Cistanche Deserticola polisaharīds izraisa melanocītu melanoģenēzi, samazina oksidatīvo stresu un veicina balināšanu
Mar 24, 2022
Kontaktpersona:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Yibo Hu1|Jinhua Huang1|Yixiao Li2|Ling Jiang1|Yujie Ouyang1|Lun Yang1|Xiaojiao Zhao1|Lihua Huang3|Hong Xiang3|Jing Chen1 Qinghai Zeng1
Abstrakts
Kā galvenā pigmentācijas traucējumu daļa, ādas depigmentācijas slimības, piemēram, vitiligo un achromic naevus, ir ļoti izplatītas, un tagad tām tiek pievērsta lielāka uzmanība. Depigmentācijas patoģenēze ietver melanocītu disfunkciju un zudumu, ko, iespējams, izraisa iedzimtība, autoimunitāte unoksidatīvs stresss. To vidū galvenā loma ir oksidatīvajam stresam; tomēr dažas klīniskās ārstēšanas metodes var tikt galā ar oksidatīvo stresu. Kā ziņots,Cistanche deserticola polisaharīds(CDP) ir efektīvs antioksidants; pamatojoties uz to, mēs novērtējām tā lomu melanocītos un tālāk atklājām mehānismus. Šajā pētījumā mēs atklājām, ka CDP varētu veicinātmelanoģenēzecilvēka epidermas melanocītos (HEM) un peles melanomas B16F10 šūnās, tas arī izraisīja pigmentāciju zebrafish. TurklātCDPvarētu aktivizēt mitogēnu aktivētās proteīna kināzes (MAPK) signāla ceļu, pēc tam regulēt ar mikroftalmiju saistītā transkripcijas faktora (MITF) un pakārtoto gēnu TYR, TRP1, TRP2 un RAB27A ekspresiju. Pretējā gadījumā mēs atklājām, ka CDP var vājināt H2O2-inducēto citotoksicitāti un apoptozi melanocītos. Papildu pierādījumi atklāja, ka CDP var uzlabot NRF2/HO-1 antioksidantu ceļu un izvadīt intracelulāro ROS. Rezumējot, CDP var veicinātmelanoģenēzeun novērstu melanocītu veidošanosoksidatīvsstresstraumas, kas liecina, ka CDP palīdz uzturēt normālu melanocītu stāvokli. TādējādiCDPvar būt jaunas zāles depigmentācijas slimību ārstēšanai.
ATSLĒGVĀRDI
Cistanche deserticola polisaharīds, depigmentācijas slimība, melanocīti, melanoģenēze, NRF2, oksidatīvais stress
svaigsCistanche
1|IEVADS
Ādas depigmentācijas slimībām, piemēram, vitiligo un achromic naevus, ir raksturīga plankumaina vai plaša ādas depigmentācija.1 Lai gan ādas bojājumi reti izraisa smagus fiziskus ievainojumus, tie ietekmē pacienta izskatu un rada smagu psiholoģisku slogu, pat garīgās veselības traucējumus.2 Galvenās patoloģiskas izmaiņas depigmentācijā ietver melanocītu disfunkciju un zudumu, kas lielā mērā ietekmē melanīna sintēzi un transportēšanu, tādējādi izraisot nepietiekamu melanīna uzkrāšanos ādā.
Ar depigmentāciju saistītie mehānismi pašlaik nav zināmi, taču pētījumos ir konstatēti daži saistīti faktori. No vienas puses, melanocītu funkcija daļēji ir atkarīga no ar mikroftalmiju saistītā transkripcijas faktora (MITF), kas ir labi zināms, ka veicinamelanoģenēzear gēniem saistīti gēni, tostarp tirozināze (TYR), ar tirozināzi saistīto proteīnu 1 (TRP1), ar tirozināzi saistīto proteīnu 2 (TRP2), ar ras saistīto proteīnu Rab-27a (RAB27A) un fascīnaktīnu savienojošo proteīnu 1 (FSCN1) ).4 No šiem gēniem TYR ir galvenā loma melanīna sintēzē, oksidējot l-dopu par dopahinonu.5 No otras puses, pētījumi liecina par vairāku faktoru kombināciju, kas var būt atbildīgi par melanocītu zudumu, tostarp iedzimtība, vide, autoimunitāte. , unoksidatīvais stress.6-9 Starp šiem faktoriem oksidatīvais stress tiek uzskatīts par vissvarīgāko.
Mehānismi,oksidatīvais stressdaļēji atklāta depigmentācija; reaktīvo skābekļa sugu (ROS) pārslodze ir viens no galvenajiem faktoriem.10 ROS pārslodze depigmentācijā ir saistīta ar nelīdzsvarotību starp pro- un antioksidantu sistēmām.11 Viens no elementiem, kas piedalās šajā nelīdzsvarotībā, ir saistīts ar kodolfaktoru eritroīdo 2- 2. faktora/antioksidanta atbildes elementa (NRF2/ARE) antioksidantu ceļa traucējumi.12 Ceļš sastāv no NRF2 un antioksidantiem, piemēram, hema oksigenāzes-1 (HMOX-1, HO-1) , katalāze (CAT), glutationa peroksidāze 1 (GPX1) un NAD(P)H hinona dehidrogenāze 1 (NQO1).13 Ja melanocīti ir pakļauti pārmērīgai ROS iedarbībai, NRF2 var pārvietoties kodolā un saistīties ar konservēto ARE, pēc tam veicināt antioksidantu enzīmu ekspresija. Tomēr dažās depigmentācijas slimībās, piemēram, vitiligo, traucēts NRF2/ARE antioksidantu ceļš nevar efektīvi attīrīt ROS.14
Klīniskās terapijas, ko parasti izmanto depigmentācijā, ietver lokālus vai sistēmiskus kortikosteroīdus, kalcineirīna inhibitorus, šaurjoslas ultravioleto B (NBUVB; 311 nm), 308-nm eksimēru gaismu, autologu epidermas transplantāciju un tradicionālās ķīniešu medicīnas (TCM) terapiju. Kortikosteroīdi un kalcineirīna inhibitori var samazināt patoloģisku imūnsistēmas aktivāciju15, savukārt fototerapijas tiek izmantotas kā pirmās izvēles līdzeklis; jo īpaši, NBUVB stimulē melanocītu proliferāciju un T-šūnu iznīcināšanu,16 savukārt 308-nm eksimēra gaisma izraisa T šūnu apoptozi.17 Turklāt TCM terapijas ietekme ir saistīta ar veicināšanu.melanoģenēze.18 Zināmā mērā šīs metodes palīdz uzlabot depigmentāciju, taču slimības progresēšanas kontrole joprojām ir sarežģīta. Ir nepieciešams izstrādāt jaunas terapijas, īpaši attiecībā uzoksidatīvais stress, kas iepriekš tika atstāts novārtā.
Cistanche deserticola ir pazīstama kā “tuksneša žeņšeņs”.19 Tās sastāvdaļas ir noderīgas etanola izraisītu aknu bojājumu un zarnu iekaisuma hiperplāzijas gadījumā; to var izmantot arī kā pretnoguruma, pretiekaisuma un pretaudzēju reaģentu.20-22 Nesen Guo et al ziņoja, kaCistanche deserticola polisaharīds(CDP), vienai no tās galvenajām sastāvdaļām, piemīt antioksidanta un hepatoprotektīva aktivitāte20; vēl divi pētījumi atklāja tā lomu šūnu aizsardzībā nooksidatīvais stresstraumas skābekļa-glikozes deprivācijas/reperfūzijas un osteoporozes apstākļos.23,24 Tomēr CDP loma depigmentācijas slimībās nav noskaidrota. Šeit mēs centāmies apstiprināt, vaiCDPvarētu ietekmētmelanoģenēzeun aizsargā melanocītus no oksidatīvā stresa.
2|MATERIĀLS UN METODES
2.1|Ķīmiskās vielas un antivielas
Cistanche deserticola polisaharīds(CDP) un l-dopa tika iegādāti no Yuanye Biotec (tīrība ir lielāka vai vienāda ar 98 procentiem; Šanhaja, Ķīna). Ūdeņraža peroksīds (H2O2), dimetilsulfoksīds (DMSO), NaOH, Triton X-100, 4,5-dimetiltiazol-2-il-2, 5-difeniltetrazolija bromīds ( MTT), un aneksīna V-FITC apoptozes noteikšanas komplekts tika iegādāts no Sigma-Aldrich. 4 procenti neitrāls paraformaldehīds tika iegādāts no Biosharp (Hefei, Ķīna); un imūnfluorescences krāsošanas komplekts (Alexa Fluor 488) un 2,7-dihlorfluoresceīna diacetāts (DCFH-DA) tika iegādāti no Beyotime Biotec (Šanhaja, Ķīna). Fontana-Masson traipu komplekts un nukleoplazmas proteīna ekstrakcijas komplekts tika iegādāti no Sloarbio (Pekina, Ķīna). Cilvēka melanocītu augšanas piedeva (HMGS), Dulbecco modificētā Eagle barotne (DMEM) un barotne 254 tika iegādāta no Gibco. Liellopu augļa serums (FBS) tika iegādāts no BI (Kibbutz Beit-Haemek, Izraēla). Primārās antivielas pret aktīnu, TYR, TRP2, RAB27A, FSCN1, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK, p38, p-p38, NRF2 un HO-1 tika iegādātas no primārās šūnu signālu tehnoloģijas. antiviela MITF tika iegādāta no St John's Laboratory, primārā antiviela p-MITF tika iegādāta no Affinity Biosciences, primārā antiviela pret GAPDH tika iegādāta no Bioworld un primārā antiviela pret TRP1 tika iegādāta no EMD Millipore.
2.2|Šūnu kultūra un ārstēšana
Peļu melanomas B16F10 šūnas tika kultivētas barotnē DMEM, kas papildināta ar 10% FBS un 1% penicilīna-streptomicīna antibiotiku maisījumu. Cilvēka epidermas melanocīti (HEM) tika atdalīti no cilvēka priekšādiņas (skatīt mūsu iepriekšējo pētījumu25) un kultivēti barotnē 254, kas papildināta ar HMGS, 5% FBS un 1% penicilīna-streptomicīna antibiotiku maisījumu. Visas šūnas tika kultivētas mitrā inkubatorā 37 grādu temperatūrā ar 5 procentiem CO2. CDP tika izšķīdināts DMSO un pirms lietošanas atšķaidīts ar barotni, DMSO galīgā koncentrācija bija zemāka par 0, 1 procentiem. Pirms lietošanas H2O2 tika atšķaidīts ar barotni.
2,3|Zebrafish audzēšana un ārstēšana
Zebrafish embriji un barotne tika iegādāti no EzeRinka Biotech. Eksperimentālo protokolu apstiprināja Centrālās Dienvidu universitātes Ētikas komiteja. Zebrazivis tika kultivētas 12-iedobju plāksnēs 37 grādu leņķī prom no gaismas un apstrādātas ar dažādu CDP koncentrāciju. Apgriezts mikroskops tika izmantots, lai katru dienu novērotu un reģistrētu melanīnus zebrafish galvās un astēs. Pēc novērošanas mēs mainījām barotni un atkārtoti pievienojāmCDP. Melanīna blīvums zebrafish astēs tika mērīts ar attēlu J, un vērtības ir parādītas kā integrētie optiskie blīvumi (IOD).
2,4|Šūnu dzīvotspēja
Šūnu dzīvotspēja tika mērīta, izmantojot MTT testu. Lai izpētītu citotoksicitātiCDP, HEM un B16F10 šūnas tika implantētas 96-iedobju plāksnēs ar blīvumu 2 × 103 šūnas/iedobē un kultivētas, līdz šūnas tika pievienotas plāksnēm. Pēc tam šūnas tika apstrādātas ar dažādām koncentrācijām (0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 un 320 ug/ml).CDP24, 48 vai 72 stundas. Pirms mērīšanas katrai iedobei pievienoja 20 μL MTT un plāksnes inkubēja 37 grādu temperatūrā 4 stundas. Pēc tam mēs izmetām supernatantu un katrai iedobei pievienojām 160 μL DMSO, lai izšķīdinātu formazāna kristālus. Absorbcijas vērtība pie 490 nm tika mērīta ar daudzmodu plākšņu lasītāju (PerkinElmer). Lai izpētītu CDP ietekmi H2O2- izraisītā citotoksicitātes stāvoklī, HEM un B16F10 šūnas tika izliktas 96-iedobju plāksnēs ar blīvumu 4 × 103 šūnas/iedobē. Šūnas tika apstrādātas ar dažādām koncentrācijāmCDP({0}}, 20, 40 vai 80 ug/mL) 24 stundas, pēc tam katrai iedobei pievienojām H2O2 (galīgās koncentrācijas: 500 μm HEM un 1,0 mm B16F10 šūnām). šūnas inkubēja vēl 24 stundas. Mēs izveidojām ar CDP apstrādātas un negatīvas kontroles (NC) grupas. Atklāšanas soļi bija tādi paši, kā aprakstīts iepriekš.
2,5|Melanīna satura NaOH tests
Šūnas tika kultivētas 100- mm Petri trauciņos un apstrādātas arCDPdažādās koncentrācijās (0, 20, 40 un 80 ug/ml) 48 stundas, pēc tam sagremots ar tripsīnu un savākts 15- ml mēģenēs. Mēs divas reizes mazgājām šūnas ar divreiz destilētu ūdeni, atkārtoti suspendējām 1 ml etanola un samaisījām, lai atbrīvotu melanīnu. Pēc tam mēs centrifugējām (200 g, 5 minūtes) maisījumu un izmetām supernatantu, katrā mēģenē pievienojām 1 ml 10% DMSO (atšķaidīts ar 1 mm NaOH šķīdumu) un suspendējām nogulsnes. Mēs inkubējām suspensiju ūdens vannā 80 grādu temperatūrā 1 stundu, lai izšķīdinātu melanīnu. Visbeidzot, mēs pārnesām 200 μL šķidruma uz 96-iedobes plāksni un izmantojām daudzmodu plākšņu lasītāju, lai izmērītu absorbcijas vērtību pie 470 nm.
Cistancheatsauksmes: kavēmelanīnsražošanu.
2,6|Tirozināzes aktivitātes mērījumi
Šūnas tika kultivētas 100- mm Petri trauciņos un apstrādātas arCDPpirms mērīšanas sagremots ar tripsīnu un savākts 15-mL mēģenēs un divas reizes mazgāts ar fosfātu buferšķīdumu (PBS). Mēs pārvietojām 106 šūnas no katra parauga uz jaunu mēģeni un pēc centrifugēšanas izmetām supernatantu, pēc tam pievienojām šūnu nogulsnēm 1 ml 0.5% Triton X-100 un uzglabājām maisījumu 0 grādos 15 minūtes. Pēc tam kā substrātu pievienojām 1 ml l-dopa (1 mm, atšķaidīts ar 0,1 M fosfāta buferšķīdumu) un sajaucām šķīdumu, pārvietojām 200 μL maisījuma uz { {16}}iedobes plāksni nekavējoties un izmērīja absorbcijas vērtību (A0) pie 475 nm, izmantojot daudzmodu plākšņu lasītāju, atkārtojot mērījumu pēc 10 minūtēm (A10). Tirozināzes aktivitāte tika aprēķināta ar (A10-A0)/105, un rezultāti ir izteikti procentos (procentos) pret negatīvo kontroli.
2,7|Fontana-Masson melanīna krāsošana
Šūnas tika kultivētas 12-iedobju plāksnēs, līdz tika sasniegts 50 procentu blīvums. Pēc apstrādes šūnas 30 minūtes fiksēja ar 4% neitrālu paraformaldehīdu un mazgāja ar destilētu ūdeni. Pēc tam katrai iedobei pievienojām 500 μL Fontana amonjaka-sudraba šķīdumu un 16 stundas uzglabājām plāksnes tumsā, lai krāsotu melanīnu. Pēc tam mēs nomazgājām šūnas ar destilētu ūdeni piecas reizes (katru reizi 1 minūti) un 5 minūtes iemērcām tās 500 μl hiposulfītā; visbeidzot, mēs noņēmām hiposulfītu un vēlreiz skalojam šūnas ar destilētu ūdeni 1 minūti. Pēc tam mēs izmantojām apgrieztu mikroskopu, lai novērotu un reģistrētu melanīnus.
2,8|RNS ekstrakcija un kvantitatīva reversās transkripcijas-polimerāzes ķēdes reakcija
Šūnas tika kultivētas 6-iedobju plāksnēs. Pēc apstrādes šūnas tika sagremotas ar tripsīnu un savāktas 15-mL mēģenēs. Mēs divas reizes mazgājām šūnas ar PBS, pēc tam pievienojām 1 ml līzes buferšķīduma, samaisām maisījumu un novietojām mēģenes uz 5 minūtēm uz ledus, lai šūnas pilnībā lizētu. RNS tika ekstrahēta, izmantojot Total RNA komplektu (Omega Bio-Tek), un reversā transkripcija (RT), izmantojot ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO). Kvantitatīvā reversās transkripcijas-polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) tika veikta, izmantojot KODSYBR qPCR Mix (TOYOBO). RT maisījuma reakcijas tilpums bija 20 μL, savukārt PCR maisījuma reakcijas tilpums bija 20 μL (cDNS 1-8 μL, MIX 10 μL, primer F 1 μL, praimer R 1 μL, pievienojiet DEPC H2O līdz 20 μL ). Eksperimenti tika veikti saskaņā ar protokoliem. Praimeru secības ir norādītas S1 tabulā.
2,9|Olbaltumvielu ekstrakcija un Western blotēšana/imunofluorescence
Šūnas tika kultivētas 100- mm Petri trauciņos. Pēc apstrādes šūnas tika sagremotas ar tripsīnu un savāktas 15-mL mēģenēs. Mēs divas reizes mazgājām šūnas ar PBS, pēc tam pievienojām 500 μL RIPA līzes buferšķīduma (Thermo Fisher), kas papildināts ar 1 mm fenilmetilsulfonilfluorīdu (Thermo Fisher) un 1:100 atšķaidītu fosfatāzes inhibitoru kokteili (Roche). Kodola un citoplazmas proteīns tika ekstrahēts, izmantojot Nucleoplasmic Protein Extraction Kit saskaņā ar ražotāja protokolu. Mēs novietojām mēģenes uz ledus uz 30 minūtēm un ik pēc 5 minūtēm tās maisījām, lai šūnas pilnībā lizētu. Mēs centrifugējām šūnas (200 g, 4 grādi, 15 minūtes), pārvietojām supernatantu uz jaunu mēģeni un izmērījām kopējā proteīna koncentrāciju, izmantojot BCA proteīna testa komplektu (KeyGEN Biotec). Mēs vārījām olbaltumvielas ar 5 reizes iekraušanas buferi (Beyotime Biotec, Ķīna) 100 grādos 10 minūtes, pēc tam uzglabājām –80 grādos. Western blotting tika izmantota poliakrilamīda gēla elektroforēzes (PAGE) metode, un 20 ug katras grupas proteīna tika atdalīti un pārnesti uz polivinilidēna fluorīda membrānu. Pēc antigēna bloķēšanas mēs inkubējām membrānu 16 stundas 1:1000 atšķaidītā primārajā antivielā 4 grādu temperatūrā, pēc tam mazgājām membrānu ar PBST un inkubējām 1:10 000 atšķaidītā fluorescējošā sekundārajā antivielā 1 stundu 37 grādos. . Fluorescences intensitāte tika noteikta, izmantojot Odyssey CLx attēlveidošanas sistēmu (LI-COR). Imunofluorescence tika veikta, izmantojot imūnfluorescences krāsošanas komplektu (Alexa Fluor 488) ar primārās antivielas atšķaidījumu 1:100.
cistanche reddit
2.10|Šūnu apoptozes mērīšana
Šūnas tika kultivētas {{0}} mm Petri trauciņos un apstrādātas ar dažādām koncentrācijām (0, 20, 40 un 80 ug/ml)CDP24 stundas, un katrai iedobei tika pievienots H2O2 (galīgās koncentrācijas: 500 μm HEM, 1,0 mm B16F10 šūnām) un inkubēts vēl 24 stundas. Mēs arī izveidojām CDP apstrādātas un NC grupas. Pēc apstrādes mēs sagremojām šūnas ar tripsīnu, kas nesatur EDTA, un savācām tās mēģenēs, pēc tam divas reizes mazgājām šūnas ar PBS un atkārtoti suspendējām 100 μL PBS. Šūnas tika iekrāsotas ar aneksīna V-FITC apoptozes noteikšanas komplektu saskaņā ar protokolu un noteiktas ar plūsmas citometriju (FCM). Apoptozes ātruma analīzei tika izmantota FlowJo programmatūra.
2,11|Intracelulārais ROS mērījums
Šūnas tika kultivētas {{0}}iedobumu plāksnēs un apstrādātas ar dažādām koncentrācijām (0, 20, 40 un 80 ug/ml)CDP24 stundas, kam mēs pievienojām H2O2 (galīgās koncentrācijas: 500 μm HEM, 1,0 mm B16F10 šūnām), inkubējām tās vēl 24 stundas un izveidojām ar CDP apstrādātas un NC grupas. Pēc apstrādes mēs divas reizes mazgājām šūnas ar PBS, lai noņemtu visu barotni un FBS, pēc tam atšķaidījām DCFH-DA zondi ar barotni līdz 1:1000 un pievienojām katrai iedobei. Mēs inkubējām šūnas 37 grādu temperatūrā 30 minūtes un trīs reizes mazgājām tās ar barotni, kas nesatur serumu. Mēs izmantojām anapgriezts fluorescences mikroskops, lai novērotu un reģistrētu fluorescenci, pēc tam izmantoja ImageJ, lai izmērītu fluorescences intensitāti.
2,12|Statistika un analīze
Dati šajā darbā ir parādīti kā vidējā ± standarta novirze (SD), un statistiskā analīze tika veikta, izmantojot GraphPad Prism (versija 7.0) vai SPSS (versija 22.0) un Studenta t-tests vai vienvirziena dispersijas analīze (ANOVA) tika izmantota vairāku grupu salīdzināšanai. WB proteīna joslu pelēkā vērtība tika standartizēta ar GAPDH vai -aktīnu. Vērtības P < 0,05="" tika="" uzskatītas="" par="" nozīmīgām.="" visi="" eksperimenti="" tika="" atkārtoti="" vismaz="" trīs="">
3|REZULTĀTI
3.1|CDP izraisīja melanoģenēzi HEM un B16F10 šūnās
Pirms sākām, mēs izmantojām MTT testu, lai izpētītu iespējamo CDP citotoksicitāti uz HEM un peles melanomas B16F10 šūnām. Šūnas tika apstrādātas arCDPdažādās koncentrācijās 24, 48 vai 72 stundas. HEM dzīvotspējas pārbaude parādīja, ka tad, kad koncentrācija bija zemāka par 320 ug/ml, CDP neietekmēja šūnu dzīvotspēju; tomēr dzīvotspēja ievērojami samazinājās, koncentrācijai sasniedzot 320 ug/ml pēc 24, 48 un 72 stundām (P < 0,05;="" 1.a="" attēls).="" b16f10="" šūnu="" dzīvotspēja="" arī="" samazinājās="" pēc="" 48="" un="" 72="" stundām,="">CDPsasniedza 320 ug/mL (P < 0,01),="" bet="" izmaiņas="" netika="" novērotas="" pie="" zemākām="" koncentrācijām="" (1.b="" attēls).="" pēc="" tam="" mēs="" sākotnēji="" izpētījām="" cdp="">melanoģenēzeun salīdzināja tā ietekmi ar melanocītus stimulējošā hormona (-MSH; koncentrācijas: 20, 100 un 400 nm) un DMSO (0,1 procents) iedarbību HEM. Melanīna krāsošanas, tirozināzes aktivitātes un melanīna satura analīžu rezultāti liecināja, ka CDP bija salīdzināms ar -MSH, lai veicinātu melanoģenēzi, savukārt 0,1% DMSO apstrādei nebija nekādas atšķirības (S1. attēls).
Mēs attiecīgi uzlabojām savu izpēti. HEM tika apstrādāti arCDPdažādās koncentrācijās (20, 40 un 80 ug/ml) 48 stundas; tika veikti melanīna iekrāsošanās, melanīna satura un tirozināzes aktivitātes testi, un visi uzrādīja būtisku pieaugumu pēc CDP apstrādes atkarībā no koncentrācijas, kas sasniedza maksimumu 80 ug/ml grupā (P < 0,05,="" 2.a-c="" attēls).="" pēc="" tam="" mēs="" izmērījām="" mrns="" un="" olbaltumvielu="">melanoģenēzesaistītie gēni (MITF, TYR, TRP1, TRP2, RAB27A un FSCN1). CDP ievērojami palielināja šo gēnu mRNS līmeni HEM (P < 0,05;="" s2a="" attēls).="" turklāt="" palielinājās="" mitf,="" tyr,="" trp1="" un="" rab27a="" proteīnu="" līmenis,="" kā="" arī="" palielinājās="" fosforilētā="" mitf="" attiecība="" pret="" kopējo="" mitf="" (p="">< 0,05),="" savukārt="" trp2="" un="" fscn1="" neuzrādīja="" atšķirību="" (2.d,="" e="" attēls).="" rezultāti="" liecināja,="" ka="" cdp="" var="" veicināt="" melanoģenēzi="" un="" regulēt="" ar="" melanoģenēzi="" saistīto="" gēnu="" ekspresiju="" cilvēka="">
Turklāt mēs atkārtoti pārbaudījām ietekmiCDPvēlreiz ar B16F10 šūnām un konstatēja, ka melanīna saturs B16F10 šūnās ievērojami palielinājās (P < 0,01;="" s2b="" attēls).="" turklāt="" cdp="" ievērojami="" palielināja="" mrns="">melanoģenēzear gēniem saistītie gēni (P < 0,05; S2C attēls), un MITF, TYR, TRP1, TRP2 un RAB27A proteīnu līmenis arī palielinājās pēc CDP apstrādes (P < 0,05; S2D-E attēls).
1. ATTĒLS CDP citotoksicitāte HEM un B16F10 šūnās.
3.2|CDP veicināja melanoģenēzi zebrafish
Lai izpētītu, vaiCDPvarētu veicinātmelanoģenēzein vivo mēs izmantojām zebrafish embrijus. Zebrafish embriji tika sadalīti četrās grupās un nepārtraukti apstrādāti tikai ar barotni (NC) vai CDP dažādās koncentrācijās (20, 40 un 80 ug/ml); katru dienu tika novērots un reģistrēts melanīna granulu blīvums un sadalījums. Pieaugot zebrazivju embrijiem, mēs atklājām, ka melanīna blīvums pakāpeniski palielinājās galvās un astēs. Trešajā dienā starpgrupu atšķirības bija atšķiramas, un atšķirība turpināja palielināties, līdz mēs pabeidzām eksperimentu 6. dienā (3.A attēls). Mēs izmantojām attēlu J, lai izmērītu melanīna blīvumu zebrazivju astēs; melanīna blīvums CDP ārstētajās grupās bija ievērojami augstāks nekā kontroles grupā (P < 0,05;="" 3.b="">
3,3|CDP aktivizēts MAPK signāla ceļš HEM un B16F10 šūnās
Lai atklātu mehānismus, ar kuriemCDPpaaugstinātsmelanoģenēze, mēs apstrādājām HEM ar CDP dažādās koncentrācijās (20, 40 un 80 ug / ml) 48 stundas un pēc tam pētījām ERK, JNK un p38 proteīnu fosforilēto un kopējo līmeni MAPK signālu ceļā. Kā mēra ar Western blot metodi, p-ERK, p-JNK un p-p38 līmeņi pēc CDP apstrādes bija paaugstināti (P < 0,05),="" savukārt="" kopējais="" to="" līmenis="" nemainījās="" (4.a,="" b="" attēls).="" eksperimenti="" tika="" atkārtoti="" ar="" b16f10="" šūnām,="" un="" tika="" palielināti="" erk,="" jnk="" un="" p38="" proteīnu="" fosforilētie="" līmeņi="" (p="">< 0,05),="" bet="" kopējais="" mapk="" līmenis="" nemainījās="" (4c,="" d="" attēls),="" kas="" atbilst="" rezultātiem.="">
3,4|CDP novājināja H2O2-inducētu citotoksicitāti un apoptozi HEM un B16F10 šūnās
Mēs izmantojām H2O2, lai modelētu oksidatīvā stresa vidi, un tālāk pētījām CDP lomu melanocītos oksidatīvā stresa apstākļos. HEM izmantotā H2O2 galīgā koncentrācija bija 500 μm, savukārt B16F10 šūnās – 1,0 mm. Lai izpētītu CDP ietekmi uz H2O{10}}inducēto citotoksicitāti, mēs iepriekš apstrādājām HEM un B16F10 šūnas arCDPdažādās koncentrācijās (20, 40 un 80 ug/mL) 24 stundas, pēc tam pievienoja H2O2 un turpināja tos apstrādāt 24 stundas pirms novērošanas un MTT testa veikšanas.
H2O2 izraisīja acīmredzamu membrānas burbuļošanu un šūnu saraušanos HEM grupās, kas iepriekš apstrādātas ar CDP, situācija tika atvieglota. Ārstēšanai tikai ar CDP nebija nekādas ietekmes (5.A attēls). MTT tests uzrādīja līdzīgu rezultātu, jo apstrāde ar H2O2 samazināja HEM dzīvotspēju, savukārt CDP būtiski mazināja šo kaitīgo ietekmi (P < 0,01);="" ārstēšana="">CDPviens pats neko nemainīja (5.C attēls). Pēc tam mēs vēlreiz pārbaudījām aizsargājošo efektu B16F10 šūnās. Ārstēšana ar H2O2 izraisīja acīmredzamu membrānas izdalīšanos un šūnu saraušanos, savukārt nelabvēlīgo stāvokli uzlaboja arī CDP B16F10 šūnās (5.B attēls). Tikmēr MTT tests parādīja, ka B16F10 šūnu dzīvotspēja pēc apstrādes ar H2O2 samazinājās, bet ar CDP iepriekš apstrādātajās grupās situācija ievērojami uzlabojās (P < 0,05;="" 5.d="">
Turklāt mēs izmantojām FCM, lai izmērītu H2O2-inducēto HEM un B16F10 šūnu apoptozi. Rezultāti parādīja, ka H2O2 izraisīja nozīmīgu apoptozi HEM un B16F10 šūnās, bet iepriekšēja apstrāde arCDPdažādās koncentrācijās varētu ievērojami samazināt apoptozi; pretējā gadījumā tikai CDP ārstēšana neko nemainīja (5.E, F attēls). Apoptozes ātrums palielinājās pēc H2O2 apstrādes, bet samazinājās grupās, kas iepriekš apstrādātas ar CDP, izmaiņas bija nozīmīgas gan HEM, gan B16F10 šūnās (P < 0,05,="" 5g,="" h="">
2. ATTĒLS CDP veicina melanoģenēzi HEM.
3,5|CDP iztvaicētā H2O2-inducētā intracelulārā ROS HEM un B16F10 šūnās
Lai izpētītu mehānismusCDPLai samazinātu H2O2-inducēto citotoksicitāti un apoptozi, mēs tālāk noteicām intracelulāro ROS HEM un B16F10 šūnās, izmantojot DCFH-DA fluorescences zondi. Apstrāde bija tāda pati, kā aprakstīts iepriekš, tika mērīta fluorescences intensitāte, lai attēlotu ROS līmeni. Kā novērojām HEM, ārstēšana ar H2O2 bija efektīva, lai paaugstinātu ROS, bet CDP ievērojami samazināja intracelulāro ROS ar H2O2- ārstētajās grupās (P < 0,01;="" 6.a,="" c="" attēls);="" turklāt="" cdp="" izmantošana="" vien="" neko="" nemainīja.="" mēs="" atkārtoti="" apstiprinājām="" rezultātus="" b16f10="" šūnās.="" b16f10="" šūnās="" apstrāde="" tikai="" ar="" cdp="" neietekmēja="" ros="" līmeni,="" turpretim="" ārstēšana="" ar="" h2o2="" acīmredzami="" paaugstināja="" ros="" līmeni,="" taču="" šīs="" izmaiņas="" ievērojami="" samazināja="" arī="" cdp="" pirmapstrāde="" (p="">< 0,05;="" 6.b,="" d="">
3,6|CDP paaugstināti regulēts NRF2/HO-1 antioksidantu ceļš melanocītos
Lai vēl vairāk atklātu mehānismus, ar kuriem CDP attīra ROS, mēs vispirms izmērījām proteīna līmeni NRF2/HO-1 antioksidantu ceļā B16F10 šūnās. Mēs noskaidrojām, ka ārstēšana tikai ar CDP būtiski neietekmēja NRF2 un HO-1 proteīnus, bet H2O2-apstrādātajās grupās šo divu proteīnu līmenis ievērojami palielinājās, unCDPpirmapstrāde vēl vairāk uzlaboja pacēlumu (10. lpp.).<.05; figure="" s3).="" moreover,="" we="" investigated="" the="" protein="" levels="" of="" nrf2="" and="" ho-1="" in="" hems="" after="" h2o2="" and/or="" cdp="" treatment.="" the="" results="" showed="" that="" ho-1="" level="" was="" elevated="" in="" h2o2-treated="" groups,="" and="" further="" increased="" in="" cdp="" pretreatment="" groups=""><.05; figure="" 7a,="" b).="" to="" know="" the="" distribution="" of="" nrf2,="" we="" compared="" the="" level="" of="" nuclear="" and="" cytoplasmic="" nrf2="" with="" the="" total="" level="" of="" β-actin="" in="" hems.="" similarly,="" we="" found="" that="" both="" nuclear="" and="" cytoplasmic="" nrf2="" were="" elevated="" under="" h2o2="" treatment;="" their="" levels="" further="" increased="" in="" the="" cdp="" pretreated="" groups.="" based="" on="" that,="" we="" calculated="" the="" ratio="" of="" nuclear="" nrf2="" to="" cytoplasmic="" nrf2.="" the="" result="" suggested="" that="" cdp="" increased="" the="" ratio="" significantly="" at="" concentrations="" of="" 40="" and="" 80="" μg/ml=""><.05; figure="" 7a,="" b).="" using="" immunofluorescence,="" we="" observed="" the="" fluorescence="" of="" nrf2="" in="" hems="" and="" knew="" that,="" under="" h2o2="" treatment,="" the="" nucleus="" seemed="" to="" have="" expanded="" and="" the="" levels="" of="" nrf2="" in="" the="" nucleus="" and="" cytoplasm="" were="" enhanced.="" among="" them,="" the="" cells="" pretreated="" with="">CDPparādīja dažas atšķirības, jo varējām redzēt, ka fluorescence kodolā bija spēcīgāka nekā citoplazmā, un sadalījums bija tuvu trīs CDP koncentrācijās (7.C attēls).
3. ATTĒLS CDP veicina melanoģenēzi zebrafish.
4|DISKUSIJA UN SECINĀJUMI
Šajā pētījumā mēs pētījām lomuCDPHEM un B16F10 šūnās. Pirmo reizi mēs atklājām, ka CDP varētu veicināt melanocītu melanoģenēzi un veicināt pigmentāciju zebrafish. Nākamais eksperiments parādīja, ka MAPK signalizācijas ceļš tika aktivizēts CDP apstrādes laikā. Mēs sīkāk izpētījām tās lomuoksidatīvais stressun atklāja, ka CDP var vājināt H2O2- izraisītu citotoksicitāti un apoptozi melanocītos; tikmēr CDP varētu aktivizēt NRF2/HO-1 antioksidantu ceļu un iztīrīt intracelulāro ROS oksidatīvā stresa apstākļos.
Mitogēna aktivēta proteīna kināze ir būtisks ceļš, kas iesaistīts MITF regulēšanā, kas ir galvenais transkripcijas faktors, kas veicinamelanoģenēze-saistītus gēnus un pēc tam ietekmē melanīna sintēzi un transportu.26,27 Mūsu pētījumā ERK, JNK un p38 aaktivācija melanocītos ievērojami palielinājās pēc CDP terapijas; Tikmēr MITF/p-MITF un MITF vadīto TYR, TRP1, TRP2 un RAB27A izteiksmes tika attiecīgi regulētas. Tādējādi mēs ierosinām, ka CDP var veicinātmelanoģenēzeaktivizējot MAPK ceļu, bet kāCDPaktivizē MAPK paliek nezināms. Saskaņā ar jaunākajiem pētījumiem nodevām līdzīgais receptors 4 (TLR4) ir ļoti izteikts melanocītos un ir iesaistītsmelanoģenēze.28,29 TLR4 ir svarīgs transmembrānas proteīns, kas var specifiski saistīt lipopolisaharīdu (LPS)30; pētījumos ziņots, ka LPS var izraisīt melanoģenēzi.29 Interesanti, ka vairāki polisaharīdi, kas ekstrahēti no augiem vai sēnēm, aktivizēja TLR un pakārtotos signalizācijas ceļus, piemēram, MAPK un kodolfaktora kappa beta (NF-κB).31,32 Tāpēc mums ir aizdomas, kaCDPvar atpazīt un piesaistīt TLR, pēc tam aktivizē pakārtoto MAPK signālu pārraides ceļu un veicinamelanoģenēze. Turklāt ir zināms, ka nukleotīdus saistošie oligomerizācijas domēniem līdzīgie receptori (NLR) atpazīst intracelulāros ligandus un veicina MAPK un NF-κB signālu ceļu aktivāciju.33,34 Kā ziņots, no Ganoderma lucidum un Astragalus ekstrahēti polisaharīdi var iekļūt šūnās. un ietekmēt NLR.35,36 Tādējādi ir iespējams, ka CDP var iekļūt melanocītos un regulēt MAPK signālu ceļu caur NLR. Tomēr ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai pārbaudītu šo hipotēzi.
Daži pētījumi līdz šim ziņoja par augu polisaharīdu izmantošanu melanoģenēzē, lai kavētu melanīna ražošanu.37,38 Tomēr šajā pētījumāCDPpaaugstinātsmelanoģenēzemelanocītos, un šis efekts tika vēl vairāk apstiprināts pēc salīdzināšanas ar -MSH. CDP ir arī sava veida polisaharīds, kas iegūts no augiem, mums ir aizdomas, ka CDP pretējais efekts var būt saistīts ar strukturālajām atšķirībām starp CDP un citiem polisaharīdiem. Polisaharīdi veidojas, polimerizējot monosaharīdus, bet tie atšķiras pēc monosaharīdu veida, monosaharīdu sastāva, glikozīdiskās saites, sānu ķēdes struktūras un molekulmasas39,40; tiek uzskatīts, ka šie faktori nosaka to bioloģiskās funkcijas.41 Esošie pētījumi ir ierosinājuši struktūruCDPun ierosināja, ka CDP struktūra pēc tam ietekmē tās darbību.42 Tādējādi ir nepieciešams vairāk pierādījumu, lai pilnībā izprastu CDP un apstiprinātu mūsu hipotēzi.
Melanoģenēzeir svarīgs aizsargmehānisms, kas nodrošina izturību pret ultravioleto staru bojājumiem un ķermeņa homeostāzes uzturēšanu43; tajā pašā laikā melanocīti ir viegli pakļauti nelabvēlīgai videi, piemēram, ROS pārslodzei.11 Ir zināms, ka ROS piedalās melanoģenēzes veicināšanā, viens no mehānismiem ir MAPK aktivizēšana.44 Taču pētījumi arī atklāja, ka šī ietekme pastāv tikai noteiktā ROS ietvaros. līmenī, savukārt ROS pārslodze pasliktinamelanoģenēzenozīmīgi.45Saistība starp ROS, MAPK un melanoģenēzi dažādos apstākļos ir mainīga, tāpēc acīmredzami svarīgs ir līdzsvars starp pro- un antioksidantu sistēmām. Depigmentācijas slimību, piemēram, vitiligo, gadījumā nelīdzsvarota antioksidantu sistēma un nekontrolējama ROS pārslodze sabojās melanocītus un samazinās šūnu dzīvotspēju.11,46 Šajā pētījumā mēs izmantojām dažādas H2O2 koncentrācijas, lai modelētu ROS pārslodzi šūnās, un HEM bija sliktāka tolerance pret. H2O2 nekā B16F10 šūnas. Kad melanocīti tika pakļauti H2O2 apstrādei, to dzīvotspēja un apoptozes ātrums pasliktinājās, bet CDP pirmapstrāde varēja daļēji mainīt tendenci. Tajā pašā laikā ROS tika izlaupīts. Kā ziņots, NRF2/ARE antioksidācijas ceļa aktivizēšana ir galvenā ROS attīrīšanas metode ādas šūnās.14 Mūsu eksperimentos NRF2 un HO-1 proteīna līmenis melanocītos tika paaugstināts pēc apstrādes ar H2O2 bez CDP; tas nozīmē, ka H2O{21}}izraisītsoksidatīvais stressvar aktivizēt NRF2/HO-1 ceļu, taču ar to nepietiek, lai uzturētu redoksu līdzsvaru un aizsargātu šūnu no ievainojumiem. Tomēr CDP pirmapstrāde uzlaboja NRF2/HO-1 antioksidācijas ceļu un atjaunoja līdzsvaru. Tādējādi mēs ierosinām, ka CDP var aizsargāt melanocītus no oksidatīvā stresa bojājumiem, aktivizējot NRF2/HO-1 antioksidācijas ceļu un attīrot ROS.
Lai iegūtu plašāku informāciju, lūdzu, noklikšķiniet šeit.
Mēs to atradāmCDPārstēšana vien neietekmē ROS vai NRF2/HO-1 melanocītos. Šis rezultāts liek domāt, ka CDP var ietekmēt redoksu līdzsvaruoksidatīvais stress, bet ne normālos apstākļos. Turklāt tiek ziņots, ka NRF2/HO-1 antioksidācijas ceļu regulē PI3K, NF-κB un MAPK signalizācijas ceļi.47,48 Mūsu pētījumā CDP spēja aktivizēt MAPK signalizācijas ceļu. Iespējams, ka CDP var aktivizēt NRF2/HO-1 ceļu, izmantojot augšupregulējošus MAPK. Kā ziņoja Slominskis, melanocīti ir stresa sensori, kas iesaistīti regulējošā tīklā, un to funkcijas var strauji mainīties, reaģējot uz apkārtējo vidi.49 Mēs ierosinām, ka CDP lomu ietekmē melanocītu statuss, tas var veicināt to darbību.melanoģenēzeneietekmējot antioksidantu sistēmu normālos apstākļos, bet atjauno redoksu līdzsvaru oksidatīvā stresa apstākļos. Tāpēc CDP melanocītu funkciju un izdzīvošanu var uzturēt divos dažādos veidos. CDP palīdz melanocītiem uzturēt homeostāzi, kas arī ir svarīga funkcijamelanoģenēze.50,51
Noslēgumā,CDPvar veicināt melanocītu melanoģenēzi, aktivizējot MAPK signalizācijas ceļu. CDP var uzlabot melanocītu izdzīvošanu, aktivizējot NRF2/HO-1 antioksidantu ceļu un iznīcinot intracelulāro ROS.oksidatīvais stressnosacījumiem. Mūsu atklājumi ir nozīmīgi, jo tie parāda, ka CDP var gan veicinātmelanoģenēzeun aizsargāt melanocītus no oksidatīvā stresa bojājumiem, kas, iespējams, ir atbildīgi par melanocītu disfunkciju un zudumu. Šī pētījuma rezultāti liecina, ka CDP varētu būt jaunas zāles depigmentācijas slimību ārstēšanā.
