Aktivitātes vadīta fenola kompozīciju izolācija no Anneslea Fragrans sienas. Un to citoprotektīvais efekts pret ūdeņraža peroksīda izraisīto oksidatīvo stresu HepG2 šūnās 1. daļa

Lūdzu, sazinieties aroscar.xiao@wecistanche.complašāka informācija

Abstrakts:Anneslea fragrans Wall., kas pazīstams kā"Pangpo tēja", tradicionāli tiek izmantots kā tautas medicīna un veselīga tēja aknu un zarnu slimību ārstēšanai. Šī pētījuma mērķis bija attīrīt antioksidatīvos un citosprotektīvos polifenolus no A.fragrans lapām. Pēc frakcionēšanas ar polāriem un nepolāriem organiskiem šķīdinātājiem etanola ūdens ekstrakta frakcijas tika novērtētas pēc to kopējā fenola (TPC) un flavonoīda satura (TFC) un antioksidantu aktivitātes (DPPH, ABTS un FRAPassays). N-butanola frakcija (BF)uzrādīja visaugstāko TPC un TFC ar spēcīgāko antioksidantu aktivitāti. BF biovadāmā hromatogrāfija noveda pie sešu flavonoīdu (1-6) un viena benzohinona lantanoīda (7) attīrīšanas. Šo savienojumu struktūras tika noteiktas ar NMR un MS metodēm. 6. savienojumam bija spēcīgākā antioksidanta spēja, kam sekoja 5 un 2. Izolēto savienojumu aizsargājošā iedarbība uz ūdeņraža peroksīda (H2O2) izraisīto oksidatīvo stresu HepG2 šūnās atklāja, ka savienojumi 5 un 6ekshibitēja labāku aizsargājošo iedarbību, inhibējot ROS produkciju, kam nav būtiskas atšķirības ar C vitamīnu (p>0,05), savukārt 6 uzrādīja vislabāko anti-apoptozes aktivitāti. Rezultāti liecina, ka A.fragrans varētu kalpot kā vērtīgs antioksidantu fitoķīmiskais avots funkcionālās pārtikas un veselības uztura produktu izstrādei.

Atslēgvārdus:Anneslea fragrans; antioksidants; vadīta izolācija; oksidatīvais spriegums; flavonoīdu glikozīdi

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

1. Ievads

Reaktīvās skābekļa sugas (ROS) tiek ražotas kā blakusprodukti oksidatīvas elpošanas ceļā normālos fizioloģiskos un bioķīmiskos procesos [1]. Kā endogēniem brīvajiem radikāļiem ROS ir svarīga loma šūnu signalizācijā un ķermeņa noturības uzturēšanā normālā diapazonā [2]. Ja ROS nevarētu efektīvi iznīcināt, pārmērīga ROS var izraisīt oksidatīva stresa rašanos, kas var ietekmēt šūnu proliferāciju un apoptozi [3]. Oksidatīvais stress ir cieši saistīts ar dažādām slimībām, tostarp diabētu, hiperlipēmiju, aptaukošanos, vēzi un sirds un asinsvadu un neirodeģeneratīvām slimībām [4]. Nesen daudzi pētījumi ir pierādījuši, ka diētai, kas bagātināta ar antioksidantiem, piemīt virkne labvēlīgu efektu, pateicoties to iznīcināšanas spējai uz pārmērīgu ROS [5,6].

Dabīgie antioksidanti satur dažādas molekulas, piemēram, polifenolus[], karotinoīdus [8], vitamīnus [9], slāpekli saturošus savienojumus [10] un kumarīnus [9]. Polifenoli tiek plaši izplatīti visā augu valstībā un veicina ieguvumus veselībai, pateicoties to antioksidantu īpašībām [11]. Daudzi no tiem, piemēram, resveratrols un daži atvasinājumi [12], antocianidīni [13], izoflavoni [14l, katehīns [15l un kvercetīns [16], ir labi pazīstami ar savu aizsargājošo iedarbību, iznīcinot ROS [1]. Pēdējos gados polifenoli ir piesaistījuši uzmanību vēža[17], sirds un asinsvadu disfunkcijas[18], neirodeģeneratīvo slimību [19] un novecošanās [20] profilaksei. Tāpēc efektīvu antioksidantu meklēšana ir steidzama nepieciešamība veicināt cilvēku veselību.

Cistanche var uzlabot imunitāti

Anneslea fragrans Siena. ir mūžzaļš augs, kas galvenokārt tiek izplatīts Ķīnas dienvidos [21]. Papildus dekoratīvajam mērķim A.fragrans lapas tiek izmantotas arī kā tautas zāles, lai ārstētu drudzi, aknu aizsardzību, uzmundrinošu kuņģi un zarnas Ķīnu un Kambodžu [22], kas bija ierakstīta "Yunnan Simao ķīniešu augu izcelsmes zālē". Turklāt lapas ir apstrādātas arī kā tējas dzēriens, kas pazīstams kā"Pangpo tēja". Iepriekšējos ziņojumos [23] A.fragrans ekstrakts ir uzrādījis antioksidantu un pretmalārijas iedarbību. Tomēr līdz šim nav ziņots par tā antioksidantu fenola savienojumiem no A. smaržvielām.

Tādējādi šī pētījuma mērķis bija izolēt un identificēt antioksidantu savienojumus no A. fragrans lapām, kas ir atbildīgas par to tradicionālo izmantošanu aknu slimību ārstēšanai. Četras sēra ūdens ekstrakta frakcijas , dihlormetāna frakcija (DF), etilacetāta frakcija (EAF), n-butanola frakcija (BF) un etanola ūdens ekstrakta ūdens frakcija (RWF) un ūdens frakcija (RWF) tika novērtētas attiecībā uz to kopējo fenola (TPC) un kopējo flavonoīdu saturu (TFC) un to antioksidantu spēju. N-butanola frakcijai(BF) bija visaugstākā TPC un TFC ar spēcīgāko antioksidantu aktivitāti. BF biovadāmā frakcionēšana ļāva attīrīt savienojumus. Turklāt izolēto savienojumu citoprotektīvais efekts tika veikts uz ūdeņraža peroksīda (H, O,) izraisītu oksidatīvo stresu cilvēka aknu vēža HepG2 šūnās. Intracelulārā ROS ražošana un šūnu apoptoze tika noteikta, izmantojot plūsmas citometriju. Tādējādi šis pētījums nodrošināja vērtīgu antioksidantu fitoķīmisko sastāvdaļu A.fragrans lapu izstrādei un izmantošanai kā funkcionāls papildinājums (veselīga tēja) pārtikas un veselības nozarē.

2. Rezultāti un diskusijas

2.1.Frakciju un apakšfrakciju tecēšanas efektivitāte

Šķidruma-šķidruma sadalīšana ar organiskiem šķīdinātājiem un kolonnu frakcionēšana ir svarīgi paņēmieni bioaktīvo savienojumu bagātināšanai no neapstrādāta ekstrakta [24]. Izmantojot šķidruma-šķidruma sadalīšanu, etanola ekstrakts(CE) no A. fragrans lapām tika secīgi frakcionēts ar dihlormetānu, etilacetātu un n-butanolu, lai iegūtu attiecīgi četras frakcijas (DF, EAF, BF un RWF). Tika konstatēts, ka frakciju ienesīguma procenti svārstās no 11 līdz 27%. Atlikušajai ūdens frakcijai (RWF, 27%) bija visaugstākā ražība, un citu frakciju iznākums bija šādā secībā: n-butanola frakcija (BF, 24%), etilacetāta frakcija (EAF, 21%), dihlormetāna frakcija (DF, 11%).

Tika konstatēts, ka subfrakciju (BF-A līdz E) ienesīguma procents svārstās no 3,82 līdz 48,4%. BF-E uzrādīja augstāko ienesīgumu - 48,4%, kam sekoja BF-D (24,96%), kam ir ievērojami augstāka raža nekā pārējām frakcijām.

2.2.HPLC analīze

Ir pierādīts, ka augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas (HPLC) noteikšana ir spēcīgs kvantitatīvās noteikšanas paņēmiens. HPLC analīze atklāja, ka BF bija visvairāk savienojumu ar spēcīgāko antioksidantu aktivitāti. Antioksidantu testu un HPLC analīzes vadībā antioksidatīvo frakciju tālāk hromatogrāfēja subfrakciju izolēšanai. BF tika pakļauts hidratētu sveķu D101 kolonnai, lai iegūtu piecas apakšfrakcijas (BF-A līdz E). HPLC analīze atklāja, ka BF-Cto E bija visvairāk antioksidantu savienojumu. Šo frakciju biovadāmā frakcionēšana (BF-C līdz E) ļāva attīrīt septiņus tīrus savienojumus.

Kā parādīts 1. attēlā, BF un septiņi tīri savienojumi tika profilēti HPLC analīzē. Salīdzinot ar aiztures laikiem un UV absorbcijas līknēm, šie septiņi savienojumi tika apstiprināti ar aiztures laiku 7,51 min (kodīgs, 7),7,92 min((epi)-katehīns, 6), 9,38 min (konfusozīds, 1),9,57 min((S)-naringenīns-7-O-β-D-glikopiranozīds, 4), 10,32 min(vaccinii folin, 2), 12,64 min (2',3,4,4'-tetrahidroksidi dihidrohalkons, 5) un 13,95 min (1-[4-(β-D-D-glikopiranoziloksi)-2-hidroksifenil]-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-1-propanons, 3)(1.A attēls). Starp tiem savienojumi 1-6 pieder pie flavonoīdiem, un 7. savienojums ir benzohinoletanoīds.

2.3.Kopējais fenola saturs (TPC) un kopējais flavonoīdu saturs (TFC)

A.fragrans lapas tradicionāli tiek izmantotas kā apstrādāta veselības tēja, un ir pierādīts, ka tās ir labs fenolu un flavonoīdu resurss [25]. Saskaņā ar spektrofotometriskajiem testiem TPC un TFC tika pārbaudīti dažādās frakcijās un apakšfrakcijās no A. fragrans lapām. Kā parādīts 1. tabulā, BF bija visaugstākā TPC vērtība – 238,12±12,05 mg GAE/g ekstrakta, kam sekoja EAF. DF uzrādīja zemāko TPC vērtību kā 66,52±0,57 mg GAE/g ekstrakta. Tāpat visaugstākā TFC koncentrācija tika konstatēta arī BF ar TFCvalue 165,19±5,21 mg RE/ekstrakta. Attiecībā uz RWF un EAF (attiecīgi 66,92±1,38 un 116,12±2,89 mg GAE/ekstrakta) tiem bija arī zemāka TFC koncentrācija nekā BF(165,19±5,21 mg RE/g ekstrakta), savukārt DF bija viszemākā TFC koncentrācija – 47,94±2,84 mg RE/g ekstrakta. TPC un TFCin BF saturs bija aptuveni četras reizes lielāks nekā DF.

Dati attēloja augstākās TPC un TFC klātbūtni BF-E ar vērtībām 262,03±1,72 mg GAE/g ekstrakta; 180,52± 6,30 mg RE/g ekstrakta, kam seko attiecīgi BF-D(219,84±4,01 un 157,01±2,50 mg RE/g ekstrakta), BF-C (attiecīgi 210,69±6,31 un 151,01±4,33 mg RE/g ekstrakta), savukārt BF-B un BF-A bija viszemākās TPC un TFC vērtības (1. tabula).

2.4.Antioksidanta aktiolitāte

Lielākā daļa polifenolu, īpaši flavonoīdi un fenolskābes, tiek izmantoti populāros antioksidantu pārtikas produktos (nutraceuticals) un sniedz virkni cilvēku ieguvumu [17]. Mūsu iepriekšējā pētījumā ir pierādīts, ka A.fragrans lapas ir labs polifenolu resurss[26]. Tomēr A. fragrans lapu ekstrakta antioksidanta aktivitāte un tās fitoķīmiskās vielas vēl nav pētīta. Dažādu antioksidatīvo reakciju mehānismu dēļ tika apvienoti trīs ABTS, DPPH un FRAP testi, lai novērtētu frakciju un subfrakciju antioksidantu aktivitāti no A. fragrans lapām.

Starp frakcijām BF uzrādīja visspēcīgāko antioksidanta aktivitāti ABTS, DPPH un FRAP radikāli atslābuma aktivitātēs ar 1808.46±96.52,951.42±87.75 un 1822.96± 29.24 μmol TE/g ekstraktu (1. tabula).PDF uzrādīja zemāko antioksidatīvo aktivitāti ABTS un FRAP testos(139.23±8.62 μmol TE/g ekstrakts un attiecīgi 180.05± 9.46 μmol TE/g ekstrakts)(1. tabula). Savukārt tika konstatēts, ka četru frakciju (DF, EAE, BF un RWF) radikālās atsišanas darbības DPPH radikāli iznīcinošajā testā ir svārstījušās attiecīgi no 613,38± 45,35 līdz 951,42±87,75 μmol TE/g ekstraktam, kam nav būtiskas atšķirības (p>0,05). Šie rezultāti liecināja, ka fitoķīmiskās vielas no A. fragrans lapām varētu būt nejutīgas pret DPPH. Lai turpinātu aktīvo metabolītu iegūšanu, BF tika izvēlēts turpmākai frakcionēšanai. BF tika pakļauts D101 makroporainai adsorbējošai sveķu kolonnas hromatogrāfijai ar metanola ūdens sistēmas gradientu, lai iegūtu piecus apakšfrakcijas (BF-A līdz E). Tādējādi šo apakšfrakciju ABTS radikāli iznīcinošo aktivitāti var klasificēt kā BF-E> BF-C>BF-D. Reducējošā aktivitāte FRAP testā atklāja, ka BF-Dhad spēcīgākā antioksidatīvā aktivitāte, kurai sekoja BF-C un BF-E.It, ir ievērības cienīga, ka trīs subfraktori (BF-C līdz E) uzrādīja augstāku antioksidatīvo aktivitāti nekā mātes frakcijai (BF). Kopā ņemot, BF-C līdz E tika iesniegts kolonnu hromatogrāfijai, lai izolētu un identificētu antioksidatīvās fitoķīmiskās vielas.

2.5. Izolēto savienojumu antioksidantu aktioitāte

Visi izolētie savienojumi (savienojumi 1-7) tika novērtēti attiecībā uz antioksidantu spēju ar ABTS, DPPH radikālu atslābuma aktivitāti un FRAP antioksidantu aktivitāti. Visi dati ir aprakstīti 2. tabulā. Savienojumi6 un 2 uzrādīja visaugstāko antioksidantu aktivitāti, kam sekoja 5. 4. savienojums uzrādīja mērenu antioksidantu aktivitāti, un 1., 3. un 7. savienojums tika uzskatīts par neaktīvu ar ABTS un DPPH radikālu atslāņošanas aktivitāti, kas mazāka par 200 μmol TE/g ekstraktu. Izmantojot Vc (radikālās atskurbšanas aktivitātes ar 2932.91 ±93.63 un 1873.56±121.68 umol TE/g ekstraktu attiecīgi)kā pozitīvo kontroli, compound6 bija spēcīgākā antioksidanta aktivitāte ABTS un DPPH radikālos scavenging testos ar 1580.37±89.32 un 1953.31±109.93 μmol TE/g ekstraktu (p<0.05）， respectively.="" furthermore,="" compound="" 6="" had="" the="" best="" antioxidant="" capacity="" in="" the="" frap="" assay="" as="" 5027.43±620.75="" μmol="" te/extract，="" which="" was="" much="" higher="" than="" that="" of="" vc="" as="" 3291.28±241.02="" μmol="" te/extract.="" moreover，="" the="" compound="" 2and6showed="" a="" significant="" antioxidant="" activity,="" which="" was="" equivalent="" to="" a="" positive="" control="">

Turklāt flavonoīdu (1-6) antioksidantu struktūras un aktivitātes attiecības tiek apspriestas ar dažādu inhibējošo efektu pakāpi. 2. savienojums uzrādīja lielāku an-tioksidantu aktivitāti nekā 1., 3. un 5. savienojums, kas liecināja, ka 3,4-dihidroksigrupu grupām dihidrohalkonos 2 var būt izšķiroša loma pret ABTS, DPPH radikālo atslābuma aktivitāti un FRAP antioksidantu aktivitāti, un glikozes krāsai, kas aizstāta ar C-4'in 2, var būt svarīga loma tā antioksidanta spējā [4]. Turklāt 6. savienojumam bija visaugstākā antioksidanta aktivitāte salīdzinājumā ar citiem savienojumiem, kas liecināja, ka flavan-3-oliem (katehīnam), iespējams, piemīt labāka radikāla atslābuma aktivitāte nekā dihidrohalkoniem un flavanoniem [27]. Kopumā 2., 5. un 6. savienojums ar labu antioksidantu aktivitāti tika izvēlēts tālāk citoprotektīvai iedarbībai pret H2O2 oksidatīvo stresu nākamajā pētījumā.

2.6. Saistība starp antioksidanta aktivitāti un TPC/TFC saturu

TPC un TFC koncentrācijas lielā mērā korelēja ar antioksidantu aktivitāti attiecīgi no FRAP (r=0,982 un 0,977) un ABTS (r=0,959 un 0,965) vērtībām. Korelācijas matrica arī parādīja spēcīgu korelāciju starp ABTS un FRAP vērtībām (r =0,992). Turklāt tika veikta daudzfaktoru analīze (PSN), kas tika iegūta no 1. tabulas datiem. Kā parādīts 2. attēlā, PCA izskaidroja 94.44% no kopējām variācijām, kurās PC1 veidoja 84.73% no dispersijas un PC2 veidoja 9.71%. FRAP, ABTS un DPPH testi ar EAF un RWF tiek novietoti augšējos labajā kvadrantos, un TPC un TFC koncentrācijas ar BF un BF-Cto E atrodas apakšējā labajā kvadrantā pc1 pozitīvajos rādītājos. Tikmēr DF un BF-A līdz B ar zemu TPC un TFC koncentrāciju atrodas gar PC1 negatīvo punktu asi. Šie atklājumi parādīja, ka TPC un/vai TFCkoncentrācijas ir cieši saistītas ar antioksidantu spēju, un, jo lielāka ir TPCor TFC koncentrācija frakcijās un apakšfrakcijās, jo augstākas ir to antioksidantu kapacitātes vērtības. Šie rezultāti atklāja, ka augsts fenola un flavonoīdu saturs dažādās frakcijās un subfrakcijās no A. fragrans lapām var veicināt antioksidantu aktivitāti.

2. attēls. PCA analīze par kopējiem fenoliem, flavonoīdiem un antioksidantu aktivitāti. Līdzekļi ar dažādiem burtiem norāda uz būtiskām atšķirībām (p<0.05).df, eaf,="" bf,="" rwf="" mean="" dichloromethane="" fraction,="" ethyl="" acetate="" fraction,="" n-butanol="" fraction,="" and="" residual="" water="" fraction.="" bf-a="" to="" e="" means="" bf="" was="" subjected="" to="" d101="" column="" chromatography="" to="" yield="" five="">

Šis raksts ir iegūts no Molecules 2021, 26, 3690. https://doi.org/10.3390/molecules26123690 https://www.mdpi.com/journal/molecules