā (3.C attēls).

Turklāt mēs veicām divu luciferāzes reportiera testu, lai apstiprinātu mērķēšanas saistību starp SUMO1 un KLF15. Savvaļas tipa SUMO1 promotora grupai bija augstāka luciferāzes aktivitāte nekā pGL3 vektora un mutantu grupām HRMC, un aktivitāti ievērojami palielināja KLF15 pārmērīga ekspresija. Luciferāzes aktivitātes uzlabojumi tika mainīti, transfekējot ar plazmīdu, kas ekspresē mutanta promotora reģionu (3D attēls). Kopumā šie dati liecina, ka SUMO1 ir tiešs KLF15 transkripcijas mērķis.

3.5 |P53 kā SUMO1 SUMOilācijas substrāta skrīnings

SUMO modifikācijas ir plaši izteiktas pēctranslācijas modifikācijas eikariotos. Šo modifikāciju atgriezeniskā konjugācija ar substrāta proteīniem ir pazīstama arī kā SUMOilācija, kurai ir svarīga loma mērķa proteīnu funkciju regulēšanā un kas tālāk piedalās dažādos bioloģiskos procesos, piemēram, nukleocitoplazmas transportā, transkripcijas regulēšanā, apoptozē, proteīnu stabilizācijā, stresa reakcijās un šūnu cikla progresēšana.27 Lai izpētītu pakārtotās signalizācijas molekulas, kas tieši konjugētas ar SUMO1, mēs veicām SUMO1 tīkla analīzi, izmantojot IPA datu bāzi, un dati parādīja, ka SUMO1 var tieši konjugēt ar P53, APP, JUN un AKT, cita starpā. olbaltumvielas (4A-C attēls). Sākotnēji mēs izvēlējāmies P53 kā SUMO1 pakārtoto molekulu, jo tas ir labi zināms proteīns, kas ir cieši saistīts ar šūnu proliferāciju. 28.29 Turklāt mēs izmantojām SUMOsp programmatūru, lai prognozētu iespējamās P53 dažādu sugu SUMOilācijas sekvences, un atklājām, ka P53 ir SUMOilācijas secība. 4.D attēls). Lai noteiktu, vai P53 patiešām modificē SUMOilācija, mēs īslaicīgi transfektējām HRMC ar SUMO1 pārmērīgas ekspresijas plazmīdu vai SUMO1 siRNS. Gan IP, gan Western blot rezultāti atklāja SUMO1-P53 un P53 ekspresijas izmaiņu tendences, kas atbilst izmaiņām. SUMO1 (4. E-J attēls). Šie dati liecina, ka P53 ir SUMO1 SUMOilācijas substrāts.

3.6|KLF15 kavē MC proliferāciju, veicinot SUMO1 ekspresiju un P53 SUMOilāciju

Lai noteiktu P53 SUMOilācijas un MC proliferācijas regulēšanu ar KLF15 un SUMO1, mēs iejaucāmies KLF15 vai SUMO1 ekspresijā HRMC un apstrādājām HRMC ar PDGF-BB. Starp PDGF-BB apstrādātajiem HRMC šūnām, kas tika transficētas ar KLF15 pārmērīgas ekspresijas plazmīdu, bija augstāka SUMO1-P53, P53, KLF15 un SUMO1 ekspresija nekā šūnām, kas tika transficētas ar KLF15 kontroles plazmīdu. Tādas pašas izmaiņas SUMO1-P53, P53 un SUMO1 tika konstatētas SUMO1 pārmērīgas ekspresijas plazmīdu transfektētajās šūnās, savukārt KLF15 ekspresija šajās šūnās nemainījās (5A-F attēls). PDGF-BB ir viens no visefektīvākajiem līdz šim aprakstītajiem MC augšanas faktoriem, un tika novērota HRMC proliferatīvā reakcija uz PDGF-BB. Kā parādīts 5G, H attēlā, EdU pozitīvo šūnu procentuālais daudzums tika ievērojami palielināts, ievadot rekombinanto PDGF-BB. EdU krāsošanas rezultāti liecināja, ka gan KLF15, gan SUMO1 pārmērīga ekspresija inhibēja PDGF-BB izraisītu šūnu proliferāciju (5G attēls, H).

Lai iegūtu plašāku ieskatu KLF15 un SUMO1 lomās proliferējošajos HRMC, mēs transfekējām šūnas tikai ar SUMO1 siRNS vai kotransfektējām tās ar SUMO1 siRNS un KLF15 pārmērīgas ekspresijas plazmīdu. SUMO1 pazemināta regulēšana neietekmēja KLF15 ekspresiju, bet SUMO1-P53 un P53 ekspresijas līmeņi acīmredzami samazinājās pēc SUMO1 siRNS transfekcijas (6.A-C attēls). Turklāt, ja SUMO1 ekspresija tika inhibēta, SUMO1-P53 un P53 ekspresijas līmeņi tika nomākti pat šūnās, kas pārmērīgi ekspresē KLF15 (6D-F attēls). Pēc tam MC proliferācija tika novērtēta, izmantojot EdU krāsošanas testu. SUMO1 RNAi pastiprināja PDGF-BBon HRMC proliferatīvo efektu, un grupai, kas tika kotransficēta ar KLF15 pārmērīgas ekspresijas plazmīdu un SUMO1 siRNS, bija vairāk EdU pozitīvu šūnu nekā grupai, kas tika kotransficēta ar pārmērīgas ekspresijas plazmīdu un hibrīda sekvences kontroles siRNS (6.G attēls, H). . Tāpēc mēs secinām, ka KLF15 nomāc MC proliferāciju, uzlabojot P53 SUMOilāciju.

3.7|Globālā SUMO1 un P53 ekspresija glomerulāros MC ir negatīvi korelē ar MC proliferāciju žurku Thy-1 nefrīta gadījumā

Anti-Thy1 nefrīts ir klasisks pašierobežota mezangiālā proliferatīvā glomerulonefrīta modelis ar proliferācijas fāzi un atveseļošanās fāzi. Mēs injicējām Thy1 antivielu Wistar žurkām, lai izveidotu šo modeli. Gan seruma urīnvielas slāpeklim, gan kreatinīnam nav būtisku izmaiņu starp kontroles žurkām un paraugžurkām (S1 attēls). Zurku modeļu proliferācijas fāzē (5. un 7. dienā) tika novērota izteikta mezangiālā proliferācija un ECM uzkrāšanās, un MC skaits samazinājās atveseļošanās fāzē 10. dienā (7.A attēls). Mēs arī atklājām ekspresijas izmaiņas šūnu proliferācijas marķierā PCNA, izmantojot IHC (7.A, B attēls). PCNA līmenis palielinājās 5. dienā, sasniedza maksimumu 7. dienā un pazeminājās 10. dienā (7.F attēls). Western blot analīze parādīja, ka P53, SUMO1 un KLF15 proteīna ekspresija izolētos glomerulos modeļu grupās bija zemāka nekā kontroles grupā (7.C, D attēls), kas atbilst imūnhistoķīmiskajiem rezultātiem (7.E, F attēls). Šie rezultāti liecina, ka MC patoloģiska proliferācija anti-Thy1 modeļa žurkām ir saistīta ar zema līmeņa KLF15 un SUMO1 ekspresiju. Paredzams, ka traucēšana šo molekulu ekspresijai mazinās patoloģisko fenotipu žurkām.

4 DISKUSIJA

Theglomerulosir filtrēšanas vienībasnieres. Glomerulārās funkcijas traucējumus var izraisīt primārā glomerulārā patoloģija vai sekundāri sistēmisku slimību dēļ. Mezangiālās izmaiņas tika novērotas pēc glomerulārā ievainojuma, tostarp MC hiperproliferācijas, kam sekoja pārmērīga ECM (mezangiālā paplašināšanās) ražošana un ķīmijatraktanta veidošanās iekaisuma šūnām. Tāpēc MC reakciju modulācija, īpaši patoloģiska proliferācija, ir jauna terapeitiska pieeja. KLF15 ir proteīns, kam ir regulējoša loma kā transkripcijas faktors, saistoties ar specifiskām DNS sekvencēm. Daudzos pētījumos ir ziņots, ka KLF15 ir iesaistīts šūnu proliferācijas regulēšanā. Piemēram, ir konstatēts, ka KLF15 piedalās ar MC proliferāciju saistīto signalizācijas ceļu inhibēšanā, bet literatūrā nav ziņots par tā tiešo mērķa gēnu. Tāpēc šis pētījums galvenokārt ietvēra kopīgu transkripcijas un translācijas līmeņu skrīningu, lai identificētu KLF15 tiešo mērķa gēnu.

KLF15 regulē dažādus gēnus dažādās sugās un dažādos audos un orgānos. MC proliferācijas regulēšanas procesā KLF15 ietekmē vairāku gēnu ekspresiju un piedalās vairākos ceļos.131,32 Lai izpētītu KLF15 tiešos mērķa gēnus, mēs izmantojām ChIP-Seg.Klein RH un viņa kolēģi izmantoja ChlP-seq. tehnoloģiju, lai pētītu KLF7 regulējumu radzenes epitēlija šūnu diferenciācijā.33 Ying M et al izmantoja šo metodi, lai pētītu KLF9 inhibējošo ietekmi uz glioblastomas pluripotenci.34 Salīdzinot ar ChlP mikroshēmu, ChIP-Seq nodrošina patiesu visa genoma analīzi. ar augstāku izšķirtspēju, augstāku noteikšanas jutību un mazāku parauga lieluma pieprasījumu.35 Mēs izmantojām ChP, lai iegūtu DNS fragmentus, kas tieši saistīti ar KLF15, un pēc salīdzināšanas un analīzes ar GenBank mēs pārbaudījām 2478 iespējamos mērķa gēnus. Izmantojot GO un ceļu analīzi, mēs identificējām daudzus mērķa gēnus, kas iesaistīti šūnu ciklā un proliferācijas procesos.

ChlP-Seq eksperimentiem ir nepieciešama PCR noteikšanas signāla pastiprināšanai, un zināma pakāpe amplifikācijas procesa laikā ir neizbēgama. Turklāt ChIP-Seq iegūst tikai tos gēnus, kurus var saistīt KLF15, un nenorāda uz izmaiņām, kas notiek šo gēnu ekspresijā, mainoties KLF15 ekspresijai. Mēs izmantojām SILAC-LC / MS proteomikas analīzi, lai kompensētu šos trūkumus. Šis paņēmiens sniedz informāciju par visiem proteīniem, kuru ekspresija mainās, regulējot KLF15, ieskaitot proteīnus, ko tieši regulē KLF15, un proteīniem, kas ir netieši regulēti vai pēc translācijas modificēti. HRMC tika kultivēti, izmantojot SILAC, un KLF15 tika pārmērīgi ekspresēts šūnās, izmantojot plazmīdu transfekciju. Olbaltumvielas tika savāktas LC / MS noteikšanai, un tika iegūti 1357 atšķirīgi ekspresēti proteīni. GO un ceļu analīzes atklāja, ka daži no atšķirīgi ekspresētajiem proteīniem bija iesaistīti ubikvitinācijā. Gēnu un olbaltumvielu dati tika krustoti. Tika noņemti gēni, kas nav saistīti ar pētījuma mērķi, un gēni, ko tieši neregulē KLF15; galu galā tika pārbaudīti 52 gēni. Starp tiem tika atlasīti pieci gēni ar acīmredzamākajām ekspresijas atšķirībām, kas bija visciešāk saistīti ar proliferāciju. Ņemot vērā ceļa analīzes, SUMO1 un KLF15 ekspresijas analīzes kombinētos rezultātus proliferējošos HRMC, ChlP-PCR un duālās luciferāzes reportiera testos, proteīns SUMO1 tika izvēlēts kā KLF15 mērķa gēns.

Papildus ubikvitīnam tiek identificēts arvien lielāks skaits UBL proteīnu, 3637, tostarp SUMO, 38 neironu prekursoru šūnu, 8(NEDD8)3940 un interferona stimulētu gēnu 15(ISG15),41. Šie modificējošie proteīni spēcīgi regulē dažādus bioloģiskos procesus. SUMO kovalentā pievienošana substrātiem, ko sauc par SUMOilāciju, ir pēctranslācijas modifikācija, kas iesaistīta virknē šūnu procesu, tostarp kodola-citozola transportā, transkripcijas regulēšanā, apoptozē, olbaltumvielu stabilitātes kontrolē, stresa reakcijās un šūnu cikla progresēšanā.27 SUMO parasti ir. pievienots proteīna substrātu akceptorlizīna atlikumiem, kuros ir konsensa secība, un veicina proteīna-olbaltumvielu mijiedarbības regulēšanu, kā arī subcelulāro nodalījumu un olbaltumvielu stabilitāti.2 sUMO1 kā SUMOS saimes loceklis var ietekmēt šūnu proliferāciju, modificējot substrātu un stabilizējot šūnu ciklu regulējošos proteīnus.43 Tāpēc kopā ar literatūras ziņojumu un visaptverošajiem skrīninga un analīzes rezultātiem mēs koncentrējāmies uz to, kā KLF15 regulē SUMO1 ietekmi uz mezangiālo šūnu proliferāciju.

Lai identificētu SUMO1 substrātus, mēs veicām SUMO1 tīkla analīzi, izmantojot IPA datu bāzi un SUMOsp programmatūru. Apvienojumā ar publicētajiem pētījumiem par P53 mūsu sākotnējie skrīninga dati liecināja par P53 kā SUMO1 pakārtotu molekulu ar SUMOilācijas secību YKxD/E. Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka P53 bija SUMOilācijas substrāts,45 un pastiprināta P53 SUMO1 konjugācija veicināja P53 stabilitāti un aktivitāti un izraisīja se-nescenci.46 Mūsu pētījumā SUMO1 ekspresijas traucējumi HRMC izraisīja tādas pašas izmaiņu tendences SUMO1-P53 un P53, norādot, ka P53 bija SUMO1 SUMOilācijas substrāts.

Jaunie pierādījumi liecina, ka SUMOilācijai un de-SUMOilācijai ir nozīme daudzās nefropātiskās slimībās, piemēram, nieru disģenēzē, nieru karcinomā, glomerulārās slimībās, podocītu apoptozē un nieru medulla hipertonijā, akūtā nieru bojājumā un nefrolitiāzē.7-51 Lai precizētu saikni starp KLF15, SUMO1, P53 SUMOilāciju un MC proliferāciju, mēs veicām virkni transfekcijas procedūru šūnām, kurām bija veikta PDGF-BB izraisīta proliferācija. KLF15 pārmērīga ekspresija regulēja SUMO1 ekspresiju, savukārt SUMO1 pārmērīga ekspresija neietekmēja KLF15 ekspresiju. KLF15 vai SUMO1 pārmērīga ekspresija palielināja P53 SUMOilāciju un antagonizēja PDGF-BB izraisīto šūnu proliferāciju. Kad SUMO1 ekspresija tika inhibēta, tika kavēta arī P53 SUMOilācija, un KLF15 zaudēja antagonistisko iedarbību uz šūnu proliferāciju. In vivo. MC proliferācija pakāpeniski palielinājās līdz ar mezangiālā proliferatīvā nefrīta saasināšanos, savukārt KLF15, SUMO1 un P53 ekspresija ievērojami samazinājās. Ņemot vērā integrētos novērojumus šūnās un audos, mēs provizoriski secinām, ka KLF15 regulē P53 SUMOilāciju caur SUMO1, tādējādi kavējot MC proliferāciju.

5 SECINĀJUMI

Daži pētījumi liecina, ka KLF15 ir svarīga loma MC izplatīšanās regulēšanā. Šajā darbā mēs izpētījām MC proliferācijas nomākšanas mehānismus, ko izraisa šis transkripcijas faktors. Mēs identificējām SUMO1 kā galveno KLF15 mērķi MC, izmantojot bioinformātikas analīzi, iesaistot ChIP-Seq un SILAC-LC/MS. Turklāt, izmantojot IPA datubāzi un SUMOsp programmatūru, mēs noteicām, ka P53 bija tiešs SUMO1 substrāts. In vitro un in vivo eksperimenti apstiprināja, ka KLF15 var veicināt SUMO1 ekspresiju un P53 SUMOilāciju, pēc tam kavēt MC proliferāciju (S2 attēls). Šie rezultāti palīdz izprast KLF15 regulējošo lomu MC proliferācijā un nodrošina teorētisku pamatu jaunu ārstēšanas metožu atrašanai ar MC proliferāciju saistītām nieru slimībām.