Hromatīna pieejamība un mikroRNS ekspresija nefrona priekšteču šūnās nieru attīstības laikā

Plašāka informācija:ali.ma@wecistanche.com

Endrjū Klugstons^1,2,3, Endrjū Bodnārs^2,3, Débora Malta Cerqueira^2,3, Yu Leng Phua^2,5,6,Alisa Lolere^8,9,10, Kristija Bogsa⁷, Andreass Pfenings^8,10, Žaklīna Ho^2,3*un Deniss Kostka^1,4*

¹Attīstības bioloģijas nodaļa, Pitsburgas Universitātes Medicīnas skola, Pitsburga, PA, ASV²Rangos pētniecības centrs, UPMC bērnu slimnīca Pitsburgā, Pitsburga, PA, ASV³Pediatrijas nodaļa, Nefroloģijas nodaļa, Pitsburgas Universitātes Medicīnas skola, PA, ASV⁴Skaitļošanas un sistēmu bioloģijas nodaļa un Pitsburgas Evolūcijas bioloģijas un medicīnas centrs, Pitsburgas Universitātes Medicīnas skola, Pitsburga, PA, ASV⁵Ģenētiskās un genomiskās medicīnas nodaļa, Pediatrijas nodaļa, Pitsburgas UPMC Bērnu slimnīca, Pitsburga, PA, ASV⁶Patoloģijas nodaļa, Klīniskās bioķīmiskās ģenētikas laboratorija, UPMC Bērnu slimnīca Pitsburgā, Pitsburga, PA, ASV⁷Pediatrijas nodaļa, Pitsburgas Universitātes Medicīnas skolas Gastroenteroloģijas, hepatoloģijas un uztura nodaļa, Pitsburga, PA, ASV.⁸skaitļošanas bioloģija,⁹Bioloģijas zinātnes un¹⁰Neirozinātnes institūts, Kārnegija Melona universitāte, Pitsburga, PA, ASV

Abstrakts

Zīdītāju nefroni cēlušies no populācijasnefrona cilmes šūnas, un izmaiņas šo šūnu transkriptos veicina nefroģenēzes pārtraukšanu, kas ir svarīgs nefronu skaita noteicējs. Lai raksturotu mikroRNS (miRNS) ekspresiju un identificētu iespējamos cis-regulējošos reģionus, mēs savācām nefrona cilmes šūnas no pelesnieresembrionālajā 14.5 dienā un pēcdzemdību nulles dienā un tika pārbaudīta maza RNS ekspresija un transpozāzei pieejams hromatīns. Mēs atklājām 1104 miRNS (114 ar ekspresijas izmaiņām) un 46 374 hromatīnam pieejamu reģionu ekspresiju (2103 ar izmaiņām nepieejamību). Visā genomā mūsu dati izceļ tādus procesus kā šūnu diferenciācija, šūnu migrācija, ārpusšūnu matricas mijiedarbība un attīstības signalizācijas ceļi. Turklāt tie identificē jaunus kandidātu cis-regulējošos elementus Eya1 un Pax8, abiem gēniem ar lomu nefrona cilmes šūnu diferenciācijā. Visbeidzot, mēs saistām izteiksmi mainošas miRNS, tostarp let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p un miR{{ 20}}p, ar kandidātu cis-regulējošiem elementiem un mērķa gēniem. Šīs analīzes izceļ jaunus iespējamos cis-regulācijas lokusus miRNS nefronu priekštečos.

Ievads

Funkcionālā vienībanieresir nefrons, kas kalpo atkritumu filtrēšanai un normālas ūdens, skābju bāzes un elektrolītu homeostāzes uzturēšanai organismā. Nefronu skaits cilvēkiem ir ļoti atšķirīgs (parasti no divsimt tūkstošiem līdz vairāk nekā vienam miljonam nefronu (Hughson et al., 2003)), un tas tiek noteikts cilvēkiem pirms dzimšanas (aptuveni pēcdzemdību dienā 2-3 pelēm (Hartman et al. ., 2007; Hinchliffe et al., 1991)). Nefroni nevar atjaunoties pēc dzimšanas, un samazināts nefronu daudzums ir saistīts ar paaugstinātu hroniskas nieru slimības un hipertensijas risku (Bertram et al., 2011). Savukārt nefronu skaitu lielā mērā nosaka šūnu populācija, ko saucnefrona cilmes šūnas(Cebrian et al., 2014b). Pēdējos posmosnieresAttīstībā nefronu priekšteči palielina savu diferenciācijas tieksmi, kas pakāpeniski noplicina to populāciju un norāda uz iespējamu nefroģenēzes pārtraukšanu (Hartman et al., 2007; Rumballe et al., 2011; Volovelsky et al., 2018). Izpratnei par mehānismiem, kas regulē nefroģenēzes pārtraukšanu, ir būtiska ietekme uz nefrona piešķīruma noteikšanu un turpmākas nieru slimības risku.

Laikānieresattīstība, pašatjaunojošie Cited1 plus /Six2 plus nefrona priekšteči tiek izraisīti, lai kļūtu par Cited1-/Six2 plus priekštečiem, un pēc tam tie diferencējas Wnt{5}}izpaužošās nieru pūslīšos, reaģējot uz Wnt9b/-katenīnu (McMahon). et al., 2016; Rumballe et al., 2011). Agrīnās un vēlīnās nefrona priekšteču iekšējās transkripcijas izmaiņas ietver gēnus un ceļus, kas ietekmē cilmes šūnu novecošanos, jo īpaši mTor un tā represoru hamartīnu (S. Chen et al., 2015; Volovelsky et al., 2018). Patiešām, tiek uzskatīts, ka hamartīns desensibilizē nefronu priekštečus pret pašatjaunošanās signāliem un tādējādi veicina nefroģenēzes pārtraukšanu (S. Chen et al., 2015). Saskaņā ar domu, ka agrīnajiem nefronu priekštečiem ir lielāka tendence pašatjaunoties, ir novērojums, ka hromatīna pieejamība ir bagātināta nefrona cilmes šūnu transkripcijas faktoru, tostarp Six2 un Wt1, saistīšanās vietās, salīdzinot ar vēlīnām nefrona priekštečiem (Hilliard et al. , 2019). Ir pierādīts, ka šie transkripcijas faktori saistās ar pastiprinātāju sekvencēm, kas atrodas genoma "regulatīvajos karstajos punktos" (O'Brien et al., 2018). Nefronu priekšteču indukcija notiek pieaugošā katenīna līmeņa dēļ, kā rezultātā gēnos, kas ir gatavi nefroģenēzes programmas aktivizēšanai, tiek aktivizēti Lef1/Tcf7 kompleksi (Park et al., 2012), un ir ierosināts kompleksēties ar Tcf7l1 un Tcf7l2. izveidot un uzturēt regulējošas hromatīna cilpas, kas atvieglo gēnu aktivāciju (Guo et al., 2021).

Noklikšķiniet, laiCistanche tubulosa pulveris nieru slimību ārstēšanai

Nesenie pētījumi ir iesaistījuši mikroRNS (miRNS) nefroģenēzes pārtraukšanas regulēšanā. miRNS ir īsas, nekodējošas RNS molekulas, kas vērstas uz messenger-RNS transkriptiem (mRNS), lai samazinātu translāciju vai pastiprinātu degradāciju, izmantojot RNS inducētu klusēšanas kompleksu (RISC) (Bartel, 2009). Lin28b proteīns ir zināms miRNS saimes represors (Heo et al., 2008). Lin28b ekspresija samazinās nefronu priekšteņos, turpinoties nefroģenēzei, un tas sakrīt ar let-7 miRNS saimes ekspresijas palielināšanos (Yermalovich et al., 2019). Turklāt Lin28b ekspresijas nosacīta indukcija Wt1-līnijā izraisa let-7 miRNS apspiešanu, kas ir pietiekami, lai pagarinātu nefroģenēzi (Yermalovich et al., 2019). Nav zināms, vai citas miRNS regulē nefroģenēzes laiku. Turklāt, lai gan ir identificēti pastiprinātāji, kas regulē ilgstošu nekodējošu RNS ekspresiju nefroģenēzes laikā (Nishikawa et al., 2019), nav pierādīts, ka neviens regulē miRNS ekspresiju nefrona priekštečos.

Šajā pētījumā mēs centāmies vienlaikus identificēt jaunu miRNS, kas veicina nefroģenēzes pārtraukšanu, kā arī iespējamās cis-regulējošās iezīmes. Tāpēc, lai novērotu miRNS ekspresijas un hromatīna pieejamības izmaiņas starp embrionālo 14.5. dienu (E14.5) un pēcdzemdību nulles dienu (P0), mēs izveidojām atbilstošas ​​mRNS seq un ATAC seq datu kopas no primārās un nepasasētās.nefrona cilmes šūnasšajos divos laika punktos. Mēs identificējām 114 miRNS, kas ir atšķirīgi izteiktasnefrona cilmes šūnasstarp šiem diviem laika punktiem, kā arī 2103 mainīgās hromatīna pieejamības reģioniem, kurus mēs saucam par atšķirīgi pieejamiem reģioniem (DAR). Paredzēto gēnu mērķu bagātināšanas analīze, kas būtiski maina miRNS, kā arī DAR genoma atrašanās vietas, ietver ceļus, kas ietekmē epitēlija šūnu diferenciāciju, šūnu migrāciju, ekstracelulārās matricas mijiedarbību un galvenos attīstības signālu ceļus, piemēram, Wnt, Notch un TGF-signalizāciju. . Mēs novērojam būtiskas hromatīna pieejamības izmaiņas un sniedzam vairākas pierādījumu līnijas, kas ietver divus genoma reģionus kā iespējamos gēnu Eya1 un Pax8 pastiprinātājus nefrona cilmes šūnās. Visbeidzot, mēs identificējām konsekventas hromatīna pieejamības un miRNS ekspresijas izmaiņas 33 miRNS un DAR pāriem, tostarp let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a{ {11}}p un miR-9-3p, un uzrāda iespējamos mērķa gēnus, kas izteikti nefrona priekštečos diferencēti izteiktām miRNS.

Rezultāti

Nefronu cilmes šūnu populāciju izolēšana no E14.5 un P0nieres

Nefronu cilmes šūnastika izolēti ar pozitīvu Itg 8 atlasi pie E14.5 vai P0, un katrs paraugs tika sadalīts, lai veiktu mRNS-seq, ATAC-seq un kvalitātes kontroli (papildu attēls 1 AB). Kvantitatīvā PCR (qRT-PCR) apstiprināja, ka nefrona cilmes marķieru gēni Six2 un Cited1 (Huang et al., 2016) ir izteikti izteikti izolētos nefrona priekšteču paraugos attiecībā pret visu.nieres, vairāk nekā citu šūnu tipu marķieri (tostarp urētera pumpuri (Caleb) (Cebrian et al., 2{{10}}14a), endotēlija šūnas (Pecan) (Kobayashi et al., 2008), nieru stroma (Pdgfr ) (S. Chen et al., 2015) un nieru pūslīša (Lhx1) (Brunskill et al., 2014) (papildu attēls 1. C). Attiecībā uz dzimumu E14.5 paraugiem izmantotie pakaiši bija no 27% līdz 50% sieviešu, un metieni P0 paraugiem bija no 31% līdz 75% mātīšu. Vidēji E14.5 paraugos bija 38% sieviešu un 49% P0 paraugu (1. papildu attēls D). - saskaņotas nefronu cilmes šūnu populācijas ļāva mums analizēthromatīna pieejamībaun neliela RNS ekspresija tajos pašos attīstības posmos divos laika punktos (E14.5 un P0).

Agrajiem un vēlīnām nefronu priekštečiem ir atšķirīgi miRNS transkripcijas profili

Mazo RNS sekvencēšana atklāja 1,104 zināmus miRNS transkriptus un identificēja 114 miRNS, kas uzrāda būtiskas ekspresijas izmaiņas starp E14.5 un P{{10}} paraugiem (viltus atklāšanas līmenis ( FDR)=0.05; 1. papildu tabula). Puse no diferencēti izteiktām miRNS uzrāda paaugstinātu ekspresiju pie P0, salīdzinot ar E14.5, un galveno komponentu analīze izceļ lielāku miRNS ekspresijas viendabīgumu starp E14.5 paraugiem, salīdzinot ar P0 (1. attēls). Hierarhiskā klasterizācija atklāj skaidru miRNS grupējumu tādās, kas palielina un samazina ekspresiju attiecīgi starp E14.5 un P0 (1.B attēls). Let-7miRNS saimes locekļi ir vieni no visvairāk atklātajiem miRNS, un mēs atzīmējam, ka visiem ģimenes locekļiem ar būtiskām izmaiņām ir paaugstināta ekspresija pie P0 (dati nav parādīti). Tas atbilst rezultātiem, kas liecina, ka Lin28b ekspresijas samazināšanās izraisa plašu let-7 ģimenes ekspresijas pieaugumu nefroģenēzes laikā (Yermalovich et al., 2019). Citas miRNS ar ievērojami augstāku ekspresiju pie P0 ir miR-429-3p, miR-200 ģimenes loceklis, kas, kā zināms, ietekmē podocītu diferenciāciju (Z. Li et al., 2016), un abi miR{30 }}a-5p un miR-125b-5p. Ir zināms, ka pēdējie divi no tiem apspiež Lin28 transkriptus dažādās šūnu vidēs (Chaudhuri et al., 2012; Potenza et al., 2017). miRNS ar ievērojami zemāku ekspresiju pie P0 ietver angiogenēzi (S. Wang et al., 2008) un proliferāciju veicinošu (Schober et al., 2014) miR-126.

DIANA miRPath rīks ļauj veikt miRNS KEGG ceļa analīzi, pamatojoties uz to attiecīgajiem gēnu mērķiem, kā paredz mikro T-CDS (Vlachos et al., 2015). Mēs atklājam, ka miRNS ar vislielākajām ekspresijas izmaiņām starp E14.5 un P0 (augšup vai lejup) ir tās, kas regulē ceļus ar galveno lomu nefroģenēzē (1.C attēls, 2. papildu attēls). Piemēram, Tgf- izdala apkārtējās stromas šūnas, lai veicinātu nefrona priekšteču diferenciāciju (Rowan et al., 2{{50}}18), un mēs novērojam samazinātu ekspresiju starp nefrona cilmes cilmes miRNS, kas vērsta uz pakārtotajiem efektoriem. "TGF-signalizācijas ceļš" (KEGG ceļš mmu04350, p-vērtība 1,45e- 6). "MAPK signalizācijas ceļš" (mmu04010) ietekmē nefronu priekšteču organizēšanu un sagatavošanu diferenciācijai, un tas regulē to mijiedarbību ar ekstracelulāro matricu (ECM), izmantojot Itg 8 (Ihermann-Hella et al., 2018). Mēs atzīmējam ievērojamu skaitu augšup un lejup regulētu miRNS, kuru mērķauditorija ir dažādi gēni šajā MAPK signalizācijas ceļā (p-vērtības attiecīgi 3,5e- 6 un 3,0e- 4 augšupējiem un lejupējiem sarakstiem). . Visbeidzot, KEGG ceļš "Ekstracelulārās matricas (ECM) receptoru mijiedarbība" (mmu04512) ir visnozīmīgākais identificētais ceļš, un to veidojošie gēni ir daudz svarīgāki ar miRNS, kas laika gaitā palielina ekspresiju (p vērtība 7,4e{). {32}} starp pieaugošajiem miRNS pret 1,1e-2 starp samazinājumiem). Ar ECM saistītie gēni ir vērsti pret dažām no mūsu atklātākajām miRNS, kas izteikti izteiktāk un ievērojami pieaug, tostarp miR-196a-5p, miR-148a-3p, miR. -125a-5p un ļaujiet-7f-5p. Jo īpaši miR-196a-5p ir visaugstākā izteiktā miRNS mūsu paraugos, un starp E14.5 un P0 ir redzams 8-kārtīgs pieaugums. Gēnu transkripti, kas bija paredzamie miRNS mērķi (izmantojot TargetScan (Agarwal et al., 2015)) ar paaugstinātu ekspresiju pie P0, ietver Bach2, ierosināto molekulāro saikni starp MAPK/AP1 un Six2/-catenin ceļiem pašatjaunošanās un diferenciācijas nodrošināšanai. attiecīgi nefronu priekštečos (Hilliard et al., 2019).

Lai identificētu diferencēti izteiktu miRNS iespējamos mērķus nefronu priekštečos, mēs izmantojām miRNS skaitļošanas anotāciju, kas sniegta miRDB (Y. Chen & Wang, 2020), un anotētās eksperimentālās miRNS-mRNS mijiedarbības no javas bāzes (HY). Huang et al., 2020), kombinācijā ar mūsu iepriekš ģenerēto E14.5 vienas šūnas RNS sekvencēšanas datu kopu (Bais et al., 2020). Tādējādi mēs izveidojām iespējamo miRNS-mRNS mijiedarbību sarakstu, pamatojoties uz miR diferenciālo ekspresiju starp E14.5 un P0 nefrona priekštečos ar atbilstošām mērķa gēna ekspresijas izmaiņām starp pašatjaunojošiem un gruntētiem nefrona priekštečiem, kā arī gruntētiem un diferencējot nefronu priekštečus (2. attēls). Mūsu analīze liecina, ka Meis2 un Hmga2 ir potenciālie let-7 miRNS saimes mērķi nefronu priekštečos (2. attēls) ar samazinātu Meis2 un Hmga2 ekspresiju, kas saistīta ar palielinātu let-7 ģimenes locekļu ekspresiju. nefronu priekšteču diferencēšanā vai novecošanā. Transkripcijas faktors Meis2 ir spēcīgi izteikts nefrona priekštečos un nieru stromānieresattīstība (Lam et al., 2014), un tā ir saistīta ar šūnu proliferācijas regulēšanu citos kontekstos (Abruzzese et al., 2019). Hmga2 ir nehistona hromatīnu saistošs proteīns, tas ir ļoti izteikts cilmes šūnās, un tas ir saistīts ar dažādiem mezenhimāliem audzējiem (Fusco & Fedele, 2007; Lam et al., 2014). Tāpat pieaug Jag1 izteiksme, kas saistīta ar miR-34b-5p, miR-983p un miR-200a-3p izteiksmes samazināšanos diferencēšanā. vai novecojoši nefrona priekšteči (2. attēls). Jag1 ir galvenais ligands Notch signalizācijā, kura ekspresija palielinās, nefrona priekštečiem diferencējoties (Chung et al., 2016). Visi prognozētie vai anotētie miRNS mērķi gēniem ar ekspresijas izmaiņām starp pašatjaunojošiem, gruntētiem un diferencējošiem nefronu priekštečiem ir pieejami papildinājumā.

1. attēls. Būtiskas izmaiņas miRNS ekspresijā starp E14.5 un P0 nefrona priekštečiem. A) Galvenās komponentes analīze parāda, ka attīstības laika punkts ir galvenais miRNS ekspresijas variāciju veicinātājs. B) Siltuma karte, kas attēlo visu būtiski mainīgo miRNS relatīvo ekspresiju. Kolonnas, kas satur E14.5 paraugus kreisajā pusē, ir anotētas gaiši zaļā krāsā, un kolonnas ar P0 paraugiem labajā pusē ir anotētas tumši zaļā krāsā. C) Gēnu bagātināšana no specifiskiem KEGG ceļiem starp prognozētajiem gēnu mērķiem augšup un lejup regulētā miRNS (attiecīgi sarkanās un zilās joslas). Minimālā iekļautā p vērtība ir 1e-5.

2. attēls. miRNS-mRNS mijiedarbība ar iespējamo lomu nefrona cilmes šūnu novecošanā un diferenciācijā. Attēloti miRNS (apļi) un mRNS (kvadrātiņi). miRNS ar paaugstinātu ekspresiju starp E14.5 un P0 ir parādītas sarkanā krāsā, miRNS, kas samazinās, ir parādītas zilā krāsā. Anotēti mērķa gēni (no mirDB un mir TarBase) ar pieaugošu izpausmi starp pašatjaunojošiem, gruntētiem vai diferencējošiemnefrona cilmes šūnas(Bais et al., 2020) ir parādīti sarkanā krāsā, mRNS ar samazinātu ekspresiju zilā krāsā. MirDB un mirTarDB malas, kas neatbilst novērotajām izteiksmes izmaiņām, ir izlaistas, bet ir iekļautas 2. papildu tabulā.

Agrajiem un vēlīnām nefronu priekštečiem ir atšķirīga hromatīna vide

ATAC-seq dati no E14.5 un P0 nefronu priekštečiem ļāva mums identificēt 46 374 pieejamā hromatīna reģionus (ar nesamazināmu atklāšanas ātrumu (Boleu et al., 2015) slieksni {{ 22}}.1, skatiet (3. papildu attēls C, 3. papildu tabula), kas apvienoti paraugos un laika punktos. Mēs atzīmējam, ka mūsu dati atbilst ENCODE projekta ATAC-seq vadlīnijām (ENCODE, nd) (papildu attēls 3 A, B) un ka mēs novērojam lielāku saglabāšanās līmeni starp IDR virsotnēm, nekā tas ir redzams randomizētās kontrolēs (papildu attēls 3. D). No mūsu ziņotajiem IDR 3576 satur pastiprinātājus, kas dokumentēti VISTA (Visel et al., 2007) un/vai FANTOM5 (de Rie et al., 2017) pastiprinātāju datubāzes un 13 495 satur DNS sekvences ar paredzamām regulējošām lomām vismaz vienā peles audos vai šūnu tipā saskaņā ar EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020).

Galveno komponentu analīze (pielāgota dzimumu atšķirībām starp paraugiem) atklāja skaidru paraugu grupējumu pēc attīstības laika punkta (3.A attēls). Lai identificētu genoma lokusus ar izmaiņām hromatīna pieejamības ziņā, mēs salīdzinājām ATAC-seq signālu starp E14.5 un P0 paraugiem. Mēs novērojām 2,103 DAR, kontrolējot FDR 10 procentu līmenī. No tiem 1323 (55 procenti) uzrādīja lielāku pieejamību pie P0, salīdzinot ar E14.5, un hierarhiskā klasterizācija atklāja skaidru atšķirību starp DAR, kas atveras un aizveras attiecīgi starp E14.5 un P0 (3.B attēls).

Transkripcijas faktoru pēdas tika identificētas, izmantojot HINT, un saskaņotas ar DNS saistošajiem proteīniem, izmantojot HOCOMOCO 11 datu bāzes motīvus (Kulakovskiy et al., 2018). No 431 pārbaudītā motīva DAR, kas satur pēdas vairākiem transkripcijas faktoru proteīniem, kas saistīti ar nefroģenēzi, liecina par pieejamības palielināšanos starp E14.5 un P0. Starp pēdām, kas atrodas DAR un kuru pieejamība vidēji palielinās, seši labākie pieder transkripcijas faktoru pēdām, kas atbilst Pax8 ({{10}}.15), Six2 (0.14), Cebpd (0.13), Six4 (0.13), Jun (0.12) un Fos (0.11). Pēdu nospiedumi, kas anotēti noslēguma DAR, ietver transkripcijas faktorus E2F2 un E2F4, kas, kā zināms, ietekmē šūnu cikla progresēšanu (Gaudet et al., 2011) un veicina šūnu proliferāciju (D. Wang et al., 2000) citos šūnu kontekstos (papildu attēls). 4).

Lai novērtētu DAR atvēršanas un aizvēršanas bioloģisko kontekstu, mēs izmantojām Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool (GREAT) (McLean et al., 2010), lai izceltu gēnu kopas ar saistīto mainīgo hromatīna reģionu bagātināšanu. Izmantojot šo pieeju, mēs identificējam gēnu ontoloģijas (GO) bioloģiskos procesus, kas ir cieši saistīti ar nefrona priekšteču attīstību: jo īpaši galvenais bagātinātais process starp atvēršanas DAR ir "epitēlija šūnu diferenciācijas regulēšana" (GO: 0030856, binomiskā Q vērtība {{3). " Papildu attēls 5). Abi saskan ar nefronu priekšteču tieksmes palielināšanos diferenciācijas laikā veikt mezenhimālas-epitēlija pārejas (MET) (S. Chen et al., 2015). Citi ievērojami bagātināti ceļi ietver "Notch signalizācijas ceļa pozitīvo regulēšanu" (GO:0045747, binomiālā Q vērtība=2e-5), kas atbilst Notch signalizācijas lomai nefronu priekšteču diferenciācijas veicināšanā ( Chung et al., 2016). Konstatētie 10 083 slēgšanas DAR neatklāja nozīmīgus GO terminus, pamatojoties uz GREAT noklusējuma nozīmīguma kritērijiem (sk. 5. papildu attēlu).

3. attēls. Hromatīna pieejamības atšķirības raksturo E14.5 un P0nefrona cilmes šūnasA) ATAC-seq paraugu galveno komponentu analīze izceļ attīstības laika punktus kā galveno izmaiņu avotu. B) Siltuma karte, kas parāda būtiski mainīgus IDR reģionus ATAC-seq paraugos. E14.5 paraugi/kolonnas ir anotēti gaiši zaļā krāsā, un P0 paraugi/kolonnas ir anotēti tumši zaļā krāsā. C) GO Bioloģiskā procesa termini, kas bagātināti genoma reģioniem, kas atveras starp E14.5 un P0 saskaņā ar LIELU, ranžēti pēc binoma P vērtības, FDR ir mazāks par vai vienāds ar 0.001.

Tālāk mēs izpētījāmhromatīna pieejamībagenoma reģionos, kas satur promotorus un pastiprinātājus gēniem ar publicētām lomām nefrona cilmes šūnu diferenciācijā. Starp tiem Six2 transkripcijas faktors ir ļoti svarīgs, lai saglabātu multipotencinefrona cilmes šūnas(Self et al., 2006), un visos paraugos mēs novērojām pieejamu hromatīnu, kas ieskauj tā promotoru un zināmo Six2 pastiprinātāju ~ 50 kb augšpus Six2 transkripcijas sākuma vietas (TSS) (O'Brien et al., 2018) (attēls) 4A, B, zili iekrāsoti apgabali). Mēs atzīmējam arī pieejamā hromatīna reģionus uz promotora un publicēto proteīna Gdnf pastiprinātāju (4.D, E attēls), ko izdala nefrona priekšteči, lai veicinātu urētera pumpuru atzarojumu (Sanchez et al., 1996; Vega et al., 1996). ). Šis pastiprinātājs atrodas ~ 113 kb augšpus gēna promotora un ir zināms, ka tas reaģē uz Wnt signalizāciju nefronu priekšteču attīstības kontekstā (Park et al., 2012). Lai gan Gdnf veicinātājs laika gaitā būtiski nemainās, anotētais pastiprinātājs ievērojami palielina nepieejamību. Mēs arī atzīmējam pieejamā hromatīna reģionus, kas ieskauj publicēto pastiprinātāju, kas ir aktīvs Eya1 nefronu priekštečos, kas atrodas ~ 325 kb augšpus gēna TSS (Park et al., 2012) (6. papildu attēls). Eya1 ir transkripcijas faktors, kas mijiedarbojas ar Six2, lai saglabātu nefrona priekšteču multipotenci (J. Xu et al., 2014).

Mēs novērojam vairākus DAR, kas nepārklājas ar zināmām regulējošām iezīmēm, bet ietver reģionus, kuros tiek prognozēts, ka tiem būs pastiprinātāja aktivitāte specifiskiem gēniem dažādos peles šūnu veidos, kā norādīts EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020). Papildus publicētajam Eya1 pastiprinātājam (Park et al., 2012) (6. papildu attēls), noslēdzošais DAR vienā no Eya1 introniem (5.A–B. attēls) ietver reģionu, kurā tiek prognozēta Eya1 gēna pastiprinātāja aktivitāte pelēm. neironu cilmes šūnas un granulocītu-monocītu cilmes šūnas (Gao & Qian, 2020). Saskaņā ar pastiprinātāja aktivitātes samazināšanos mēs iepriekš esam novērojuši, ka Eya1 ekspresija tiek samazināta diferencējot nefrona priekštečus, izmantojot E14.5 scRNA-seq datus (7. papildu attēls) (Bais et al., 2020). Tas atbilst publicētajiem ChIP-seq datiem primārajos E16.5 nefrona priekštečos, kas parāda aktīvā pastiprinātāja zīmes H3K27ac trūkumu un Ctnnb1, Lef1, Six2 un Tcf7 saistīšanās trūkumu (5. attēls) (Guo et al. ., 2021). Šis potenciālais pastiprinātājs satur arī Hoxd10 transkripcijas faktoru pēdas tā maksimumā, kas ir transkripcijas faktors, kas ir būtisks nefrona priekšteču diferenciācijai un integrācijai mezenhimālas-epitēlija pārejas (MET) laikā (Yallowitz et al., 2011).

DAR, kas palielina 24. hromosomas nepieejamību, pārklājas ar hromatīna reģionu ar paredzamo transkripcijas faktora Pax8 pastiprinātāja aktivitāti šūnās, kas kultivētas no peles nierēm, zarnu epitēlija un dzemdes (Gao & Qian, 2020). Pax8 ir daļēji lieks ar Pax2, bet vismaz viens no šiem diviem transkripcijas faktoriem ir nepieciešams nefronu priekštečos.nieresattīstība (Bouchard et al., 2002; Narlis et al., 2007). Mēs iepriekš novērojām, ka Pax8 ekspresija palielinās diferencējošos un diferencētos nefronu priekštečos (7. papildu attēls), un mēs atzīmējam ievērojamu pieejamības pieaugumu DAR, kas ietver šo regulējošo funkciju. Šis reģions ir saistīts arī ar aktīvo pastiprinātāja zīmi H3K27ac un Ctnnb1, Lef1, Six2 un Tcf7 saistīšanos publicētajos ChIP-seq datos no primārajiem E16.5 nefrona priekštečiem (5. attēls) (Guo et al., 2021). Mēs novērojam vairākus transkripcijas faktoru pēdas nospiedumus, kas ietilpst šajā DAR ļoti konservētajā pieejamības maksimumā, tostarp divi Sall1, kodolfaktors, kas, kā zināms, ietekmē nefroģenēzi (Kanda et al., 2014), un septiņi cieši grupēti pēdas nospiedumi ar MYC saistītajam cinka pirkstam. proteīns (Maz), transkripcijas faktors, kuram, kā pierādīts, ir no devas atkarīga ietekme uznieresattīstība cilvēkiem un pelēm (Haller et al., 2018). Papildu tabulā ir pilns saraksts ar pieejamiem reģioniem, kurus mēs atrodam, kā arī to attiecīgā diferencētās pieejamības statistika, anotācijas gēniem, eksoniem un promotoriem, ar kuriem tie pārklājas, un galveno ar nefroģenēzi saistīto transkripcijas faktoru nospiedumu saraksti.

4. attēls. ATAC-seq profili zināmos un iespējamos regulējošos lokos. Katram panelim no augšas uz leju skalas apzīmē locījuma bagātināšanu.hromatīna pieejamībaE14.5 un P0 paraugos, IDR un DAR identificēti kā izcelti zilā krāsā (nemainīgs IDR) un zaļā krāsā (atvēršanas DAR). un sarkans (aizverot DAR). Nākamajā aspektā ir attēlotas gēnu anotācijas, nukleosomu pozīcijas (pelēks) un no nukleosomām brīvi reģioni (sarkans), kas izmērīti apvienotajos E14.5 un P0 paraugos, un PhastCon60 saglabāšanas rādītāji (melns norāda 1{{ 12}}0 procentu saglabāšanās, balta 0 procenti saglabāta A) Six2 transkripcijas faktora promotors un gēna ķermenis. B) Enhancer for Six2, ko publicēja Park et. al. C) Atšķirīgi pieejams Gdnf pastiprinātājs ar palielinātu pieejamību pie P0. D) Gdnf veicinātājs.

5. attēls. DAR, kas pārklājas ar potenciāliem jauniem pastiprinātājiem ar nefroģenēzi saistītiem gēniem. A un C) Paneļos ir attēlota 1 MB apgabala karte, kas aptver interesējošo gēnu, ar proteīnu kodējošiem gēniem zaļā krāsā un ierosināto pastiprinātāja/promotora mijiedarbību kā melnu cilpu. . B un D) No augšas uz leju paneļi attēlo locījuma bagātināšanuhromatīna pieejamībamērīts E14.5 un P0 paraugos, IDR iezīmējot zaļā krāsā (atvēršanās) un sarkanā krāsā (aizvēršanās), kam seko ChIP-seq mērījumi šajos reģionos, ko mēra Guo et. al. primārajā nefrona priekštecēšūnas(Guo et al., 2021). Trešajā panelī ir attēlotas gēnu anotācijas (zils) un prognozētie regulējošie elementi no Enhancer Atlas 2.0 (sarkans), bet ceturtais panelis apzīmē transkripcijas faktoru pēdas, kas identificētas ATAC-seq datos. Piektajā panelī ir attēlotas nukleosomas (pelēks) un NFR (sarkans), un apakšējais panelis norāda uz saglabāšanu. A) 1 MB reģions, kas satur Eya1 gēna ķermeni un potenciālo Eya1 pastiprinātāju aptuveni 325 kb augšpus straumes. B) 4,5 kb reģions, kas satur potenciālo Eya1 pastiprinātāju. C) 1 MB reģions, kas satur Pax8 gēna lokusu un paredzamo pastiprinātāju. D) 4,5 kb reģions, kas satur paredzamo pastiprinātāju un tā pārklājošos DAR.

Topoloģiski saistītie domēni palīdz identificēt potenciālo pastiprinātāju - miRNS attiecības

Topoloģiski saistīti domēni (TAD) ir augstākās kārtas hromatīna organizācijas megabāzes mēroga reģioni, kas rodas no hromatīna iesaiņošanas kodolā trīsdimensiju telpā (Dixon et al., 2012), un pastiprinātāja un veicinātāja mijiedarbība parasti ir ierobežota elementi tajā pašā TAD (Symmons et al., 2014). Mēs tuvinājām TAD no nefronu priekštečiem, izmantojot anotācijas, kas ģenerētas no peles embriju cilmes šūnām (ESC) (Y. Wang et al., 2018). Lai pārbaudītu iespējamos miRNS cis-regulējošos reģionus, mēs korelējām izmaiņashromatīna pieejamībaar diferencēti izteiktu miRNS tajā pašā TAD. Kopumā 42 778 unikāli pieejamie reģioni (apmēram 92 procenti) atrodas anotētos TAD, un no šiem 30626 (apmēram 72 procenti) nepārklājas ar zināmu veicinātāju. Tas ietver 2103 DAR, attiecīgi 1180 un 923 atveras un aizveras laika gaitā. Piecpadsmit atvēršanas DAR ir kopīgs TAD ar vienu vai vairākām miRNS ar paaugstinātu ekspresiju starp E14.5 un P0, un deviņiem aizverošajiem DAR ir TAD ar vienu vai vairākām miRNS ar samazinātu ekspresiju. 6. attēlā ir apkopota šī pieeja un parādīti attālumi starp DAR un to saskaņoto miRNS, kas svārstās no 27 kb līdz vairāk nekā 1 mb (vidēji: 447 kb). 1. tabulā ir sniegta detalizēta informācija par iespējamām DAR – miRNS attiecībām, norādot vienu DAR uz katru atbilstošo miRNS.

Starp anotētajiem miRNS pastiprinātāju pāriem mēs atzīmējam trīs īpašus intereses. Pirmkārt, tika identificēts sākuma DAR 120 kb lejpus let-7c-5p un 73 kb lejpus miR-125b-5p, kas ir saistīts ar Six2. saistīšanās vieta iepriekš publicētā E16.5 nefrona priekšteča ChIP-seq datu kopā (7.A attēls) (Guo et al., 2021). Let-7c-5p ir viena no visaugstāk izteiktajām let-7 miRNS, ko mēs atklājam, un ir zināms, ka let-7 ģimene apspiež arī Lin28b transkriptus (Slack & Ruvkun, 1997; Zhu et al., 2011). Mēs atzīmējam, ka Hmga2 un Meis2 ir arī identificēti kā potenciāli jauni let-7 ģimenes mērķi nefronu priekštečos (2. attēls). Ir pierādīts, ka miR-125b-5p arī apspiež Lin28 transkriptus peles asinsrades un cilmes šūnu veidos (Chaudhuri et al., 2012). Otrkārt, miR-9-3p ir apgriezts papildinājums miR-9-5p, miRNS, kas nesen pierādīja, ka tā aizsargā pretnieresfibroze, mērķējot uz vielmaiņas ceļiem (Fierro‐Fernández et al., 2020). Mēs atklājam vairāk nekā 10-kārtīgu miR-9-3ptranskriptu samazināšanos starp E14.5 un P0 nefrona priekštečiem, un esam identificējuši potenciālu regulējošo elementu aptuveni 249 kb attālumā (7.B attēls). Mēs novērojam Snai1 un Snai2 transkripcijas faktoru pēdas saistītajā DAR, kas, kā pierādīts, veicina pārejas no epitēlija uz mezenhimālu (EMT) (Sundararajan et al., 2019). Visbeidzot, mēs saskaņojām miR-181a-2-3p ar iespējamu starpgēnu cis-regulācijas lokusu 131 kb augšpus 2. hromosomā, kur mēs atzīmējām transkripcijas faktora pēdas nospiedumu transkripcijas faktoram Wt1, kas ir galvenais nefrona priekšteča regulators. izdzīvošana (Kreidberg et al., 1993) un Six2 saistīšanās publicētā E16.5 nefrona priekšteča ChIP-seq datu kopā (7.C attēls)) (Guo et al., 2021).

1. tabula. miRNS ekspresijas izmaiņas, kas saskaņotas ar vienu vai vairākiem DAR vienā un tajā pašā TAD.

6. attēls. Pastiprinātāja kandidātu atrašana — mērķa-miRNS pāri. A) Plūsmas diagramma, kurā norādīts, kā pieejamības reģioni tika piešķirti prioritātei iespējamai miRNS ekspresijas regulēšanai. B) Katras pārbaudītās miRNS genomiskās atrašanās vietas attiecībā pret to pastiprinātāju (oranža vertikāla josla). To log2 reizes izmaiņu skala ir parādīta uz y ass, un miRNS ar pieaugošu vai samazinošu ekspresiju ir izceltas attiecīgi zaļā un sarkanā krāsā.

7. attēls. Četri potenciālie pastiprinātāji — mērķa miRNS pāri. TAD ir izcelti pelēkā krāsā, izlīdzināti pēc sākuma punktiem un zīmēti tādā pašā skalā, lai ilustrētu relatīvo izmēru. Zināmie Ensembl gēni ir parādīti purpursarkanā krāsā, un tumšāki reģioni norāda uz eksoniem. Relatīvā pieejamība pie E14.5 un P0 ir parādīta kā joslu diagrammas attiecīgi virs un zem horizontālās melnās līnijas, kā arī ieliktņu diagrammās, kas ilustrē salikumu norādītajā DAR kopā ar ChIP-seq datiem, ko publicēja Guo et . al. (Guo et al., 2021). Transkripcijas faktoru pēdas, kas identificētas ar HINT, ir norādītas oranžos reklāmkarogos. Joslu diagrammas atsevišķos paneļos labajā pusē norāda miRNS ekspresiju (zaļa) un normalizētus Tn5 ievietošanas notikumus ierosinātajos pastiprinātāja reģionos (oranžā krāsā). A) Let-7 ģimenes loceklis let-7c-5p ir ļoti izteiktsnefrona cilmes šūnasun atbilst "peak{0}}" 119 kb attālumā starpgēnu reģionā. B) miR-9-3p atbilst DAR 249 kb attālumā. C) miR-181a 2-3p atrodas 131 kb attālumā no "pīķa_5887", kas ir iespējama starpgēnu pastiprinātāja.

Diskusija

Šajā pētījumā mēs centāmies vienlaikus identificēt jaunu miRNS, kas veicina nefroģenēzes pārtraukšanu, kā arī iespējamās cis-regulējošās iezīmes. Mēs identificējām 114 miRNS, kas ir atšķirīgi ekspresētas nefrona cilmes šūnās, kā arī 2,103 DAR E14.5, salīdzinot ar P0.nieres. Mēs novērojam vairākas pazīmes, kas paredz jaunus iespējamos pastiprinātājus gēniem Eya1 un Pax8 innefrona cilmes šūnas. Visbeidzot, mēs identificējām konsekventuhromatīna pieejamībaun miRNS ekspresijas izmaiņas 33 miRNS un DAR pāriem, tostarp let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p un miR-9-3p, un uzrāda iespējamos mērķa gēnus, kas izteikti nefrona priekštečos diferencēti izteiktām miRNS. Kopā mūsu dati parāda, ka izmaiņas, kas raksturīgas nefrona priekštečiem un ir atkarīgas no nefroģenēzes stadijas, atspoguļojas cilmes šūnas hromatīna vidē un tās miRNS transkriptā.

Starp izmaiņām, ko novērojam nefrona priekšteču miRNS transkriptā, mēs novērojam plašu ekspresijas pieaugumu let{{0}} ģimenē, ciltstēvu vecumā novecojot. Tas atbilst iepriekšējiem ziņojumiem: Lin28b proteīns un let-7 miRNS saime ir savstarpēji antagonistiski un veido bistabilu slēdzi, kas regulē let-7 ekspresiju zīdītājiem (Zhu et al., 2011) un nefrona priekštečiem, pāreja uz palielinātu let-7 ekspresiju tieši ietekmē nefroģenēzes pārtraukšanas laiku (Yermalovich et al., 2019). Mēs novērojam arī pastiprinātu miR-125b-5p ekspresiju, kas, kā zināms, arī nomāc Lin28b ekspresiju citos šūnu kontekstos (Chaudhuri et al., 2012; Potenza et al., 2017). Let-7 saime un miR-125b-5p ir starp 114 miRNS, kas nefrona priekštečos ir atšķirīgi izteiktas starp E14.5 un P0, kas liecina par miRNS lomu nefrona priekšteču attīstībā. neaprobežojas tikai ar let-7/Lin28b. Piemēram, miRNS, kuru ekspresija samazinās, ietver divus miR-200 ģimenes locekļus, kam, kā ziņots, ir nozīme podocītu diferenciācijā (Z. Li et al., 2016): miR-200b -3p un miR-429-3lpp. Tālāk mēs novērojam miR-126a 5p ekspresijas samazināšanos, kas, kā zināms, veicina vaskuloģenēzi (Schober et al., 2014; S. Wang et al., 2008). Tas var atspoguļot vaskulogēno un nefronu priekšteču kopējo mezenhimālo izcelsmi un šo šūnu apakškopas apņemšanos kļūt par nefronu priekštečiem.

Paredzēto miRNS mainīgo gēnu mērķu ceļu analīzes, izmantojot DIANA miRPath (Vlachos et al., 2015), parāda bagātināšanas MAPK un TGF-signalizāciju, kas ir abi galvenie nefronu priekšteču regulatori (Hilliard et al., 2019; Ihermann-Hella et al., 2018). ). Vairāki citi KEGG ceļi ir arī pārāk pārstāvēti starp prognozētajiem augšupregulēto miRNS gēnu mērķiem, tostarp ceļi, kas saistīti ar ārpusšūnu matricu, aktīna citoskeletu un fokusa adhēziju: visi būtiskie šūnu migrācijas, diferenciācijas, sazarošanās, piesaistes, polarizācijas un proliferācijas aspekti. (Rozario & Desimone, 2010). Ar ECM saistītie gēni ir vērsti uz dažām no mūsu atklātākajām miRNS visaugstāk izteiktajām un ievērojami pieaugošajām, ieskaitot visaugstāko atklāto transkriptu: miR-196a-5p. Ir zināms, ka miR-196a-5p mērķauditorija ir Col1a1, Col1a2 un Col3a1 — gēni, kas tiek pastiprināti regulēti nefronu priekštečos ar Paks2-deficītu un tiek pakļauti transdiferenciācijai nieru stromā (Naiman etal. al., 2017). Tādējādi palielinātai miR-196a-5izteiksmei var būt nozīme ciltsrakstu robežu nostiprināšanā, priekštečiem novecojot. Turklāt mēs identificējam jaunas iespējamās miRNS-mRNS mērķa mijiedarbības, kas var veicināt nefroģenēzes pārtraukšanu, tostarp let-7 saimes augšupregulāciju, kas var būt vērsta pret Hmga2 un Meis2 (saistīta ar šūnu proliferāciju) (Abruzzese et al. ., 2019; Fusco & Fedele, 2007; Lam et al., 2014; Mugford et al., 2009), jo nefrona priekšteči noveco. Hmga2 nav zināma lomanieresattīstību. Tomēr tiek uzskatīts, ka Meis2 funkcionāli pārklājas ar saistīto transkripcijas faktoru Meis1, kas, kā zināms, ir nepieciešams nieru attīstībai (Hisa et al., 2004). Mēs novērojam arī to miR (miR-34b-5p, miR-983p un miR-200a-3p) pazemināšanos, kas var būt mērķētas Jag1, kas, kā zināms, ir pastiprināti regulēts un svarīgs nefronu diferenciācijā (Chung et al., 2016).

Kopā ar mainīgo miRNS transkriptu mēs vienlaikus mērījām izmaiņas nefrona cilmes šūnas hromatīna vidē starp E14.5 un P0. Mēs aprakstām divus iespējamos jaunus pastiprinātājus Eya1 un Pax8, pamatojoties uz (i) to tuvumu šiem gēnu promotoriem, (ii) to attiecīgajām izmaiņāmhromatīna pieejamībaattīstības laikā, kas atbilst pseidolaika gēnu ekspresijas izmaiņām diferenciācijas laikā, (iii) pēdas nonieresattīstības transkripcijas faktori, (iv) sekvences saglabāšana, (v) pierādījumi par pastiprinātāja funkciju citos audos/šūnu tipos no Enhancer Atlas2.0 (Gao & Qian, 2020) un (vi) ChIP-seq dati E16. .5 nefronu priekšteči aktīvo pastiprinātāju (H3K27ac) un Ctnnb1, Lef1, Six2 un Tcf7 transkripcijas faktora saistīšanās zīmei. Mēs novērojam hromatīna pieejamības samazināšanos Eya1 pastiprinātājam, kas atbilst Eya1 lomai nefrona priekšteču daudzpotences veicināšanā un ziņojumiem, ka Eya1 zudums izraisa priekšteču populācijas agrīnu epitelizāciju (J. Xu et al., 2014; PX Xu et al., 1999). Pax8 un tā homologs Pax2 veicina nefronu priekšteču ciltsrakstu specifikāciju (Bouchard et al., 2002), un nefrona priekšteči bez vismaz viena no šiem gēniem netiks pakļauti MET (Narlis et al., 2007). Palielinātā hromatīna pieejamība, ko konstatējam iespējamajam Pax8 pastiprinātājam, atbilst palielinātajai Pax8 ekspresijai nieru epitēlijā, nefroniem diferencējoties.

DAR bagātināšanas analīze (McLean et al., 2010) atklāja, ka "Epitēlija diferenciācijas regulēšana" ir visnozīmīgākais termins starp atverošajiem hromatīna reģioniem, norādot, ka mūsu atklātie DAR var saturēt regulējošas iezīmes, kas virza vai reaģē uz signāliem diferenciācijai un attīstībai.nefrona cilmes šūnasepitēlija šūnu tipos. Notch signalizācija ir viens no visvairāk bagātinātajiem GO terminiem, kas identificēti starp atvēršanas DAR, un ir zināms, ka nefronu priekštečos šis ceļš nomāc Six2 ekspresiju un veicina nefrona cilmes šūnu diferenciāciju (Chung et al., 2016). Viens no šī ceļa iesaistītajiem gēniem ir Jag1, galvenais Notch signalizācijas ligands, kura ekspresija, kā ziņots, ir apgriezti korelēta ar Six2 un Hes1 ekspresiju (Chung et al., 2016). Mēs atzīmējam, ka Jag1 ir anotēts mērķis trim miRNS ar pieaugošu ekspresiju (miR34b-5p, miR98-3p un miR200a-3p, 2. attēls). Visbeidzot, mēs novērojam ar asinsvadu pārveidošanu un morfoģenēzi saistīto gēnu bagātināšanos, atverot DAR, lai gan tas, šķiet, ir sekas gēniem, kas ir kopīgi starp šiem attīstības ceļiem un epitēlija šūnu diferenciāciju, tostarp Jag1, Eya1, Hes1, Foxc1 un Hey2.

Izmaiņas iekšāhromatīna pieejamībastarpnefrona cilmes šūnasir izmērīti iepriekšējos pētījumos (Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019).

Kopumā mūsu rezultāti atbilst šiem iepriekšējiem pētījumiem, izceļot ar Notchsignaling un Pax{0}}saistītos gēnus. Tomēr, salīdzinot ar šo ziņojumu, šajos iepriekšējos pētījumos ir dažas eksperimentālas atšķirības. GFP ekspresējošo nefronu priekšteču izolēšana, izmantojot ar fluorescenci aktivizētu šūnu no Six2-TGC transgēnu reportieru peles, ir potenciāli sajaukta ar konstatējumu, ka šai alēlei ir ziņots par nefronu skaita samazināšanos par aptuveni 45 procentiem (Hilliard et al. , 2019; Volovelsky et al., 2018). Turklāt ir pierādīts, ka kultivētiem nefronu priekštečiem (audzēti ar mazu vai lielu CHIR devu) ir atšķirīgi transkripti no primārajiem nefronu priekštečiem, kas liecina, ka arī to pieejamība hromatīnam būtu atšķirīga (Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019). Tā kā mūsu pētījuma mērķis bija saprast, kā izmaiņas hromatīna ainavā ietekmē miRNS ekspresiju agrīnā un vēlīnā nefrona priekštečos, bija nepieciešama primāro nefronu priekšteču analīze.

Cistanche ir labāka nierēm

Apvienojot šīs novērotās izmaiņas hromatīna vidē ar atbilstošām miRNS ekspresijas izmaiņām, mēs iesaistām vairākus jaunus iespējamos miRNS pastiprinātāju pārus nefroģenēzes pārtraukšanā turpmākai izpētei. Piemēram, miRNS miR-125a-5p un let-7c-5p redz ievērojamu izteiksmes pieaugumu starp E14.5 un P0 , un to atkārto pieaugošā DAR (chr16:77,719,058 77,720,407) nepieejamība tajā pašā TAD. Šis DAR ir saistīts arī ar Six2 saistīšanās vietu (Guo et al., 2021) un var apzīmēt pastiprinātāju, kas ietekmē miR-125a-5p un/vai let{{18} }c-5p, kas savukārt varētu veicināt diferenciāciju, apspiežot Lin28b. Līdzīgi mēs novērojam iespējamo miR 181a pastiprinātāju, kas, kā zināms, modulē renīna ekspresiju cilvēkiem (Marques et al., 2015) un tiek uzskatīts par terapeitisku mērķi, lai samazinātu nefrotoksicitāti, jo tas spēj apspiest BIRC6 un apoptozi (Liu et al., 2015). al., 2018). Visbeidzot, mēs novērojam beigu DAR, kas saistīts ar miR-9-3p, kam ir transkripcijas faktora pēdas uz Wnt signāliem reaģējošiem proteīniem Snai1 un Snai2.miR-9-3p reversajam komplementam miR-9-5p, ir zināms, ka tas aizsargā nonieresIr pierādīts, ka fibroze (Fierro‐Fernández et al., 2020), Snai1 un Snai2 veicina karcinomas metastāzes peļu ādas vēža šūnās (Olmeda et al., 2008) un vēža slimniekiem veicina epitēlija-mezenhimālās pārejas (EMT). (Sundararajan et al., 2019), savukārt ir zināms, ka miR-9 veicina angiogenēzi un audzēja endotēlija šūnu migrāciju (Zhuang et al., 2012). Var pastāvēt mehānisms, kurā palielināta Wnt signalizācija samazina Snai1 un Snai2 ekspresiju, kas savukārt samazina miR-9-3p ekspresiju, lai atbalstītu nefrona priekšteču diferenciāciju.

Mūsu pētījums vispusīgi identificēja izmaiņas nefronu priekšteču hromatīna ainavā un miRNS transkriptā embriju attīstības laikā, un mēs esam identificējuši kandidātu cis-regulācijas reģionus un miRNS, kuriem var būt nozīme nefroģenēzes pārtraukšanā. Gan mRNS-seq, gan ATAC-seq datu bagātināšanas analīze sniedz vilinošas norādes par mehānismiem, kas var būt iesaistīti, piemēram, ceļiem, kas regulē nefrona priekšteču diferenciāciju, tostarp kā Notch un TGF-. Mēs arī ziņojam par diviem jauniem iespējamiem regulējošiem elementiem Eya1 un Pax8, gēniem, kas, kā zināms, ir svarīginieresattīstību un iespējamās regulējošās sekvences galvenajai miRNS, kas ir saistītas ar nefroģenēzes pārtraukšanu.

Metodes

Peļu celmi

Savvaļas tipa CD-1 laikā pārotas grūsnas mātītes tika iegūtas no Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, ASV, RRID: MGI:5659424) unnierestika savākti no metieniem embrija dienā E14.5 vai P0. Visi dzīvnieki tika izmitināti vivārijā Rangosas pētniecības centrā Pitsburgas UPMC Bērnu slimnīcā (Pitsburga, PA, ASV), un visi eksperimenti ar dzīvniekiem tika veikti saskaņā ar Institucionālās dzīvnieku aprūpes un lietošanas komitejas politiku. Pitsburga. Katra embrija vai mazuļa dzimums tika identificēts, veicot PCR genoma DNS, kas izolēta no astes izgriezumiem, izmantojot šādus Y-hromosomas gēna Sry primerus: SryF 5ʹ-GATGATTTGAGTGGAAATGTGAGGTA-3ʹ un SryR 5ʹ-CTTATGTTTATAGGCAT,-3GTA', iepriekš publicēts (McFarlane et al., 2013).

Mazo RNS sekvencēšana un analīze

Kopējā RNS, kas izolēta nonefrona cilmes šūnasAtlikušais pēc ATAC-seq šūnu frakcijas noņemšanas tika iesniegts Pitsburgas UPMC Bērnu slimnīcas Veselības zinātņu sekvencēšanas kodolam bibliotēkas sagatavošanai, izmantojot QIAseq miRNA bibliotēkas sagatavošanas komplektu (Qiagen 3315{{10}}2). Viena gala mRNS-seq bibliotēku sekvencēšana tika veikta Illumina NextSeq500, un bibliotēkas tika sekvencētas līdz aptuveni 50 miljoniem viena gala nolasījumu vienā bibliotēkā. Pēc tam secīgie nolasījumi tika saskaņoti ar peles mm10 genomu, izmantojot Rsubread pakotni (Liao et al., 2019) (versija 2.0.1), un anotēti ar zināmu miRNS, kas norādīta miRBase (versija 22) (Kozomara & Griffiths-Jones, 2014). ar Rsubread pakotnes funkciju Counts. Zināmās miRNS diferenciālā ekspresija tika mērīta, izmantojot DESeq2 R pakotni (versija 1.26.0) (Love et al., 2014). Izlīdzināto nolasījumu daļa, kas anotēta ar zināmu miRNS, kā arī sieviešu embriju daļa vienā paraugā tika iekļauti kā kofaktori testēšanas modelī, kas iesniegts DESeq2. Pēc tam tika identificētas diferencēti izteiktas miRNS, vienlaikus kontrolējot viltus atklāšanas biežumu pie 5 procentiem, un to izmaiņu virziens (pieaug vai samazinās) tika noteikts, pamatojoties uz to kārtu izmaiņu vērtību (“pieaugums”, kas norāda uz augstāku ekspresiju pie P0, salīdzinot ar E14.5). . Regulēšanas ceļu bagātināšana starp prognozētajiem miRNS gēnu mērķiem ar ievērojami pieaugošu un samazinošu ekspresiju tika aprēķināta, izmantojot DIANA rīku miRPath versiju 3.0 (Vlachos et al., 2015). Paredzamie miRNS mērķa transkripti tika iegūti no TargetScan (Agarwal et al., 2015) un miRDB (Y. Chen & Wang, 2020) krātuvēm.

Nefrona priekšteču izolācija

Nierestika izdalīti no {{0}} E14.5 embriju vai P0 mazuļu metieniem, un katrs metiens tika uzskatīts par vienu paraugu. Viena niera katrā paraugā tika izmantota pilnīgai RNS izolācijai, ko turpmākajās analīzēs izmantoja kā "visas nieres kontroli" (skatīt zemāk). Katrā laika punktā tika savākti pavisam trīs paraugi. Pēc tam kortikālās šūnas tika izolētas no katra parauga, izmantojot magnētiski aktivētu šūnu šķirošanu (MACS), kā iepriekš publicēts (Brown et al., 2011). Īsumā, nieres tika daļēji sagremotas ar 2 mM kolagenāzi A (Roche 11088793001) un 3,5 mM pankreatīnu (Sigma P1625) fosfātu buferšķīdumā (PBS) 15 minūtes 37 grādu temperatūrā. Gremošanas reakcija tika apturēta, izmantojot aukstu 100% liellopu augļa serumu (FBS), un šūnu suspensija tika savākta un atkārtoti suspendēta aukstā Dulbecco fosfātu buferšķīdumā (DPBS) ar 1 mM fenilmetilsulfonilfluorīda (PMSF) proteāzes inhibitoru1 (Sigma-Aldrich 1083). Šūnas tika mazgātas un atkārtoti suspendētas ledusaukstā izolācijas buferšķīdumā, kas sastāvēja no 2% FBS PBS, pēc tam inkubēja ar magnētiskām lodītēm (Dynabeads FlowComp Flexi komplekts, ThermoFisher 11061D), kas biotinilētas pret antivielām Integrin alfa 8, AF R&D078 (AF R&D078). izmantojot DSB-X Biotin Protein Labeling Kit (ThermoFisher D-20655). Nefronu priekšteči, kas saistīti ar šīm lodītēm, tika izolēti, kā iepriekš publicēts (Hemker et al., 2020), un katram paraugam tika apvienoti nierēs. 50,{29}} nefrona cilmes šūnu alikvota tika nekavējoties apstrādāta caurhromatīna pieejamībabibliotēkas sagatavošanas protokolu (skatīt zemāk), un kopējā RNS tika ekstrahēta no atlikušās šūnu suspensijas, izmantojot Qiagen miRNeasy Mini Kit (Qiagen 217004).

Lai apstiprinātu bagātināšanunefrona cilmes šūnassalīdzinot ar citiem šūnu tipiem, kopējā RNS tika izolēta no nefrona priekštečiem, kā arī no veseliemnieres(visa nieru kontrole, skatīt iepriekš), un tika veikta kvantitatīvā reversās transkripcijas PCR (qRT-PCR) šādiem marķieriem: nefrona cilmes marķieri Six2 un Cited1 (L. Huang et al., 2016), un Lhx1, Pdgfr, Pekanrieksts un Kalebs, kas iezīmē nieru pūslīšus (Brunskill et al., 2014), nieru stromu (S. Chen et al., 2015), endotēliju (Kobayashi et al., 2008) un urīnizvadkanālu (Cebrian et al., 2014a). ) šūnas, attiecīgi; skatīt arī 1. papildu attēlu. Gapdh (Barber et al., 2005) tika izmantots kā mājturības gēns, un relatīvā kvantitatīvā noteikšana tika aprēķināta, izmantojot 2-ΔΔCt metodi (Livak & Schmittgen, 2001). Šo transkriptu primeri ir iekļauti 2. tabulā.

2. tabula. RT-PCR praimeri.

Hromatīna pieejamībabibliotēkas sagatavošana

Aptuveni 50,000nefrona cilmes šūnastika izmantoti, lai ģenerētu katru ATAC-seq sekvencēšanas bibliotēku, izmantojot Nextera DNA Flex Library sagatavošanas komplektu (Illumina FC-121-1030) ar modifikācijām saskaņā ar iepriekš publicētu metodi (Buenrostro et al., 2013). Īsumā, šūnas tika suspendētas ledus aukstā nejonu līzes buferšķīdumā, kas sastāvēja no 10 mM Tris, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 1 mM PMSF proteāzes inhibitora un 0,05 tilpuma procentiem Triton X-100, lai lizētu šūnu. membrānas, atstājot neskartas kodola membrānas. Neskarti nefrona priekšteču kodoli tika atkārtoti suspendēti transpozīcijas buferšķīdumā, kas satur transpozāzes enzīmu, un inkubēti 37 grādu temperatūrā 30 minūtes. Brīvā genoma DNS, kas tika atbrīvota transponēšanas procesā, tika attīrīta, izmantojot MinElute PCR attīrīšanas komplektu (Qiagen 28004), un pēc tam indeksēta, izmantojot priekšējā (i7) un reversā (i5) indeksa praimerus no Nextera indeksa komplekta (Illumina FC{19}}). Indeksa ligācija un fragmentu amplifikācija tika panākta, izmantojot metodes PCR amplifikācijas termiskās cikla programmu.

Lai noteiktu optimālo pastiprināšanas ciklu skaitu, kas nepieciešams ATAC-seq bibliotēkai, tika veikta qPCR blakusreakcija, izmantojot SsoAdvanced SYBR Supermix (BioRad 1725274) un 96-iedobi C100 Thermal Cycler (Bio-Rad), lai aprēķinātu normalizēto vērtību. ziņotāja vērtība (Rn) katram ciklam. Cikla numurs, kurā reakcija sasniedza vienu trešdaļu no maksimālās fluorescences, tika identificēts kā optimālais atlikušo amplifikācijas ciklu skaits, un atlikušais indeksētās ATAC-seq transpozīcijas reakcijas tilpums tika pakļauts šim papildu ciklu skaitam galīgajā pastiprināšanā. programma. Galīgās bibliotēkas tika attīrītas, izmantojot Ampure XP magnētiskās lodītes (Beckman Coulter A63881).

Hromatīna pieejamībasekvencēšana

ATAC-seq bibliotēkas pāra gala sekvencēšanu veica Illumina NextSeq500, ko veica Pitsburgas UPMC Bērnu slimnīcas Health Sciences Sequencing Core, multipleksējot ar bibliotēkas koncentrāciju, kas nodrošinās 90 miljonus pāru galu nolasījumu katrā paraugā. . Lasījumi tika kvalitatīvi apgriezti, izmantojot TrimGalore (BabrahamLab, 2014) (versija 0.4.3) režīmā “--paired” un ar citiem noklusējuma iestatījumiem. Nolasījumi tika saskaņoti ar mm10 genomu (Church et al., 2011), izmantojot Bowtie2 (Langmead et al., 2009) (versija 2.3.1) ar iestatījumiem "--local -q -X 2000 -- m". Nolasījumi, kas iegūti no viena un tā paša DNS fragmenta PCR dublikātiem, tika atzīmēti, izmantojot Picard Tools (Broad Institute, 2016) MarkDuplicates funkciju (versija 2.10.9) ar noklusējuma iestatījumiem. Lasījumi, kas neviennozīmīgi kartēti vairāk nekā vienā genoma vietā, tika nejauši piešķirti vienai no šīm vietām, ja bija mazāk nekā četras iespējas, un citādi tika izslēgti (ENCODE, nd) (izmantojot Python skriptu, kas pieejams vietnē https://github. com/kundajelab/atac_dnase_pipelines, (Lee, 2017) ar iestatījumiem “--paired-end -k”). Samtools (H. Li et al., 2009) (versija 1.3.1) tika izmantots, lai filtrētu dublētus, nekartotus, bāreņus un mitohondriju nolasījumus, kā arī BAM failu šķirošanu un indeksēšanu. ATAC-seq datu kvalitātes kontrole tika veikta saskaņā ar ENCODE projekta ATAC-seq vadlīnijām (ENCODE, nd), un paraugu bibliotēkām tika nejauši samazināts paraugs, lai katrā no tiem būtu 31 miljons pāra gala nolasījumu, lai normalizētu bibliotēkas izmēru atšķirības.

Cistanche var novērst nieru infekciju

Pieejamo hromatīna reģionu identificēšana

BAM faili, kas satur filtrētus ATAC-seq nolasījumus, tika pārveidoti pāra gala BED formātā, izmantojot Bedtools (Quinlan & Hall, 201{{20}}) (versija 2.26.0) "bombed" ' funkcija ar iestatījumiem "- bed pe -mate1". Pieejamā hromatīna reģioni tika identificēti, izmantojot uz modeli balstītu ChIP-seq rīku (MACS2, versija 2.1.1.20160309) plašās maksimuma izsaukšanas algoritmu (Zhang et al., 2008), ar iestatījumiem "--format BEDPE {{ 18}}g mm -p 0.01 --plašs --shift 37 --teksta izmērs 75 --keep-dup all --model". Lai identificētu augstas ticamības pieejamos reģionus, tika veikti pāru salīdzinājumi (katrai atkārtojumu kombinācijai no noteiktā laika punkta) un tika aprēķināts neproducējams atklāšanas līmenis (IDR) (Q. Li et al., 2011), izmantojot publiski pieejamu Python ieviešana (GitHub https://github.com/nboley/idr) (Boleu et al., 2015) ar iestatījumiem "--input-file-type wide peak --rank p.value {{ 35}}soft-IDR-threshold 0.1 --output-file-type bed". Konkrēti, katram laika punktam tika iesniegts visu pieejamo reģionu sasaistīts BED fails, izmantojot argumentu "--peak-list" katram salīdzinājumam (piemēram, salīdzinot divus E14.5 paraugus, visas E14.5 plašās virsotnes). starp visiem trim atkārtojumiem). Pieejamības reģioni, kurus IDR saskanēja vismaz divos pāru atkārtojumos (ar vismaz 20 procentu pārklāšanos), tika apvienoti vienotā augstas ticamības pieejamo reģionu kopā (“IDR reģioni”).

Izmaiņas pieejamajos hromatīna reģionos

Katra IDR reģiona pieejamība noteiktā paraugā tika kvantificēta, saskaitot transponēšanas notikumu skaitu, kas notiek, normalizējot secības GC saturu visos paraugos. Tas tika panākts, izmantojot pielāgotu skriptu (pieejams pievienotajā programmatūras repozitorijā, skatiet papildu datus). Pēc tam šīs pieejamības izmaiņas tika noteiktas, salīdzinot šīs vērtības dažādos laika punktos, izmantojot Limma-voom (versija 3.42.2) programmatūras pakotni (Ritchie et al., 2006). Lai ņemtu vērā embriju dzimumu, sieviešu embriju daļa katrā paraugā tika iekļauta kā kofaktors lineārajos modeļos, ko izmantoja diferenciālās pieejamības analīzei, un tā tika noņemta kā partijas efekts vizualizācijās, izmantojot Limma pakotnes noņemšanas partijas efekta funkciju. Tika uzskatīts, ka atšķirīgi pieejamie hromatīna reģioni (DAR) ievērojami atveras (palielināta pieejamība starp E14.5 un P0) vai aizveras (samazināta pieejamība starp E14.5 un P0), kontrolējot viltus atklāšanas līmeni 10 procentos. . Genomisko reģionu atvēršanas un aizvēršanas funkcionālās bagātināšanas analīzes tika noteiktas, iesniedzot attiecīgās koordinātas Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool (GREAT, pieejams http://great.stanford.edu/public/html/) (McLean et al., 2010). ). Zināmo un paredzamo pastiprinātāju anotācijas tika iegūtas no FANTOM5 (Andersson et al., 2014), VISTA (Visel et al., 2007) un EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020) krātuvēm.

Transkripcijas faktoru pēdas

Transkripcijas faktoru pēdas tika identificētas, apvienojot visus BAM failus no viena laika punkta, pēc tam palaižot Regulatory Genomics Toolbox Hmm balstītu TF pēdu identifikācijas (HINT) programmatūru (versija 0.12.3), īpaši ATAC pēdas nospiedumu modeli. -seq dati (pieejami vietnē www.regulatory-genomics.org ) (Z. Li et al., 2018). Šī programmatūra tika palaists ar iestatījumiem "labā mājiena pēdas nospiedums --organisms=mm10 --at-seq --paired-end". Pēc tam pēdas tika anotētas ar zināmiem peles saistīšanas motīviem no HOCOMOCO 11 datu bāzes (Kulakovskiy et al., 2018), izmantojot HINT motīvu saskaņošanas funkciju ar iestatījumiem "labā motīva analīze atbilst --organismam=mm10". Pēdas ar HINT punktu skaitu zem 10 tika izslēgtas. Visbeidzot, motīvam atbilstošo pēdu nospiedumu atšķirīgās aktivitātes tika mērītas, izmantojot RGT-HINT programmas diferenciālo funkciju ar iestatījumiem “labā mājiena diferenciāls --organisms=mm10 --bc {{27} }NC 12 --izejas profili". Ievērojami mainīgie aktivitātes līmeņi tika identificēti, pamatojoties uz p-vērtības robežvērtību 0, 05 (Frīdmena-Nemenī metode).

Cistanche var uzlabot nieru darbību

Nukleosomu konfigurācija

Izlīdzinātie nolasījumi no tā paša laika punkta tika apvienoti vienā BAM failā, un NucleoATAC pakotne (versija 0.3.4) tika izmantota, lai identificētu nolasīšanas garuma modeļus, kas liecina gan par saistītām nukleosomālām diādēm, gan no nukleosomu brīviem reģioniem ( NFR) (Schep et al., 2015). Šī programmatūra tika izpildīta, izmantojot noklusējuma iestatījumus. Nukleosomas tika anotētas kā 146 bp reģions, kas centrēts ap katru, ko sauc par nukleosomu diādi.

Vienšūnas RNS ekspresija

Vienas šūnas gēnu ekspresijas dati tika apstrādāti iepriekšējam manuskriptam (BioRxiv https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.16.300293v1) (Bais et al., 2020), un tie tika iegūti no Gēnu ekspresijas omnibusa. (GEOID GSE158166). Apstrādātie dati, kas iekļauti 7. papildu attēlā, ietver šūnu tipus, gēnu ekspresijas līmeņus, zemu dimensiju (tSNE) iegulšanu un pseidolaika anotācijas attiecībā uz trajektoriju, kas noteikta starp proliferējošu un diferencējošu nefronu priekšteču kopām. Datiem tika piekļūts un tie tika sakārtoti, izmantojot SingleCellExperiment R pakotni (Lun & Risso, 2019).

miRNS-mRNS mijiedarbība nefrona cilmes šūnu novecošanā un diferenciācijā

Gēni ar mainīgu izteiksmi starp pašatjaunošanos, sagatavošanu un diferenciācijunefrona cilmes šūnastika iegūti no 3. un 4. papildu tabulas, ko publicēja Bais et al. (FDR< 0.1="" for="" all="" genes,="" 99="" genes="" total).="" mirtarbase="" v8.0="" for="" the="" mouse="" was="" downloaded="" (https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/~mirtarbase/mirtarbase_2022/cache/download/8.0/mmu_mt="" i.xls)="" while="" mirdb="" version="" 6.0="" predictions="" were="" obtained="" from="" the="" mid="" b="" website="" (y.="" chen="" &="" wang,="" 2020);="" high-quality="" mirna-to-target-gene="" predicted="" interactions="" with="" a="" minimum="" score="" of="" 90="" were="" considered.="" annotated="" mir="" target="" genes="" and="" differentially="" expressed="" genes="" were="" then="" intersected="" using="" the="" r="" programming="" environment="" to="" generate="" figure="" 2="" and="" supplemental="" table="">

Hromatīna imunoprecipitācijas sekvencēšana primārajos nefrona priekštečos

Hromatīna imunoprecipitācijas sekvencēšanas (ChIP-seq) dati par -katenīna, Lef1, Six2 un Tcf7 saistīšanos primārajos nefrona priekštečos tika iegūti no BedGraph failiem GEO repozitorijā (GSE131119) Guo et al., 2021. Gadam. vairākos paraugos.

MiRNS ekspresiju ietekmējošo regulējošo elementu skrīnings

Lai pārbaudītu iespējamos miRNS pastiprinātājus, mēs anotējām miRNS un DAR ar topoloģiski saistītajiem domēniem (TAD), kuros tie atrodas, pamatojoties uz mm10 anotācijām no peles embriju cilmes šūnām, kas lejupielādētas no 3D genoma pārlūka (pieejams vietnē http://3dgenome .fsm.northwestern.edu/) (Y. Wang et al., 2018). Reģionihromatīna pieejamībaun miRNS tika uzskatīti par kandidātu pastiprinātājiem - miRNS pāriem, ja tie aizņēma to pašu TAD un uzrādīja konsekventas pieejamības un izteiksmes izmaiņas (palielinot pieejamību, palielinoties miRNS ekspresijai un otrādi). DAR tika uzskatīti par iespējamām "regulējošām iezīmēm", ja tie nepārklājās ar zināmu promotoru vai eksona galu. Potenciālie miRNS un iespējamo regulējošo elementu pāri tika piešķirti par prioritāti, ja tie 1) ietilpa vienā un tajā pašā TAD un 2) piedzīvoja būtiskas izmaiņas starp E14.5 un P0 (palielinot miRNS ekspresiju un palielinot IDR reģiona pieejamību, un otrādi) .

Pateicības

Shelby Hemker un Abha Bais piedalījās eksperimentālajā dizainā. ATAC-seq un mRNA-seq sekvencēšanu veica Pitsburgas UPMC Bērnu slimnīcas Veselības zinātņu sekvencēšanas kodols.

Konkurējošas intereses

Konkurējošas intereses nav deklarētas

Finansējums

AC tika atbalstīta ar Nacionālā diabēta un gremošanas institūta dotācijām unNieresSlimības, ko nosaka Nacionālais veselības institūts (T32DK061296-17). DK tika atbalstīta ar Nacionālā veselības institūta Nacionālā vispārējo medicīnas zinātņu institūta dotācijām (R01GM115836). JH tika atbalstīta ar Nacionālā veselības institūta Nacionālā diabēta un gremošanas un nieru slimību institūta dotācijām (R01DK103776 un 125015). DMC atbalstīja Nefrotiskā sindroma pētījumu tīkla (NEPTUNE) karjeras attīstības balva un Pitsburgas Pētniecības konsultatīvās padomes Bērnu slimnīcas pēcdoktorantūras stipendija. YP atbalstīja dotācijas no Pitsburgas UPMC Bērnu slimnīcas un Ziemeļamerikas mitohondriju slimību konsorcija.

Datu pieejamība

Paredzētie peles pastiprinātāji tika izgūti no FANTOM5 (DOI: 10.1038/nature12787; fails pieejams šeit), Vista (DOI: 10.1093/var/gkl822; fails pieejams šeit) un EnhancerAtlas (DOI: 10.1093/var/gkz980 pieejami šeit); peles faili datubāzēm. Peles mm10 genoms un tā anotācijas tika lejupielādētas, izmantojot Illumina genomu projektu (pieejams šeit). Virsķēdes fails mm9 koordinātu pacelšanai uz mm10 tika izgūts no UCSC genoma pārlūkprogrammas (DOI: 10.1101/gr.229102; fails pieejams šeit). TAD anotācijas no peles embriju cilmes šūnām tika izgūtas no 3D genoma pārlūkprogrammas (DOI: 10.1186/s13059-018-1519-9; fails pieejams šeit). Paredzamie miRNS transkripcijas mērķi tika izgūti no TargetScan (DOI: 10.7554/eLife.05005, fails pieejams šeit) un no miRDB 6. versijas (DOI: 10.1093/var/gkz757, fails pieejams šeit). ATAC-seq dati, tostarp IDR/DAR atrašanās vietas, anotācijas un diferenciālās bagātināšanas rezultāti, ir pieejami GEO (GSE168339), kā arī mRNS-seq dati, tostarp anotācijas un diferenciālās izteiksmes rezultāti (GSE168342). Datora kods, ko izmanto datu apstrādei un analīzei, kā arī skaitļu ģenerēšanai, ir pieejams vietnē https://bitbucket.org/clugstonA/mirna_enhancers

Bibliogrāfija

Abruzzese, MP, Bilotta, MT, Fionda, C., Zingoni, A., Soriani, A., Petrucci, MT, Ricciardi, MR, Molfetta, R., Paolini, R., Santoni, A. un Cippitelli, M (2019). Homeobox transkripcijas faktors MEIS2 ir vēža šūnu izdzīvošanas un IMiD aktivitātes regulators multiplās mielomas gadījumā: modulācija ar bromodomēna un ekstra-termināla (BET) proteīna inhibitoriem. Šūnu nāve un slimības, 10(4). https://doi.org/10.1038/s41419-019-1562-9

Agarwal, V., Bell, GW, Nam, JW un Bartel, DP (2015). Efektīvu mikroRNS mērķa vietu prognozēšana zīdītāju mRNS. ELife. https://doi.org/10.7554/eLife.05005

Anderson, R., Gebhard, C., Miguel-Escalada, I., Hoof, I., Bornholdt, J., Boyd, M., Chen, Y., Zhao, X., Schmidl, C., Suzuki, T ., Ntini, E., Arner, E., Valen, E., Li, K., Schwarzfischer, L., Glatz, D., Raithel, J., Lilje, B., Rapin, N., … Sandelin, A. (2014). Aktīvo pastiprinātāju atlants cilvēka šūnu tipos un audos. Daba, 507(7493), 455–461. https://doi.org/10.1038/nature12787

BabrahamLab. (2014). Apgrieziet daudz. Bioinformātikā. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_pārpilnība

Bais, AS, Cerqueira, DM, Clugston, AS, Ho, J., & Kostka, D. (2020). Vienas šūnas RNS sekvencēšana atklāj atšķirīgu šūnu cikla aktivitāti galvenajās šūnu populācijās nefroģenēzes laikā. BioRxiv. https://doi.org/https://doi.org/10.1101/2020.09.16.300293

Barber, RD, Harmer, DW, Coleman, RA un Clark, BJ (2005). GAPDH kā mājturības gēns: GAPDH mRNS ekspresijas analīze 72 cilvēka audu panelī. Fizioloģiskā genomika. https://doi.org/10.1152/physiolgenomics.00025.2005

Bartel, DP (2009). MicroRNA mērķa atpazīšanas un regulējošās funkcijas. Cell, 136(2), 215–233. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.01.002.MicroRNA

Bertrams, JF, Douglas-Denton, RN, Diouf, B., Hughson, MD un Hoy, WE (2011). Cilvēka nefrona numurs: ietekme uz veselību un slimībām. Pediatric Nephrology, 26(9), 1529–1533. https://doi.org/10.1007/s00467-011-1843-8

Boleu, N., Kundaje, A., Bickel, PJ un Li, Q. (2015). Nereproducējams atklāšanas līmenis (2.0.3). https://github.com/nboley/idr

Bouchard, M., Souabni, A., Mandler, M., Neubüser, A., & Busslinger, M. (2002). Pax2 un Pax8 nefriskās līnijas specifikācija. Gēni un attīstība. https://doi.org/10.1101/gad.240102

..............

No: Journal Pre-proof

2021 Izdevējs Elsevier Inc.