Lepisorus Thunbergianus kofeoilhīnskābju un to melanoģenēzes inhibējošās aktivitātes raksturojums
Mar 29, 2022
Kontaktpersona: Odrija Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pasts:audrey.hu@wecistanche.com
Hak Hyun Kim, Jae Kwon Kim, Jaehyun Kim, Se-Hui Jung* un Kooyeon Lee*
KOPSAVILKUMS:Hiperpigmentācija, kas rodas no tirozināzes pārmērīgas aktivācijas, izraisa tumšākus plankumus vai plankumus uz cilvēka ādas. Lai gan šīs parādības ir nekaitīgas, joprojām ir liels pieprasījums pēc melanoģenēzes inhibitoriem, lai novērstu hiperpigmentāciju, inhibējot tirozināzi, ātrumu ierobežojošu enzīmu melanoģenēzē. Lai gan Lepisorus thunbergianus ir izmantots tautas līdzekļos kā diurētisks un hemostatisks līdzeklis, tā ietekme uz melanoģenēzi vēl nav ziņots. Šajā pētījumā mēs sagatavojām L.thunbergianus ekstraktu un tā šķīdinātāju frakcijas un novērtējām to bioloģisko aktivitāti pret brīvo radikāļu un melanīna sintēzi. L. thunbergianus ekstrakts inhibēja sēņu tirozināzes aktivitāti efektīvāk nekā arbutīns un ar līdzīgu antioksidantu aktivitāti in vitro. L. thunbergianus šķīdinātāju frakciju anti-melanoģenēzes un antitirozināzes aktivitātes salīdzinošais novērtējums parādīja, ka, inhibējot tirozināzes aktivitāti, butanola frakcijai ir vislielākais potenciāls melanoģenēzes melanomas šūnu inhibīcijai. Izmantojot strukturālo analīzi, izmantojot augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju (HPLC) un KMR spektroskopiju, mēs atklājām, ka galvenie savienojumi butanola frakcijā bija trīs kofeoilhīnskābes atvasinājumi. Trīs atvasinājumiem bija līdzīgas radikāļu attīrīšanas un antitirozināzes aktivitātes in vitro, savukārt tikai 5-kofeoilhīnskābei bija inhibējoša iedarbība uz -MSH izraisītu melanoģenēzi. 5-Kafeoilhīnskābes inhibējošā iedarbība tika pārbaudīta, nosakot melanīna saturu un tirozināzes aktivitāti melanomas gadījumā pēc šūnu apstrādes ar komerciālu savienojumu. Turklāt mēs atklājām, ka 5-kafeoilhīnskābe kavē melanoģenēzi, veidojot vara katjonu no vara-tirozināzes kompleksa. Tādējādi 5-kofeoilhīnskābe vai butanols, kas frakcionēts no L. thunbergianus, var būt noderīgs kosmētikā kā ādas balināšanas līdzeklis.
Cistanche tubulosa: ādas balināšanas līdzeklis.
IEVADS
Melanīnam, dabisko pigmentu grupai, kas sastopama lielākajā daļā organismu, ir svarīga loma augļu, sēnīšu un dārzeņu brūnināšanā un pigmentācijā cilvēka ādā.1 Melanīnu ražo no aminoskābes tirozīna, izmantojot daudzpakāpju procesu, kas ietver fermentatīvu oksidāciju un polimerizāciju. 2 Necilvēkiem melanīna pigmentu sintezē specializēti dendrītu šūnu melanocīti, kas atrodas epidermas un dermas savienojuma vietā, kur sintēzi ierosina ultravioleto (UV) staru iedarbība.3 Melanīna pigments tiek transportēts uz keratinocītiem, lai aizsargātu ādu pret UV stariem un brīvajiem radikāļiem; tādējādi ādas krāsu nosaka melanīna pigmenta izplatības modelis.2 Inmelanīna sintēzes traucējumi izraisa daudzu veidu hiperpigmentāciju, piemēram, melasmu, vasaras raibumus, vecuma plankumus, saules lentigo, pēciekaisuma hiperpigmentāciju un citus hiperpigmentācijas sindromus.4 Vairāk nekā a simts proteīnu ir saistīti ar tomelanīna sintēzi, un starp tiem tirozināze ir ātrumu ierobežojošais enzīms, kas ir atzīts par atbildīgu formelanīna sintēzi.5 Tādējādi lielākā daļa pētījumu darbu, lai novērstu hiperpigmentāciju, ir vērsti uz jaunu spēcīgu vielu identificēšanu, izolēšanu, sintēzi un raksturošanu. tirozināzes inhibitori melanoģenēzes novēršanai.1,6 Vairāki tirozināzes inhibitori, piemēram, kojskābe, arbutīns, hidrohinons, azelaīnskābe, ellagskābe un traneksamskābe, ir populāri izmantoti kosmētikas rūpniecībā kā pretmelanoģenēzes līdzekļi; tomēr ķīmisko zāļu ierobežojumu dēļ, kas ietver citotoksicitāti un blakusparādības, joprojām ir pieprasīti jauni materiāli ar uzlabotu drošību, stabilitāti un efektivitāti.
Dabiski produkti, tostarp augi, baktērijas un sēnītes, ir kļuvuši par alternatīviem avotiem efektīvu ādu balinošu sastāvdaļu atklāšanai to mazākas toksicitātes un labākas bioloģiskās saderības un biopieejamības dēļ.1,8 Lepisorus thunbergianusis ir Polypodiaceae dzimtas paparde, kas aug pie vecām iežiem. vai koku miza un ir izplatīta Austrumāzijas mērenajos reģionos, piemēram, Korejā, Japānā, Ķīnā, Filipīnās un Indoķīnā. L. thunbergianus ir izmantots kā adiurētisks, hemostatisks līdzeklis un ir pretklepus līdzeklis korejiešu tautas līdzekļos. Iepriekšējie pētījumi ziņoja, ka L. thunbergianusekstraktam ir lokāla antilipīdu peroksidācijas aktivitāte vietējā un antioksidanta aktivitātē.9 Turklāt L. thunbergianus ekstrakts uzrādīja būtisku no koncentrācijas atkarīgu augšanas kavēšanu mutes vēža un resnās zarnas vēža šūnās.10 L. thunbergianusekstraktam var būt potenciāls pielietojums. kosmētikas rūpniecībā, jo šis augs satur dažādus flavonoīdu savienojumus un daudzas bioaktīvas molekulas, kas ietver kvercetīna 3-metilētera glikozīdu, viteksīnu, austrumu, periodisko glikozīdu, izoviteksīnu, orientīnu, korentīnu un kofeoilhinicīdu.9a Tomēr L. thunbergianus ekstrakta onmelanīna sintēze melanocītos vēl nav noskaidrota.
1. attēls. L. thunbergianus ekstrakta analīze (A) ABTS radikāļu attīrīšanai, (B) antitirozināzei un (C) intracelulārajai ROS attīrīšanas aktivitātei.
Šajā pētījumā mēs sagatavojām L. thunbergianus ekstraktu un tā šķīdinātāju frakcijas, izmantojot sērijveida frakcionēšanu, un pētījām šķīdinātāju frakciju inhibējošo ietekmi uz melanīna biosintēzi B16F10 melanomas šūnās. Mēs identificējām butanola (n-BuOH) frakciju kā lielāko daļu, kas satur dabisko inhibitoru, un tālāk raksturojām no L. thunbergianus ekstraktiem izolēto kofeoilhīnskābes atvasinājumu ietekmi uz melanīna biosintēzes inhibīciju.
cistanche pārskats: antioksidācija
REZULTĀTI UN DISKUSIJA
L. thunbergianus etanola ekstrakts attīra 2,2′-Azinobis(3-etilbenzotiazolīns-6-sulfonskābe (ABTS) Radikāls un inhibē tirozināzes aktivitāti.
L ekstrakcija. thunbergianus ar 70% etanola (EtOH) tika veikta, lai novērtētu iespējamo dabisko savienojumu inhibējošo aktivitāti augā. L.thunbergianus ekstrakta radikāļu attīrīšanas aktivitāte tika noteikta koncentrācijas diapazonā no 2-200 ug/mL. Etanola ekstrakts uzrādīja no koncentrācijas atkarīgu radikāļu attīrīšanas aktivitāti ar maksimālo efektu pie 50 ug/ml, kurā rezultāts atbilda arbutīna rezultātam, ko izmantoja kā pozitīvu kontroli (1.A attēls).
Mēs arī novērtējām ekstrakta inhibējošo ietekmi uz sēņu tirozināzes aktivitāti, mērot tirozināzes katalizētās dopahroma sintēzes ātrumu. Etanolekstrakts inhibēja 87 procentus tirozināzes aktivitātes pie 500 ug/ml, savukārt arbutīns inhibēja tikai 38 procentus tirozināzes aktivitātes tādā pašā koncentrācijā (1.B attēls). Pēc tam mēs novērtējām ekstrakta attīrīšanas aktivitāti uz intracelulāro ROS, kas palielināta par 100 μM ūdeņraža peroksīda. Apstrāde ar ūdeņraža peroksīdu izraisīja B16F10 šūnu intracelulāro ROS līmeņa pieaugumu aptuveni 2{7}} reizes (1. C attēls). Mēs noskaidrojām, ka ūdeņraža peroksīda izraisītais intracelulārās ROS pieaugums tika novērsts ar ekstraktu atkarībā no devas: maksimālā attīrīšanas aktivitāte pie 100 ug/ml bija 78 procenti (1. C attēls). Šie rezultāti liecina, ka L. thunbergianus etanola ekstrakts satur bioaktīvas sastāvdaļas, kas inhibē tirozināzes aktivitāti, kā arī attīra ABTS radikāļus un intracelulāros ROS.
cistanche deserticola ekstrakts: kavē tirozināzes aktivitāti.
L. thunbergianus frakciju inhibējošais potenciāls pret melanoģenēzi.
A crude EtOH extract was fractionated with various solvents including hexane (Hex), methylene chloride (CH2Cl2), ethyl acetate (EtOAc), and butanol to identify and characterize ingredients inhibiting melanogenesis. To identify which solvent fractions have the potential against melanin synthesis, we performed a comparative analysis of four different L. thunbergianus solvent fractions for the radical scavenging and anti-tyrosinase activities. First, to evaluate the antioxidant activity of the four solvent fractions of the L. thunbergianus extract, we determined the ABTS radical scavenging activities in the concentration range of 2−200 μg/ mL. All fractions showed a concentration-dependent increase in ABTS radical scavenging activity (Figure 2A). In particular, EtOAc and n-BuOH fractions completely scavenged the ABTS radical at a 50 μg/mL concentration. The ABTS radical scavenging activity was in the order of n-BuOH > EtOAc >CH2Cl2 > Hex, kas atbilst iepriekšējam ziņojumam.10b Turklāt dažādu šķīdinātāju frakciju inhibējošā iedarbība uz tirozināzes aktivitāti palielinājās atkarībā no koncentrācijas: n-Hex un CH2Cl2 frakciju maksimālā inhibējošā aktivitāte bija zem 65 procentiem, bet EtOAc un n-BuOH frakcijas bija virs 70 procentiem (2.B attēls). Inhibējošā aktivitāte bija šādā secībā: n-BuOH > EtOAc > CH2Cl2 > n-Hex. Šie rezultāti liecina, ka vairāk hidrofilu frakciju, tostarp n-BuOH un EtOAc frakciju, bija augstāka radikāļu attīrīšanas aktivitāte un labāka inhibējošā aktivitāte nekā lipofīlajām n-Hex un CH2Cl2 frakcijām. .
Pēc tam tika pētīta L. thunbergianus šķīdinātāju frakciju ietekme uz melanomas šūnu proliferāciju, apstrādājot B16F10 šūnas ar 200 ug/ml katru no dažādām frakcijām vai 2 mg/ml arbutīna. melanocītu stimulējošā hormona (-MSH) klātbūtne, kas, kā zināms, veicina melanoģenēzi, izmantojot ar mikroftalmiju saistītā transkripcijas faktora (MITF) indukciju.11 Rezultāti parādīja, ka nevienai no frakcijām nebija būtiskas ietekmes uz melanomas šūnu proliferāciju (2.C attēls). Pēc tam mēs pētījām šķīdinātāju frakciju inhibējošo ietekmi uz -MSH stimulēto melanoģenēzi melanomas šūnās. Ārstēšana ar -MSH izraisīja B16F10 šūnu intracelulārā melanīna satura palielināšanos aptuveni 2{13}} reizes (2. D attēls). Mēs atklājām, ka n-BuOH frakcija pilnībā inhibēja -MSH mediēto melanoģenēzi (p < 0,01)="" un="" daļēji="" inhibēja="" etoacfraction="" (40="" procenti,="" p="">< 0,01),="" savukārt="" -msh="" mediēto="" melanoģenēzi="" n-hex="" būtiski="" nemainīja.="" un="" ch2cl2="" frakcijas="" (2.d="" attēls).="" turklāt="" tika="" noteikta="" šķīdinātāju="" frakciju="" inhibējošā="" iedarbība="" uz="" tirozināzes="" aktivāciju,="" ko="" mediē="" -msh,="" jo="" tirozināzei="" ir="" galvenā="" loma="" melanoģenēzē.="" ar="" -msh,="" turpretim="" n-hex="" un="" ch2cl2="" frakcijas="" to="" nedarīja,="" kā="" parādīts="" 2.e="" attēlā.="" turklāt="" ūdeņraža="" peroksīds="" stimulēja="" dažādu="" šķīdinātāju="" frakciju="" attīrošo="" ietekmi="" uz="" intracelulāro="" ros="" pieaugumu.="" visas="" šķīdinātāju="" frakcijas="" apvērsa="" intracelulāro="" ros="" pieaugumu,="" ko="" izraisīja="" ūdeņraža="" peroksīds,="" kā="" parādīts="" 2f="" attēlā.="" šie="" rezultāti="" liecina,="" ka="" l.="" thunbergianus="" buohfrakcija="" inhibēja="" -msh="" izraisītu="" melanīna="" sintēzi,="" inhibējot="" intracelulāro="" tirozināzes="" aktivitāti="" b16f10="" šūnās.="" turklāt="" šie="" rezultāti="" liecina,="" ka="" bioloģiski="" aktīvās="" sastāvdaļas,="" kas="" inhibē="" melanīna="" sintēzi,="" bija="" hidrofilas="" un="" galvenokārt="" tika="" konstatētas="" n-buoh="">
2. attēls. Šķīdinātāju frakciju ietekme uz ABTS radikāļu attīrīšanas, antitirozināzes un anti-melanoģenēzes aktivitātēm.
L. thunbergianus ekstrakta bioaktīvo savienojumu identifikācija un raksturojums.
Lai identificētu un raksturotu sastāvdaļas, kas kavē melanoģenēzi, tika veikta augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas (HPLC) analīze visām šķīdinātāju frakcijām. Šķīdinātāju frakciju HPLC analīze atklāja, ka visas frakcijas satur trīs galvenos savienojumus 1., 2. un 3. savienojuma aiztures laikā attiecīgi 21, 28 un 29 minūtes (3.A–D attēls). Šie trīs galvenie savienojumi tika tālāk izolēti ar preparatīvo HPLC attīrīšanu. Saskaņā ar iepriekšējo ziņojumu trīs galveno savienojumu daudzums n-BuOH frakcijā tika noteikts, izmantojot komerciālus kofeoilhīnskābes atvasinājumus kā iekšējās standarta molekulas.
Pēc tam izolētie savienojumi tika identificēti, salīdzinot to 1H un 13C KMR datus ar literatūru, un tika konstatēts, ka tie atbilst ierosinātajām struktūrām (4. attēls).13 3. E attēlā parādīta trīs savienojumu molekulārā struktūra. Savienojums 1 (raža, 3,2 ± 0,1 mg/100 mg n BuOH frakcija) tika iegūts kā gaiši dzeltens pulveris. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 9,66 (1H, brs), 9,20 (1H, brs), 7,49 (1H, d, J=15,9 Hz), 7,04 (1H, s), 6,99 ( 1H, d, J=8,2 Hz), 6,78 (1 H, d, J=8,1 Hz), 6,23 (1 H, d, J=15,9 Hz), 5,20( 1H, m), 5,08 (1H, brs), 4,89 (1H, brs) 4,13 (1H, m), 3,84 (1H, m), 3,56 (1H, s), 3,35 (1H, s), 1,99 (1H, s). m), 1,92 (1 H, m), 1,89 (1 H, m), 1,79 (1 H, m). 13C{1H} KMR (100 MHz, DMSO-d6) δ (176,42, 168,10, 148,14, 145,53, 144,75, 125,65, 121,07, 115,75, 121,07, 115,75, 3,2,7,8,2,7,8,2,7,8,1,8,114,71). Savienojums 1 tika identificēts kā 3-kofeoilhiniskābe, izmantojot KMR analīzi un salīdzinot ar iepriekšējo literatūru.13b
Savienojums 2 (raža, 14,1 ± 0,1 mg/100 mg n-BuOH frakcija) tika iegūts kā gaiši dzeltens pulveris. 1H KMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 9,64 (1 H, brs), 9,20 (1 H, brs), 7,52 (1 H, d, J=15,9 Hz), 7,06 (1 H, s), 7,02 ( 1H, d, J=8,1 Hz) 6,79 (1 H, d, J=7,9 Hz), 6,30 (1 H, d, J=15,9 Hz), 4,85 ( 1H, brs), 4,70 (1H, d, J=4,9 Hz), 4,12 (1H, brs), 3,95 (1H, m), 1,97 (2H, m), 1,88 (1H, m), 1,83 (1H, m). 13C{1H} KMR (100 MHz, DMSO-d6) δ (176,02, 166,27, 148,28, 145,55, 144,77, 125,54, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 21,19, 115,76. 2. savienojums tika identificēts kā 5-kofeoilhīnskābe, izmantojot KMR analīzi un salīdzinot ar iepriekšējo literatūru.13c
Savienojums 3 (raža, 3,9 ± 0,2 mg/100 mg n-BuOH frakcija) tika iegūts kā gaiši dzeltens pulveris. 1H KMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 9,64 (1 H, brs), 9,20 (1 H, brs), 7,52 (1 H, d, J=15,9 Hz), 7,06 (1 H, s), 7,02 ( 1H, d, J=8,1 Hz) 6,79 (1 H, d, J=7,9 Hz), 6,30 (1 H, d, J=15,9 Hz), 4,85 ( 1H, brs), 4,70 (1H, d, J=4,9 Hz), 4,12 (1H, brs), 3,95 (1H, m), 1,97 (2H, m), 1,88 (1H, m), 1,83 (1H, m). 13C{1H} KMR (100 MHz, DMSO-d6) δ (176,02, 166,27, 148,28, 145,55, 144,77, 125,54, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 21,19, 115,76. Savienojums 3 tika identificēts kā 4-kofeoilhīnskābe, izmantojot KMR analīzi un salīdzinot ar iepriekšējo literatūru.13a
3. attēls. L. thunbergianus (A) n-Hex, (B) CH2Cl2, (C) EtOAc un (D) n-BuOH frakciju HPLC hromatogrammas un trīs galveno savienojumu (E) struktūra.
No L. thunbergianus izolētu kofeoilhīnskābes atvasinājumu inhibējošais potenciāls pret melanoģenēzi.
Pēc tam, lai identificētu bioloģiski aktīvo sastāvdaļu, kas ir spēcīgas anti-melanoģenēzes pamatā, mēs noteicām trīs kofeoilhīnskābes atvasinājumu, kas izolēti no L. thunbergianus, inhibējošo aktivitāti pret melanīna sintēzes inmelanomas šūnām. Pirmkārt, tika pētīta trīs atvasinājumu ietekme uz ABTS radikāļu attīrīšanu. Rezultāti parādīja, ka trim atvasinājumiem bija līdzīgas ABTS radikāļu attīrīšanas aktivitātes (5.A attēls). Pēc tam mēs pētījām trīs no L. thunbergianus ontirozināzes aktivitātes izolēto atvasinājumu inhibējošo iedarbību. Trīs atvasinājumi uzrādīja no koncentrācijas atkarīgu tirozināzes aktivitātes inhibīciju ar maksimālo inhibīciju pie 200 μM koncentrācijas (5.B attēls). Turklāt mēs pētījām trīs atvasinājumu inhibējošo ietekmi uz -MSH izraisītu melanīna sintēzi B16F10 šūnās. Ārstēšana ar -MSH izraisīja intracelulārā melanīna satura pieaugumu B16F10 šūnās aptuveni 2{11}} (5. C attēls). Interesanti, ka savienojumi 1 (3-kofeoilhinīnskābe) un 3 (4-kofeoilhinskābe) ievērojami palielināja melanīna sintēzi attiecīgi par 25 un 23 procentiem (5. C attēls, lpp.< 0.001),="" while="" compound="" 2="" (5-caffeoylquinic="" acid)="" completely="" reversed="" α-msh-induced="" melanogenesis="" (p="" <="" 0.001).="" these="" results="" suggest="" that="" the="" three="" caffeoylquinic="" acid="" derivatives="" with="" similar="" structures="" but="" different="" substitution="" sites="" have="" different="" biological="" activities="" on="" melanogenesis.="" furthermore,="" 5-caffeoylquinic="" acid="" has="" potent="" inhibitory="" activity="" against="">
4. attēls. (A) 3-kafeoilhīnskābes, (B) 4-kofeoilhīnskābes un (C) 5-kofeoilhīnskābes 1H KMR spektri un (D) {{13C KMR spektri 6}}kofeoilhīnskābe, (E) 4-kofeoilhīnskābe un (F) 5-kofeoilhīnskābe
5-Kofeoilhīnskābes pretmelanoģenēzes efektivitātes pārbaude.
Lai pārbaudītu {{0}}kofeoilhīnskābes inhibējošo iedarbību pret melanoģenēzi, mēs noteicām komerciālās 5-kofeoilhīnskābes onmelanīna sintēzes inhibējošo iedarbību, ko veic -MSH. Apstrāde ar mazāku 0,1 un 0,2 mM 5-kofeoilhinīnskābes koncentrāciju nedaudz palielināja melanīna sintēzi un intracelulāri tirozināzes aktivitāti, savukārt augstākas savienojuma koncentrācijas 0,5 un 1 mm apvērsa -MSH mediētu melanoģenēzi. un intracelulārā tirozināzes aktivitāte (6.A, B attēls), kuras rezultāti atbilst iepriekšējam ziņojumam.14
Kofeoilhīnskābe ir fenola savienojums, ko veido estera saite starp kofeīnskābi un L-hinskābi. Ir zināms, ka kofeoilhīnskābes atvasinājumiem ir anti-melanoģenēzes un antitirozināzes aktivitātes, kā arī ROS attīrīšanas aktivitāte. Tirozināze ir daudzfunkcionāls varu saturošs metaloenzīms ar divvērtīgiem vara katjoniem.1 Kofeoilhīnskābes atvasinājumi var inhibēt tirozīnazes aktivitāti, veidojot vara katjonu, kas ir atbildīgs par tirozināzes aktīvā stāvokļa uzturēšanu. Lai prognozētu mijiedarbību starp 5-kofeoilhīnskābi un tirozināzi, tika veikts skaitļošanas molekulārās dokstacijas pētījums, izmantojot Maestroprogrammu. Vislabākā poza savienojumam, savienotai totirozināzei, ir attēlota 6.C, D attēlā. Molekulārās dokošanas pētījums atklāja, ka 5-kafeoilhīnskābe mijiedarbojas ar varu 2,43 Å attālumā un izveido π−π sakraušanas sēriju ar His. 259, Asn 260, His 85 un His 263 atlikumi un H-saite ar Arg 268. Turklāt saistīšanās enerģija starp tirozināzi un 5-kofeoilhīnskābi bija –4,425 kJ/mol. Šie rezultāti liecina, ka 5-kofeoilhīnskābe var kavēt tirozināzes aktivitāti, veidojot vara helātu. Lai pārbaudītu 5-kafeoilhinīnskābes izraisīto melanoģenēzes inhibējošo mehānismu, mēs noteicām 5-kafeoilhīnskābes vara helātu veidošanās spēju. 5-kofeoilhīnskābes vara helātu veidošanās spēja tika palielināta atkarībā no koncentrācijas (6. E attēls). Šis rezultāts liek domāt, ka 5-kafeoilhiniskābe kavē melanīna sintēzi, veidojot helātus vara katjonam, kas mijiedarbojas ar tirozināzi.
5. attēls. Trīs kofeoilhīnskābes atvasinājumu ietekme uz radikāļu attapšanu, in vitro antitirozināzi un anti-melanoģenēzes aktivitāti B16F10 šūnās.
MATERIĀLI UN METODES
Materiāli
L. thunbergianus tika iegādāts no tiešsaistes tirgus www.jirisangol.com (Koreja) un pirms izmantošanas šajā pētījumā tika žāvēts apkārtējās vides apstākļos. Reaģenti, piemēram, 2,2′-cinka bis(3-etilbenzotiazolīna-6-sulfonskābe (ABTS) un 3-(4,5-dimetiltiazols-2- il)-2,5-difeniltetrazolija bromīds (MTT), -melanocītu stimulējošais hormons (-MSH) un fermenti, piemēram, sēņu tirozināze, tika iegūti no Sigma-Aldrich (Sentluisa, MO, ASV). Kālija sulfāts (K2S2O8), pirokatehola violets un 3,4-dihidroksi-L fenilalanīns (L-DOPA) tika iegādāti no Alfa Aesar (Haverhill, MA, ASV).
L. thunbergianus ekstrakcija un frakcionēšana.
Žāvēta L. thunbergianus (80 g) tika pulverizēta, izmantojot pulverizatoru (HBL-3500S, Samyang Electronics, Koreja) un trīs reizes ekstrahēta ar 70 procentiem EtOH (katru reizi 800 ml). ) 70 grādos 3 dienas. Iegūtais ekstrakts tika vakuumfiltrēts, izmantojot Advantecfilter papīru Nr. 1 un 2 (Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokija, Japāna) un koncentrēta, izmantojot Hei-Vap Advantage rotācijas iztvaicētāju (Heidolph, Vācija), lai iegūtu 17,2 g EtOHcrude ekstrakta. Šis neapstrādātais ekstrakts tika suspendēts dH2O (180 ml) un secīgi frakcionēts ar Hex, CH2Cl2, EtOAc un n-BuOH, lai iegūtu Heksu (1,51 g, 8,8 procenti), CH2Cl2 (0,88 g, 5,1 procenti), EtOAc (3,95 g). procenti) un n-BuOH (3,02 g, 17,6 procenti), kā aprakstīts iepriekš.15 Iegūtie ekstrakti un frakcijas pirms lietošanas tika liofilizēti un uzglabāti -80 grādu temperatūrā.
ABTS brīvo radikāļu attīrīšanas aktivitātes noteikšana.
Lai novērtētu L.thunbergianus ekstraktu un tā šķīdinātāju frakciju antioksidantu aktivitāti, tika noteikta ABTSradikālas attīrīšanas aktivitāte, kā aprakstīts iepriekš.16 Lai radītu ABTS radikāli, 10 ml 7 mMABTS tika sajaukts ar 176 μL 140 mM. kālijamperoksidisulfāts dH2O un inkubēts tumsā istabas temperatūrā (RT) 16 stundas pirms lietošanas. ABTS radikāļu šķīdums tika atšķaidīts ar absolūto metanolu, lai iegūtu absorbciju gandrīz 0, 7 pie 734 nm. Katra ekstrakta vai frakciju 100 μL alikvotas norādītajā koncentrācijas diapazonā 2–200 ug/ml pievienoja 100 μL atšķaidīta ABTS radikāļa šķīduma un inkubēja 10 minūtes tumsā RT. Pēc tam absorbcija tika mērīta pie 732 nm, izmantojot SpectraMaxM5 daudzmodu mikroplašu lasītāju (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, ASV). ABTS radikāļu attīrīšanas aktivitāte tika aprēķināta šādi
ABTS radikālas noņemšanas aktivitāte (procenti) =1−(Asample/Acontrol)×100 (1)
In vitro tirozināzes inhibīcija.
L.thunbergianus ekstraktu un tā šķīdinātāju frakciju inhibējošā iedarbība uz tirozināzes aktivitāti tika novērtēta pēc tirozināzes katalītiskās reakcijas rezultātā sintezētā dopahroma daudzuma.2a,17 Īsumā, 50 μL katra ekstrakta vai frakcijas norādītajā koncentrācijas diapazonā tika sajaukti ar 50 50 μL. U/ml sēņu tirozināze 50 mM ar fosfātu buferētā fizioloģiskā šķīdumā (PBS; 8,1 mM Na2HPO4, 1,2 mM KH2PO4, pH 6,8, 2,7 mMKCl un 138 mM NaCl) 96- iedobes plāksnē un RT temperatūrā inkubē 30 minūtes. Pēc tam katrai iedobei pievienoja 100 μL 1 mM L-DOPA, kam sekoja inkubācija vēl 10 minūtes 37 grādu temperatūrā. Iegūtā šķīduma absorbcija tika mērīta pie 475 nm, izmantojot SpectraMax M5 daudzmodu mikroplateerader.
Šūnu kultūra.
B16F10 peles melanomas šūnas tika kultivētas Dulbecco modificētajā Ērgļa barotnē (DMEM) (Gibco, Gaitersburga, ASV), kas papildināta ar 10 procentiem termiski inaktivētu liellopu augļa serumu (Gibco), 100 vienības/ml penicilīna un 100 ug/ml pie streptomicīna 3 grādi streptomicīna. zem mitrināta 5 procentiem CO2.
Šūnu dzīvotspēja.
B16F10 šūnu dzīvotspēja tika noteikta, izmantojot MTT testu, kā aprakstīts iepriekš.18 Īsumā, B16F10 šūnas tika iesētas 24-iedobju plāksnēs ar blīvumu 1 × 104 šūnas katrā iedobē. Pēc 24 stundām šūnas tika apstrādātas ar norādīto L. thunbergianus ekstraktu vai frakciju koncentrāciju 48 stundas. Pēc tam šūnas 4 stundas inkubēja ar MTT šķīdumu, un reducētie formazāna kristāli tika izšķīdināti DMSO. Iegūtais šķīdums tika pārnests uz 96-iedobju plāksnēm, un absorbcija tika mērīta pie 540 nm, izmantojot SpectraMax M5 multimode mikroplašu lasītāju.
Intracelulāro reaktīvo skābekļa sugu (ROS) noteikšana.
Intracelulārais ROS līmenis tika mērīts, izmantojot DCF/H2DCFDA šūnu ROS testa komplektu (ab113851, Abcam), saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Īsumā, B16F10 šūnas tika iesētas 48-iedobju plāksnēs ar blīvumu 2 × 104 šūnas katrā iedobē. Pēc 24 stundu kultivēšanas šūnas 1 stundu apstrādāja ar norādītajām L. thunbergianus ekstraktoru koncentrāciju šķīdinātāju frakcijām 0,1% liellopu seruma albumīnu (BSA) saturošā barotnē bez fenolsarkanā. Pēc tam šūnas 30 minūtes inkubēja ar 100 μM ūdeņraža peroksīdu. Pēc mazgāšanas ar PBS šūnas 45 minūtes apstrādāja ar 25 μMH2DCFDA PBS. ROS līmenis tika analizēts ar mikroplašu lasītāju (Synergy H1, Biotek, Vērmonta, ASV), kas aprīkots ar fluorescences filtru pie 485/545 nm (ierosmes/emisijas viļņa garums). Kontroles vidējā relatīvā fluorescences intensitāte tika pielīdzināta 100 procentiem, proporcionāli aprēķinot ārstēšanas apstākļus.
Melanīna satura noteikšana.
Melanīna saturs tika noteikts, kā aprakstīts iepriekš, ar dažām modifikācijām.19 Melanomas šūnas tika kultivētas sešu iedobju plāksnē 24 stundas. Tos apstrādāja ar norādīto L. thunbergianus ekstrakta vai tā šķīdinātāja frakciju koncentrāciju vēl 48 stundas 100 nM -MSH klātbūtnē. Pēc divreiz mazgāšanas ar atdzesētu Dulbecco fosfātu buferšķīdumu, kas papildināts ar kalcija hlorīdu un magnija hlorīdu (D-PBS, Gibco), iegūtās šūnas tika atdalītas, inkubējot ar tripsīna-EDTA šķīdumu. Pēc centrifugēšanas pie 1000 apgr./min 3 minūtes šūnu granula tika izšķīdināta 150 μl 1 M NaOH, kas satur 10 procentus DMSO, 1 stundu 60 grādu temperatūrā 1 stundu. Melanīna saturs tika noteikts pēc absorbcijas pie 405 nm, izmantojot mikroplašu lasītāju.
Cistanche ekstrakts inhibē melanīnu.
Šūnu tirozināzes aktivitātes noteikšana melanomas šūnās.
Tirozināzes aktivitāte B16F10 šūnās tika pārbaudīta, pamatojoties uz dopahroma daudzumu, kas iegūts intracelulārās tirozināzes katalītiskajā reakcijā.20 Īsumā, melanomas šūnas tika kultivētas sešu iedobju plāksnē 24 h, pēc tam apstrādājot ar dažādām L.thunbergianus ekstrakta vai tā šķīdinātāja koncentrācijām. frakcijas vēl 48 hin ar 100 nM -MSH klātbūtni. Pēc divreiz mazgāšanas ar ledusaukstu D-PBS, šūnas tika lizētas 200 μL radioimūnprecipitācijas testa (RIPA) buferšķīdumā (Sigma-Aldrich), kas satur proteāzes un fosfatāzes inhibitorus. Pēc šūnu lizāta, kas savākts no katras iedobes, centrifugēšanas pie 15,000g 15 minūtes, 100 μL supernatanta sajauca ar 100 μL 1 mM L-DOPA PBS (pH 6,8), kam sekoja inkubācija 30 minūtes 37 grādos. . Dopahroma absorbcija tika mērīta pie 475 nm, izmantojot mikroplašu nolasītāju. Dati tika normalizēti ar olbaltumvielu koncentrāciju, kas noteikta ar bicinhonīnskābes testu.
Bioaktīvo savienojumu izdalīšana un raksturojums, izmantojot HPLC.
HPLC tika veikta ar YL{{0}} (Young Lin Instrument, Koreja), kas aprīkots ar TC-C18 kolonnu (4,6 mm, 250 mm un 5 μm, Agilent, ASV), savienojuma savienojumu ar gradienta sistēmu, kas sastāv no šķīdinātāja A (0,2 procenti skudrskābes) un šķīdinātāja B (MeOH). Slīpuma šķīdinātājs tika iestatīts uz 0-5 min, 15 procenti B; 5–10 min, 15–20 procenti B; 10–15 min, 20–30 procenti B; 15–30 min, 30–40 procenti B; 30–37 min, 40–60 procenti B; 37–40 min, 60–100 procenti B; 40–45 min, 100 procenti B; 45–50 min, 100–15 procenti B; un 50–55 min, 15 procenti B. Lai identificētu sastāvdaļas šķīdinātāju frakcijās, kustīgā fāze tika piegādāta ar plūsmas ātrumu 1 ml/min, un eluēšanas noteikšana tika veikta pie 330 nm. Lai savāktu bioaktīvo sastāvdaļu maksātnespējīgās frakcijas, mobilā fāze tika piegādāta ar plūsmas ātrumu 15,0 ml/min, un eluēšanas noteikšana tika veikta pie 330 nm, izmantojot prep-HPLC (YL-9100 s, Young Lin Instrument, Korea). ), kas aprīkots ar prep-C18 kolonnu (4,6 mm, 212 mm, 10 μm, Agilent, ASV), savienojumā ar gradienta sistēmu, kas sastāv no šķīdinātāja A (0,2 procenti skudrskābes) un šķīdinātāja B (MeOH). Slīpuma šķīdinātāja attiecība tika iestatīta uz 0–10 min, 10 procenti B; 10–20 min, 10–15 procenti B; 20–40 min, 15 procenti B; 40–60 min, 15–20 procenti B; un 60–70 min, 30 procenti B.
Molekulārā modelēšana.
Sēņu tirozināzes kristāliskā struktūra molekulārajai modelēšanai bija agaricustyrosinase (PDB: 2Y9X), kas iegūta no proteīnu datu bankas (PDB). Enzīms tika sagatavots, izmantojot Maestroprogrammā iegulto proteinwizard sagatavošanas darbplūsmu (Maestro, versija 11.9.011, Schrödinger, LLC, NewYork, NY, ASV, 2019). Ūdens un visas pārējās PBP failos esošās molekulas tika noņemtas. Molekulārā dokstacija tika veikta, izmantojot inducētās atbilstības dokstacijas (IFD) protokolu (Schrödinger Suite 2019 Induced Fit Docking protokols), kā ziņots iepriekš.21
Vara helātu veidošanas spēja.
No L. thunbergianus izolēto savienojumu vara helātu veidošanās spēja tika noteikta saskaņā ar iepriekšējo ziņojumu.22 Katrs kofeoilhīnskābes atvasinājums (10 μL) norādītajā koncentrācijā tika sajaukts ar 280 μL 50 mM nātrija acetāta buferšķīduma (pH 6,0). 6 μL 4 mM pirokatehola violeta šķīduma, kas sagatavots tajā pašā buferšķīdumā, un 10 μL 1 ug/μL CuSO4·5H2O. Zilās krāsas izzušana tika novērota, mērot absorbciju pie 632 nm, izmantojot SpectraMax M5 daudzmodu mikroplašu lasītāju. Ūdens tika izmantots kā kontrole, nevis paraugs. Vara helātu veidošanās aktivitāte procentos tika aprēķināta no absorbcijas pie 632 nm, kas ir šāda
vara helātu veidošanās spēja (procenti)=1− (Paraugs/kontrole)×100 (2)
Statistiskā analīze.
Visi šī pētījuma dati tika izteikti kā vidējā ± standarta novirze (SD) no trim neatkarīgiem eksperimentiem. Statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software Inc., Lajolla, CA, ASV). Atšķirības starp kontroles un pakļauto grupu vidējām vērtībām tika analizētas, izmantojot vienvirziena dispersijas analīzi (ANOVA), kam sekoja Daneta post hoctest. Statistiskā nozīmīguma slieksnis visām analīzēm bija p < 0,05="">
SECINĀJUMI
Šajā pētījumā mēs parādījām, ka L. thunbergianus ekstrakti attīra ABTS radikāļus un uzrāda spēcīgu melanīna biosintēzes inhibējošo efektu bez nozīmīgas citotoksicitātes. Abioaktīvā viela, kas atrodas L. thunbergianus un inhibē melanoģenēzi, tika izolēta n-BuOH frakcijā. Turklāt mēs atklājām, ka trīs kofeoilhīnskābes atvasinājumi ir galvenie savienojumi, kas pastāv n-BuOH frakcijā un ka 5- kofeoilhīnskābe ir svarīga sastāvdaļa. nomācot melanoģenēzi melanomas šūnās, inhibējot šūnu tirozināzes aktivitāti. Šeit mēs no L.thunbergianus ekstrakta izolējām dabiskā savienojuma inhibitoru 5-kofeoilhinskābi, lai novērstu hiperpigmentāciju un atklājām tās inhibēšanas mehānismu, kas ir melanoģenēzes pamatā. Tādējādi mūsu atklājumi liecina, ka 5-kofeoilhīnskābe un no L. thunbergianus izolētā n-BuOH frakcija varētu būt noderīgas kosmētikā kā ādas balināšanas līdzekļi.
cistanche šķēles
