Dažādu Syringa Vulgaris L. ekstraktu ķīmiskais profils, citotoksiskā aktivitāte un oksidatīvā stresa samazināšana 2. daļa

Lūdzu sazinietiesoscar.xiao@wecistanche.comlai iegūtu vairāk informācijas

2.5. Antioksidantu aktivitātes testi

S.wulgaris ekstraktu antioksidanta spēja in vitro tika novērtēta ar trīs dažādām metodēm:2, 2-difenil-pikrilhidrazila (DPPH●) attīrīšanas testu, dzelzs reducējošo antioksidantu jaudu (FRAP) un vara jonu reducējošo antioksidantu spēju ( CUPRAC)(9. tabula). Trīs izmantotās metodes tika izvēlētas, lai izvirzītu argumentus, kas pierāda pārbaudīto paraugu antioksidantu spēju ar trīs dažādiem mehānismiem [31-33].

Toth et al. ziņoja par antioksidantu aktivitāti S.vulgaris ziediem un augļiem. izmantojot DPPH balināšanas testu un atklāja šo metanola ekstraktu efektīvu antioksidantu aktivitāti ar attiecīgi IC50 =65.25 ug/mL un IC50 =67.39 ug/mL [10]. To pašu testu izmanto Varga et al. un parādīja pārākuantioksidantslapu un mizas ekstraktu aktivitāte (attiecīgi ICs0=25,25 ug/mL, ICs0 =40,61 ug/mL）【11】). Mūsu pētījums atklāja, ka ziedu ekstrakts bija nozīmīgs (lpp<0.001)higher antioxidant="" activity="" （ic50="36.83" μg/ml）="" compared="" to="" the="" other="" analyzed="" extracts="" in="" the="" following="" order:="" flowers="">leaves >miza > augļi (9. tabula). Līdzīgi rezultāti ziedu ekstraktam tika iegūti ar CUPRAC un FRAP testiem (lpp<0.001). moreover,="" the="" present="" study="" brings="" originality="" by="" offering,="" for="" the="" first="" time,="" proof="" of="" the="" antioxidant="" capacity="" of="" the="" tested="" samples="" by="" different="" other="" mechanisms="" that="" are="" highlighted="" using="" the="" two="" other="" assays,="" frap,="" and="" cuprac.="" at="" the="" same="" time,="" the="" study="" offers="" for="" the="" first="" time="" a="" comparative="" view="" on="" flowers,="" fruit,="" leaves,="" and="" bark,="" bringing="" evidence="" on="" the="" fact="" that="" flowers="" represent="" the="" most="" important="" antioxidant="">

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

Turklāt oriģinalitāte, ko rada veiktās analīzes, pārbaudīto paraugu antioksidantu kapacitātes izpēte kļūst vēl svarīgāka, jo tā ir citotoksiskās aktivitātes pamats. Antioksidanta spēja ir ļoti saistīta ar pārbaudīto paraugu fenola sastāvu [10,11], jo lielā mērā zināms un pieņemts, ka fenilpropanoīdi, flavonoīdi u.c.secoiroidspiemīt antioksidanta un antiproliferatīvā spēja [34-36], bet turklāt antioksidanta spēja vienlaikus var būt ļoti saistīta ar šo paraugu citotoksisko aktivitāti, jo antioksidanta aktivitāte var būt viens no svarīgākajiem mehānismiem citotoksicitātes pamatā [37].

2.6. Citotoksicitātes testi

Lai izpētītu četru S.vulgaris etanola ekstraktu in vitro antiproliferatīvo potenciālu divās cilvēka vēža šūnu līnijās HeLa un B16F10, tika veikts MTT tests. Rezultāti ir parādīti 3. un 4. attēlā.

4. attēls. Inhibējošā iedarbība uz S. Vulgaris lapu, augļu, mizu un ziedu ekstraktu B16H10 šūnu līniju piecās dažādās koncentrācijās C1-C5, kas aprēķinātas saskaņā ar TPC (umol GAE/mL), kas noteikts katram ekstraktam: lapām (11.34-56.7 mmol GAE/mL), augļi (6.66-33.2 μmol GAE/mL), miza (9.{12}}.37 μmol GAE/mL) un ziedi (11.{15}}.475 μmol GAE/mL); Negatīvā kontrole — neapstrādātas šūnas, iekšējā kontrole — etanols, pozitīvā kontrole — cisplatīns. Vērtības atspoguļo trīs noteikšanu vidējo ± SD.*lpp<><><0.0001(differences between="" extract-treated="" cells="" and="" the="" negative="">

Ziedu etanola ekstraktam bija ievērojama citotoksiskā aktivitāte gan B16F10, gan HeLa šūnās (3. un 4. attēls). Abu dzīvotspējamelanomaunkarcinomašūnas tika ievērojami samazinātas (lpp<0.0001) compared="" to="" the="" untreated="" control="" for="" concentrations="" of="" 23.39-58.475="" μmol="" gae/ml="" and="" 11.69-58.475="" μmol="" gae/ml,="" respectively.="" no,="" statistically="" significant="" (p="">0.05) tika pamanītas atšķirības starp dzīvotspējas vērtībām, kas noteiktas pēc šīm koncentrācijām, kas liecina, ka citotoksiskā aktivitāte nav atkarīga no devas. Līdzīgi kā ziedu ekstraktam, arī lapu ekstraktam bija ievērojama citotoksiskā iedarbība uz abām šūnu līnijām (4. lpp.).<0.001). furthermore,="" when="" tested="" against="" the="" hela="" cell="" line,="" these="" two="" extracts'="" inhibitory="" activity="" was="" comparable="" to="" the="" positive="" control—cisplatin="" treated="" cells="" (figure="" 3).on="" the="" b16f10="" cells,="" similar="" efficacy="" was="" displayed="" only="" by="" the="" flower="" extract,="" while="" the="" leaf="" and="" bark="" extracts="" possessed="" a="" lower="" cytotoxic="" effect="" compared="" to="" cisplatin.="" the="" fruit="" extract="" proved="" the="" lowest="" cytotoxic="" effect="" (figure="">

Tādējādi mūsu rezultāti parāda in vitrocitotoksisksS.vulgaris ekstraktu īpašības uz divām audzēju šūnu līnijām. HeLa šūnu līnija izrādījās jutīgāka nekā B16F10 šūnas; literatūrā ir dokumentēta atšķirīga jutība in vitro un in vivo starp dažādiem audzēja šūnu tipiem [38, 39].

Devas-atbildes reakcijas līknes nelineārā regresijas analīze noteica pusi no maksimālās inhibējošās koncentrācijas (ICs0) vērtības citotoksiskajai aktivitātei, un rezultāti ir aprakstīti 10. tabulā.

Šie rezultāti liecina, ka zemākās ICso vērtības S.vulgaris gadījumāetanolsekstrakti tika iegūti attiecīgi augļiem un mizai. Tomēr šīs vērtības tiek aprēķinātas

saskaņā ar TPC (umol GAE/mL), kas noteikts katram ekstraktam. Tādējādi, ņemot vērā visiem četriem ekstraktiem noteikto sarežģīto ķīmisko sastāvu, tika noteiktas korelācijas starp in vitro antiproliferatīvo aktivitāti un identificētajām grupām un/vai savienojumiem. Netika atrasta korelācija starp šūnu dzīvotspēju ar TPC（r²{{0}}.4）. Tika novērota spēcīga korelācija starp inhibējošo ietekmi uz šūnu dzīvotspēju un noteiktiem identificētiem un kvantitatīviem savienojumiem, kas aprakstīti 1. tabulā. Tika attiecināts lielākais daudzums no šādiem savienojumiem 1, 2, 5, 7, 9, 11, 13 un 14 ziedu ekstrakta ķīmiskajam sastāvam, savukārt pārējie savienojumi bija visvairāk sastopami mizas ekstraktā (1. tabula). Šķita, ka starp šiem savienojumiem acetonīda un ehinakozīda daudzums cieši korelē ar citotoksicitāti, ko uzrāda attiecīgi abi ziedi (r²= 0.84-0.97 un 0.87-0.99). ) un mizas (attiecīgi r2=0.87-0.94 un 0.{22}}.99) ekstrakti virzienā uz B16H10 šūnu līniju. HeLa šūnu līnijas gadījumā tika novērota korelācijaligstrosīds（r-=0.89-0.99）, siringalaktons A （r²=0.90-0.99） un oleuropeīna-aglikons （r²=0.{{ 8}}.98). Lai gan visi šie trīs sekoiridoīdu savienojumi tika konstatēti vislielākajā daudzumā mizas ekstrakta gadījumā, korelācijas koeficienti starp to saturu mizas ekstraktos un antiproliferatīvo aktivitāti bija salīdzinoši zemi (r²=-0).80-0.49 ）.

Cistanche var uzlabot imunitāti

Šie atklājumi uzsver fenilpropanoīdus (akteozīdu un ehinakozīdu) un sec-iridoīdus (ligstrozīdu, siringalaktonu A, oleuropeīnu-aglikonu) starp savienojumiem, kas ir atbildīgi par S. Vulgaris etanola ziedu ekstrakta antiproliferatīvo efektivitāti attiecīgi pret B16H10 un HeLa šūnu līniju. Šie rezultāti saskan ar iepriekšējiem ziņojumiem, kas parāda secoiridoīdu in vitro antiproliferatīvo efektivitāti [4].

Iepriekšējie pētījumi norādīja uz antioksidantu un pretaudzēju potenciālu vairāku Syringa sugu gadījumā, liekot domāt, ka šīs īpašības varētu būt saistītas ar noteiktiem galvenajiem identificētajiem savienojumiem, proti, iridoīdiem un lignāniem 4,5]. Ūdens ekstrakti, kas iegūti no S. pubescens ziediem un lapām, bija citotoksiski in vitro, pārbaudot pret L2215 šūnu līniju, savukārt S. patula ziedu pumpuru ekstrakts un divi izolēti savienojumi, syringaresinol un oleozīda 11-metilesteris, spēja inhibēt HepG2. šūnu proliferācija [4,5]. Līdzīgi oleuropeīns un 3,4-dihidroksifeniletilspirts 8-O- -D-glikopiranozīds, divi savienojumi, kas izolēti no S.pubescens subsp. patula, izteikta citotoksicitāte pret P-388, L-1210, SNU-5 un HL-60 šūnām [5].

Tika ziņots, ka vairākiem savienojumiem, kas izolēti no S.vulgaris lapām, piemīt pretvēža potenciāls [4,40]. Salīdzinoši vāja citotoksicitāte tika izcelta izooleoakteozīda un siringopikrosīda B gadījumā, pārbaudot attiecīgi pret LOX-IMVI melanomas šūnu līniju un NCI-H522 plaušu vēža šūnu līniju [4, 18]. Turklāt oleuropeīna hidrolīzes produkts uzrādīja mērenu citotoksisku aktivitāti pret plaušu vēža šūnu līnijām DMS273 un DMS114 [4, 40].

Ņemot to visu vērā un apstiprinot fitoķīmiskajā analīzē, citotoksicitātes pārbaudēs un antioksidantu pārbaudēs iegūtos rezultātus, saikne starp tiem visiem kļūst acīmredzama un var secināt, ka pārbaudīto paraugu antiproliferatīvā aktivitāte ir nozīmīga un var Tas ir saistīts ar antioksidantu mehānismu. Cik mums ir zināms, šis ir pirmais pētījums, kura mērķis ir novērtēt un salīdzināt no S. Vulgaris ziediem, lapām, mizas un augļiem iegūto etanola ekstraktu ķīmisko profilu, antioksidatīvās un antiproliferatīvās īpašības.

3. Materiāli un metodes 3.1. Ķīmiskās vielas un reaģenti

Acetonitrilu HPLC-DAD-MS analīzei iegādājās Merck (Darmštate, Vācija), savukārt ūdeni ar Direct-QUV sistēmu attīrīja Millipore (Darmštate, Vācija). Hlorogēnskābe, rutīns un oleuropeīns (analītiskā tīrība) tika iegādāti no Sigma Aldrich (Darmštate, Vācija). Visas pārējās izmantotās ķīmiskās vielas tika iegādātas no Alfa-Aesar, Karlsrūe, Vācija. Citotoksicitāte tika pārbaudīta ar divām audzēju šūnu līnijām: peles melanomas šūnām (B16F10 šūnas) un cilvēka vēža šūnu līnijām (HeLa). Atlasītās šūnu līnijas tika iegūtas no American Type Cell Collection (ATCC) (Manassas, VA, ASV). B16F10 šūnas tika uzturētas RPMI 1640 barotnē (Sigma Aldrich, Darmštate, Vācija)

papildināts ar 10 procentiem liellopu augļa seruma (EuroClone, MI, Pero, Itālija) un 1 procentu Antibiotiku-Antimvcotic 100 × (Sigma Aldrich, Darmštate, Vācija). Hela šūnas tika uzturētas DMEM/F-12 barotnē (Gibco Life Technologies, Peislija, Apvienotā Karaliste), kas papildināta ar 10% liellopu augļa serumu (EuroClone, MI, Pero, Itālija) un 1% Antibiotiku-Antimycotic 100x (Sigma Aldrich). , Darmštate, Vācija). Abas šūnu līnijas tika kultivētas 5% CO inkubatorā (Advantage-Lab, Schilde, Beļģija) 37 grādu temperatūrā mitrā atmosfērā. Cisplatīns (Ebewe Pharma Ges. mb H.Nfg. KG, Unterach am Attersee, Austrija) tika iekļauts kā standarta pozitīva kontrole citotoksicitātes noteikšanai.

3.2.Augu materiāls un ekstraktu sagatavošana

Augu materiāls tika novākts Klužas apgabalā, Rumānijas ziemeļrietumos. Ziedi un lapas tika novāktas 2020. gada aprīlī-maijā, sugas ziedēšanas periodā, savukārt augļi un miza - 2020. gada septembrī. Novākto sugu kuponu paraugi tiek glabāti Farmakognozijas nodaļas herbārijā. Klužas-Napokas Farmācijas fakultāte (Vaučers nr.83).

Novāktie paraugi tika žāvēti gaisā. Ekstraktu iegūšanai katra parauga malto augu materiālu auksti macerēja ar 70% o/v etanolu attiecībā 1:10. Pēc tam šķīdums tika pakļauts perkolācijai, filtrēts un izmantots fitoķīmiskai analīzei un antioksidantu spējas un citotoksiskās aktivitātes bioloģiskās aktivitātes pārbaudei [41].

3.3. HPLC-DAD-ESI plus polifenola savienojumu analīze

Polifenolu savienojumu novērtējums tika veikts ar HP{{0}} šķidruma hromatogrāfiju, kas bija aprīkota ar kvartāra sūkni, automātisko paraugu ņemšanas ierīci, DAD detektoru un MS-6110 viena kvadrupola API-elektrosmidzināšanas detektoru (Agilent-Technologies). , Santa Clara, CA, ASV). Fenola savienojumu noteikšana tika veikta pozitīvas jonizācijas režīmā. Tika lietots cits fragments diapazonā 50-100 V. Savienojumu atdalīšana tika veikta ar Eclipse XDB-C18 (5 μm; 4,5 × 150 mm id）kolonnā (Agilent), izmantojot kā kustīgu fāzi 0,1% etiķskābi ūdenī (A). ) un 0,1 procents etiķskābes acetonitrilā (B). Eluēšanai tika izmantots daudzpakāpju lineārs gradients ar šādu sastāvu: 5 procenti B 2 minūtes; no 5 procentiem līdz 90 procentiem B 20 minūtēs, turiet 4 minūtes pie 90 procentiem B, pēc tam 6 minūtes, lai sasniegtu 5 procentus B. Plūsmas ātrums tika uzturēts 0,5 ml/min un temperatūra 25 ± 0,5 grādi. Fenola savienojumi ekstraktā tika analizēti, salīdzinot katra atdalītā savienojuma aiztures laikus, UV redzamo un masas spektru ar trim atsauces standartiem, šādi: flavonoīdiem savienojumi tika kvantificēti, izmantojot rutīna kalibrēšanas līkni, kas iegūta, izmantojot piecas dažādas koncentrācijas. svārstās no 10 līdz 80 ug/ml un izteikti kā rutīna ekvivalenti (mg rutīna/g augu materiāla (R2=0.9973)), fenilpropanoīdiem savienojumi tika kvantificēti, izmantojot hlorogēnskābes kalibrēšanas līkni, kas iegūta, izmantojot piecus dažādus koncentrācijas, kas svārstās no 10 līdz 50 ug/mL un izteiktas kā hlorogēna skābes/augu materiāla ekvivalenti (R2=0.9937), savukārt iridoīdiem savienojumi tika kvantificēti, izmantojot oleuropeīna kalibrēšanas līkni, kas iegūta, izmantojot piecas dažādas koncentrācijas, svārstās no 10 līdz 100 ug/ml un izteikti kā hlorogēna skābes ekvivalenti/g augu materiāla (R-=0.9966). Pozitīvi lādētie joni tika noteikti ar masas spektrometriju, izmantojot skenēšanas režīmu. Masu spektrometrijai tika izmantoti šādi nosacījumi: gāzes temperatūra 3500 C, slāpekļa plūsma 7 L/min, smidzinātāja spiediens 35 psi, kapilārais spriegums 3000 V, fragments 100 V un m/z 120-1200. Hromatogrammas tika reģistrētas pie λ=280 un 340 nm. Datu iegūšana tika veikta, izmantojot Agilent ChemStation programmatūru [42,43].

3.4. FT-IR spektroskopija

Furjē infrasarkanās transformācijas spektroskopija tika veikta Klužas-Napokas Dzīvības zinātņu institūta "Rumānijas karaļa Mihaela I" spektroskopijas laboratorijā. Pirms FT-IR analīzes S. Vulgaris lapu, ziedu, mizu un augļu ekstrakti tika žāvēti uz tīra mikroskopa priekšmetstikliņa 12 stundas istabas temperatūrā. Pēc tam žāvētos ekstraktus noņēma no mikroskopa priekšmetstikliņa un sajauca ar KBr pulveri proporcijā 1:100 un ievietoja spektrālās granulu presēšanas kameras tērauda komplektā. Lai izveidotu caurspīdīgu KBr granulu, mēs piespiedām 10t/2min. FT-IR spektri tika savākti ar Jasco FT-IR4100 spektrometru (Jasco, Vācija) 4000-400 cm' spektra diapazonā, izmantojot 256 skenējumus paraugā ar 4 cm izšķirtspēju. Turklāt iegūtie Ft-IR spektri tika koriģēti attiecībā uz CO un H2O, izmantojot tās pašas izmantotās programmatūras programmu Spectra Manager. Visbeidzot, FT-IR datu analīze tika veikta, izmantojot programmatūru OriginPro Version 8.5.1 (OriginLab Corporation, Northampton, MA, ASV).

3.5. Kopējā polifenolu, flavonoīdu un fenolskābju satura kvantitatīva noteikšana

Kopējais fenola saturs (TPC) tika novērtēts ar spektrofotometrisko metodi, kuras pamatā ir polifenolu krāsas reakcija ar Folina-Čokaltē reaģentu saskaņā ar Eiropas Farmakopeju, izmantojot gallskābes kalibrēšanas līkni (R2= 0.9928). ). Rezultāti tika izteikti kā gallskābes ekvivalenta (GAE) mg/g žāvēta augu materiāla. Kopējo flavonoīdu (TFC) noteikšana tika veikta arī ar spektrofotometrisko metodi, izmantojot alumīnija hlorīda metodi, pamatojoties uz rutīna kalibrēšanas līkni (R-=0.9981) un izsakot rezultātus kā rutozīda ekvivalentu (RE) mg/g. žāvēts augu materiāls. Kopējais fenolskābes (TPA) daudzums tika novērtēts ar spektrofotometrisko metodi, izmantojot Arnova reaģentu, kas ir līdzīgs Rumānijas farmakopejas 10. izdevumā (Cynarae folium monogrāfijā) esošajam reaģentam. TPA noteikšanas rezultāti tika izteikti kā mg kofeīnskābes ekvivalenti (CAE)/g žāvēta augu materiāla un aprēķināti, izmantojot kofeīnskābes kalibrēšanas līknes grafiku (R2= 0.9956). Visi šie eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros [31, 33, 44].

3.6. GC-MS analīze

GC-MS analīze tika veikta ar Dani Master GC-MS sistēmu. Savienojumu atdalīšanai tika izmantota SH-Rxi-5 ms kolonna ar 30 m ×0,25 mm × 0,25 μm. Slāpeklis tika izmantots kā nesējgāze ar plūsmas ātrumu 10 ml/min. Sistēmas temperatūra atbilst 11. tabulā norādītajam gradientam.

Tika ievadīti pieci μL katra parauga, kas atšķaidīts ar absolūto etanolu no 1 līdz 10. EIS-MS detektors identificēja savienojumus ar molekulmasu no 50 līdz 600 daltoniem. Jonu avots tika darbināts 200 grādos. Savienojumi tika provizoriski identificēti, pamatojoties uz atbilstības faktoru, izmantojot NIST MS 2.2 spektru datubāzi. Atbilstības rādītājs, kas pārsniedz 80 procentus, tika uzskatīts par pieņemamu savienojumu identificēšanai. Kvantitatīvā analīze tika veikta ar laukuma normalizācijas metodi un rezultāti tika izteikti platības procentos (procentos) [31,45]. 3.7.Antioksidantu aktivitātes testi

3.7.1. DPPH radikāļu noņemšanas darbība

Lai novērtētu S. Vulgaris ekstraktu antioksidantu kapacitāti, tika izmantots DPPH balināšanas tests. Tā ir spektrofotometriskā metode, kuras pamatā ir DPPHe reaģenta un pārbaudītajos ekstraktos esošo antioksidantu reakcija. ml katra ekstrakta dažādās koncentrācijās tika pievienoti 2 ml0.1 g/L DPPH·metanola šķīdumam un uzturēti. 40 grādos termostatētā vannā, pusstundu. Absorbcija un to variācijas tika mērītas pie 517 nm. DPPHe radikāļa inhibīcija tika aprēķināta, izmantojot formulu: DPPH attīrīšanas spēja procenti =(A kontrole- A paraugs/A kontrole) × 100, kur A kontrole ir kontroles absorbcija, kas sastāv no DPPH· radikāļa šķīduma. plus metanols (maisījums, kas satur visus reaģentus, izņemot tinktūru) un A paraugs ir DPPH radikāļa plus paraugu absorbcija. DPPH samazināšanās procentuālā daļa tika izteikta Trolox ekvivalentos (TE, R2=0.987).

Tinktūras DPPH radikālas attīrīšanas aktivitāte tika izteikta kā IC50 (ug/ml). Pārbaudes tika veiktas trīs eksemplāros [32, 33, 46].

3.7.2. Dzelzs-Reducing Antioxidant Power Assay (FRAP)

FRAP metode ir spektrofotometriskā metode, kuras pamatā ir 2,4,6-tri(2-piridil)-1,3,5-triazīna (TPTZ) krāsas maiņa. komplekss ar Fe3 plus . Šīs krāsas izmaiņas tiek novērtētas, reducējot dzelzs jonu (Fe3) par dzelzs jonu (Fe2 plus ) šajā kompleksā[47]. FRAP reaģents sastāv no 2,5 ml maisījuma 10 mM TPTZ šķīduma 40 mM HCl, kas sajaukts ar 2,5 ml 20 mM dzelzs hlorīda šķīduma un 25 ml acetāta buferšķīduma pie pH =3.6. No katra pārbaudītā parauga 4 ml tika atšķaidīti līdz 1,8 ml ar ūdeni un sajaukti ar 6 ml šī reaģenta. Tukšais šķīdums tika sagatavots tādā pašā veidā, bet, aizstājot ekstraktus ar ūdeni, antioksidanta kapacitāte tika novērtēta korelācijā ar krāsas maiņu, mērot absorbciju pie 450 nm, izmantojot Trolox kā atsauci un kalibrēšanas līkni (R2=0). 992). Rezultāti tika izteikti kā uM Trolox ekvivalenti/g sausā augu produkta, un testi tika veikti trīs eksemplāros [48].

3.7.3. Vara ilgstošas ​​samazināšanas antioksidanta kapacitāte (CUPRAC)

CUPRAC metode ir spektrofotometriskā metode, kuras pamatā ir vara jona (II) reducēšana par vara dzelzi (I) neoprēnā (2,9-dimetil-1, 10-fenantrolīns). komplekss. Šis samazinājums nosaka krāsas maiņu no gaiši zaļas uz sarkanoranžu. Krāsas izmaiņas tika korelētas ar antioksidanta kapacitāti, mērot absorbciju pie 450 nm. Kalibrēšanas līkne tika uzzīmēta, izmantojot Trolox standarta koncentrācijas, un rezultāti tika izteikti kā mM Trolox ekvivalents/g sausā augu produkta [32,49,50]. 3.8. Citotoksicitātes testi Citotoksicitātes pētījums ar audzēja šūnu līnijām tika veikts, izmantojot MTT testu (3-(45-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolija bromīds; Sigma Oldrihs) [51,52]. Abām šūnu līnijām šūnas tika izklātas (1 × 10 grādu šūnas/iedobē) 96-iedobju plāksnēs uz 24 stundām normālā pavairošanas vidē (200 uL šūnu suspensijas katrā iedobē). Ekstrakti tika pievienoti pilnai barotnei piecos atšķirīgos tilpumos (5 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL, 25 μL), un iegūtās koncentrācijas (C1, C2, C3, C4 un C5) tika aprēķinātas saskaņā ar katram ekstraktam noteiktais TPC un izteikts kā umol GAE/mL šādi: ziedi (C1–11,69 umol GAE/mL, C2–23,39 μmol GAE/mL, C3–35,08 umol GAE/mL, C4–46,78 umol GAE/mL, C4–46,78 μmol GAE C5–58,475 μmol GAE/mL), lapas (C1-11,34 μmol GAE/mL, C2–22,68 umol GAE/mL, C3–34,02 μmol GAE/mL, C4–45,36 μmol GAE/mL, C4–45,36 μmol GAE 56,7 μmol GAE/mL), miza (C1–9,875 μmol GAE/mL, C2–19,75 umol GAE/mL, C3–29,625 umol GAE/mL, C4–39,5 umol GAE/mL, C4–39,5 umol CGAE/mL un 3,7 μmol GAE/mL augļi (C1-6,66 umol GAE/mL, C2-13,32 umol GAE/mL, C3-19,98 umol GAE/mL, C4-26,64 umol GAE/mL, C5-33,2 umol GAE/mL). Negatīvo kontroli attēloja šūnu līnijas, kas kultivētas normālā izplešanās vidē (neapstrādātas šūnas), savukārt 70% o/v etanola un cisplatīna (0,2 uM) tika iekļauti attiecīgi kā iekšējā kontrole un pozitīvā kontrole.

Šūnu dzīvotspēja pēc 24 stundu inkubācijas 37 grādu temperatūrā mitrinātā atmosfērā ar 5 procentiem CO tika novērtēta, izmantojot MTT testu saskaņā ar iepriekš publicētu protokolu [51, 52]. Formazāna daļiņas, kas radās, katrai iedobei pievienojot 0,5 mg MTT, tika izšķīdinātas ar dimetilsulfoksīdu (DMSO) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ASV), un absorbcija tika nolasīta pie 450 nm, izmantojot mikroplati. lasītājs (Bio-Rad, Hercules, CA, ASV). Šūnu dzīvotspējas procenti (procenti) tika aprēķināti, pamatojoties uz absorbcijas attiecību starp šūnu kultūrām, kas apstrādātas ar ekstraktiem, un negatīvajām kontrolēm (neapstrādātām šūnām), reizinot ar l00. Katram ekstraktam citotoksiskā aktivitāte, kas izteikta kā IC5so vērtības, kas atspoguļo ekstrakta koncentrāciju, kas nepieciešama, lai kavētu 50 procentus šūnu proliferācijas, tika aprēķināta no devas-atbildes līknes, kas iegūta, izmantojot nelineāro regresiju. Visi eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros.

3.9. Statistiskā analīze

Visas statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot programmatūru ANOVA GraphPad Prism, 6. versiju.{1}}(GraphPad, Sandjego, Kalifornija, ASV). Rezultāti tika izteikti kā vidējā standartnovirze (SD). Lai noteiktu statistisko nozīmīgumu, tika izmantota vienvirziena dispersijas analīze (ANOVA), kam sekoja Tukey post hoc tests. Pīrsona korelācijas analīze tika veikta, lai noteiktu korelāciju starp ekstraktu citotoksisko aktivitāti, kopējo fenola saturu un identificētajiem savienojumiem. P-vērtība, kas ir zemāka par 0,05, tika uzskatīta par statistiski nozīmīgu.

4. Secinājumi

Cik mums ir zināms, šis ir pirmais pētījums, kura mērķis ir novērtēt un salīdzināt no S. Vulgaris ziediem, lapām, mizas un augļiem iegūto etanola ekstraktu ķīmisko profilu, antioksidatīvās un antiproliferatīvās īpašības. Veiktās metodes atklāja, ka S.vulgaris ekstrakti, īpaši tie, kas iegūti no ziediem un lapām, ir vērtīgi savienojumu avoti ar nozīmīgu antioksidantu un citotoksisku potenciālu.

Šis raksts ir izvilkts no Molecules 2021, 26, 3104. https://doi.org/10.3390/molecules26113104 https://www.mdpi.com/journal/molecules