Cistanche Deserticola polisaharīds vājina osteoklastoģenēzi un kaulu rezorbciju, inhibējot RANKL signālu un reaktīvo skābekļa sugu veidošanos

Kontaktpersona:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Dezhi Song et al

Osteoporoze ir vielmaiņas slimība, ko raksturo osteopēnija un kaulu mikrostruktūras pasliktināšanās. Osteoklasti ir primārās efektoršūnas, kas noārda kaulu matricu, un to patoloģiska funkcija izraisa osteoporozes attīstību. Reaktīvo skābekļa sugu (ROS) uzkrāšanās šūnu metabolisma laikā veicina osteoklastu proliferāciju un diferenciāciju, tādējādi spēlējot nozīmīgu lomu osteoporozes ārstēšanā.Cistanchedeserticolapolisaharīds(CDP) piemīt pretvēža, pretiekaisuma un antioksidanta aktivitāte. Tomēr CDP ietekme uz osteoklastiem nav skaidra. Šajā pētījumā tika izmantota pret tartrātu rezistenta skābes fosfatāzes krāsošana, imunofluorescence, reversās transkripcijas-polimerāzes ķēdes reakcija un Western blot analīze, lai pierādītu, ka CDP.(Cistanchedeserticolapolisaharīds)kavēja osteoklastoģenēzi un hidroksilapatīta rezorbciju. Turklāt CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)inhibēja arī osteoklastu marķieru gēnu, tostarp Ctsk, Mmp9 un Acp5, ekspresiju, un tas neietekmēja kodolfaktora κB (RANK) ekspresijas receptoru aktivatoru. Mehāniskās analīzes atklāja, ka CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)palielina antioksidantu enzīmu ekspresiju, lai vājinātu RANKL mediēto ROS veidošanos osteoklastos un inhibē aktivēto T šūnu kodolfaktoru un mitogēna aktivētās proteīnkināzes aktivāciju. Šie rezultāti liecina, ka CDP var būt kandidāta zāles osteoporozes ārstēšanai, ko izraisa pārmērīga osteoklastu aktivitāte.

ATSLĒGVĀRDIkaulu rezorbcija,Cistanchedeserticolapolisaharīds, MAPK, osteoklasti, reaktīvās skābekļa sugas

cistanche kultūrisms

1|IEVADS

Līdzsvaram starp kaulu veidošanos, ko mediē osteoblasti, un kaulu rezorbciju, ko mediē osteoklasti, ir būtiska nozīme kaulu vielmaiņas homeostāzes uzturēšanā (Manolagas, 2000; Zhu et al., 2018). Kad kaulu rezorbcija pārsniedz kaulu veidošanos, rodas osteoporoze, kurai raksturīga kaulu masas samazināšanās un kaulu mikrostruktūras bojājumi (Ikeda, 2008). Osteoporoze ir izplatīta slimība gados vecākiem cilvēkiem un sievietēm pēcmenopauzes periodā, un tās patoģenēze nav pilnībā noskaidrota (Cooper & Melton, 1992). Estrogēna deficīts ir galvenais osteoporozes cēlonis (Manolagas, O'Brien un Almeida, 2013). Turklāt reaktīvās skābekļa sugas (ROS) var izraisīt kodolfaktora κB liganda (RANKL) receptoru aktivators, un tās ir saistītas ar osteoklastu veidošanos (Yip et al., 2005), un tādējādi var veicināt osteoporozes attīstību (Manolagas, 2010). Dažos pētījumos ir atklāts, ka Nrf2-antioksidanta deficīts paaugstina ROS līmeni un veicina RANKL izraisītu osteoklastu diferenciāciju (Hyeon, Lee, Yang un Jeong, 2013). Tāpēc ROS ražošanas samazināšana osteoklastu diferenciācijas laikā ir jāizvērtē kā terapeitiska stratēģija osteoporozes ārstēšanai.

Osteoklasti ir atvasināti no monocītu vai makrofāgu hematopoētiskās līnijas un ir vienīgās daudzkodolu šūnas, kas veic kaulu rezorbciju (Teitelbaum, 2000). Tāpēc pētījumiem, kas saistīti ar osteoklastu veidošanos, ir liela nozīme, lai izstrādātu efektīvas ārstēšanas metodes kaulu vielmaiņas slimībām (Lorenzo, 2017). Makrofāgu koloniju stimulējošais faktors (M‐CSF) un RANKL, ko ražo osteoblasti un aktivētas T šūnas, ir svarīgi citokīni, kas regulē osteoklastoģenēzi (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL inducē aktivēto T šūnu kodolfaktora (NFATc1) ekspresiju, kas ir būtisks transkripcijas faktors, kas ir aktīvs osteoklastu veidošanās laikā (Ishida et al., 2002). Aktivētais NFATc1 veicina osteoklastu marķieru gēnu, piemēram, pret tartrātu rezistentās skābes fosfatāzes (TRAcP) un katepsīna K (CTSK) ekspresiju, kas regulē osteoklastoģenēzi un osteoklastu funkciju (Balkan et al., 2009; Crotti et al., 2008).

Cistanchedeserticolapolisaharīds(CDP) ir izolēts no gaļīgajiem kātiemCistancheun tam piemīt imūnregulācija, pretaudzēju, pretnovecošanās un citi farmakoloģiski efekti (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo un Du, 2012). CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)bija inhibējoša iedarbība uz lipopolisaharīdu izraisītu slāpekļa oksīda (NO) veidošanos peles mikroglia šūnās (BV-2 šūnas; Nan et al., 2013). Turklāt ar feniletanoīdiem bagāts ekstrakts (ECD) noCistancheuzlaboja peļu peldēšanas spēju, samazinot muskuļu bojājumus, aizkavējot pienskābes uzkrāšanos un uzlabojot enerģijas uzglabāšanu (Cai et al., 2010). Tomēr CDP ietekme uz osteoklastu darbību un aktivitāti joprojām nav zināma.

Šajā pētījumā mēs parādījām, ka CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)inhibē RANKL izraisītu osteoklastu diferenciāciju un kaulu rezorbciju. Pamatmehānisms bija CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)uzlabo antioksidantu enzīmu ekspresiju, lai vājinātu ROS veidošanos, un pēc tam nomāc RANKL aktivētās NFAT un mitogēna aktivētās proteīnkināzes (MAPK) signālu kaskādes. Šie rezultāti liecina, ka CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)var lietot, lai ārstētu osteoporozi, ko izraisa pārmērīga osteoklastisko kaulu rezorbcija.

maca ginseng cistanche

2|MATERIĀLI UN METODES

2.1|Materiāli

CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)(tīrība > 98 procenti) tika iegādāts no Solarbio (Pekina, Ķīna) un sagatavots ar 1 mM izejas koncentrāciju fosfātu buferšķīdumā (PBS). Antivielas ir specifiskas c‐Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, fosforilētais (p)‐ERK, p‐p38, p‐JNK un ‐aktīns tika iegūts no Santa. Cruz Biotechnology (Sanhosē, Kalifornija). Antivielas pret V‐ATPāzi d2 tika ražotas, kā aprakstīts iepriekš (H. Feng et al., 2009). 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolija (MTS) un luciferāzes testu sistēma tika iegūta no Promega (Sydney, Austrālija) . Rekombinantais M-CSF tika iegādāts no R&D Systems (Mineapolisa, MN). Rekombinantais GST-rRANKL proteīns tika ekspresēts un attīrīts, kā aprakstīts iepriekš (Xu et al., 2000).

2.2|Šūnu kultūra

RAW264.7 šūnas (peļu makrofāgu šūnas) tika iegūtas no American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) un kultivētas modificētā minimālā ēteriskā barotnē (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, Austrālija), kas papildināta ar 10% liellopu augļa serumu, 2 mM. L-glutamīna, 100 V/ml penicilīna un 100 ug/ml streptomicīna (pilnīga barotne). Kaulu smadzeņu izcelsmes monocīti (BMM) tika izolēti no 6 nedēļas vecām C57BL/6J pelēm, kuras tika eitanāzētas saskaņā ar Rietumaustrālijas Universitātes Dzīvnieku ētikas komitejas apstiprinātajām procedūrām (RA/3/100/1244). Garie kauli tika sadalīti bez mīkstajiem audiem, un kaulu smadzenes tika izskalotas no augšstilba kaula un stilba kaula, kas pēc tam tika kultivētas pilnā barotnē M-CSF (50 ng/ml) klātbūtnē.

2,3|Osteoklastoģenēzes tests

BMM tika izklāti 96 bedrīšu kultivēšanas plāksnēs ar blīvumu 6 × 103 šūnas katrā iedobē un apstrādātas ar pilnīgu barotni, kas satur M-CSF (50 ng/ml) un GST-rRANKL (100 ng/ml), klātbūtnē vai dažādas CDP koncentrācijas trūkums(Cistanchedeserticolapolisaharīds). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>trīs kodoli) tika identificēti kā osteoklasti.

2,4|Citotoksicitātes testi

BMM tika iesēti 96 bedrīšu plāksnēs ar 6 × 103 šūnām katrā iedobē un atstāta uz nakti, lai pieliptu. Nākamajā dienā šūnas tika inkubētas ar dažādām CDP koncentrācijām(Cistanchedeserticolapolisaharīds). Pēc vēl 48 stundām pievienoja MTS šķīdumu (20 µl/iedobē) un inkubēja ar šūnām 2 stundas. Absorbcija pie 490 nm tika noteikta ar mikroplašu lasītāju (Multiscan Spectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2,5|Imunofluorescējoša krāsošana

BMM tika iesēti ar blīvumu 6 × 103 šūnas vienā iedobē M-CSF (50 ng/ml) klātbūtnē nakti. Pēc tam šūnas tika stimulētas ar M‐CSF un GST‐rRANKL (100 ng/ml), līdz izveidojās nobrieduši osteoklasti. Pēc tam osteoklastus apstrādāja ar dažādu CDP koncentrāciju(Cistanchedeserticolapolisaharīds)48 stundas pirms fiksēšanas ar 4% paraformaldehīdu, caurlaidības ar 0,1% Triton X‐100–PBS un bloķēšanas ar 3% liellopu seruma albumīna PBS. Sagatavotās šūnas tika inkubētas ar rodamīnu konjugētu faloidīnu 45 minūtes tumsā, lai iekrāsotu F-aktīnu. Pēc tam šūnas tika mazgātas ar PBS, kodoli tika iekrāsoti ar 4′,6-diamidino-2-fenilindolu (DAPI) un piestiprināti ar segstikliņiem konfokālajai mikroskopijai.

cistanche pieredze

2,6|Hidroksiapatīta rezorbcijas tests

Lai izmērītu osteoklastu aktivitāti, BMM (1 × 105 šūnas katrā iedobē), kas kultivētas uz sešu iedobju kolagēna pārklājuma plāksnēm (BD Biocoat; Thermo Fisher Scientific), tika stimulētas ar GST-rRANKL (100 ng/ml) un M-CSF (50 ng/ml). ml), līdz tika radīti nobrieduši osteoklasti (Zhou et al., 2016). Pēc tam šūnas viegli atdalīja no plāksnes, izmantojot šūnu disociācijas šķīdumu (Sigma-Aldrich), un vienāds skaits nobriedušu osteoklastu tika iesēts atsevišķās iedobēs ar hidroksiapatītu pārklātās 96 bedrīšu plāksnēs (Corning Osteoassay, Corning, NY). Nobrieduši osteoklasti tika inkubēti barotnē, kas satur GST-rRANKL un M-CSF ar vai bez CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)norādītajās koncentrācijās. Pēc 48 stundām puse no iedobēm tika imūnhistoķīmiski iekrāsotas TRAcP aktivitātei, kā aprakstīts iepriekš, lai novērtētu daudzkodolu šūnu skaitu vienā iedobē. Atlikušās iedobes tika balinātas 10 minūtes, lai noņemtu šūnas un ļautu izmērīt resorbētās zonas. Resorbētie apgabali tika fotografēti ar standarta gaismas mikroskopiju, un programmatūra Image J (Nacionālie veselības institūti, Bethesda, MD), tika izmantota, lai kvantitatīvi noteiktu osteoklastu resorbētās hidroksiapatīta virsmas procentuālo laukumu.

2,7|Luciferāzes reportieru testi

Lai izpētītu NFATc1 transkripcijas aktivāciju, RAW264.7 šūnas tika stabili transficētas ar NFATc1 reaģējošu luciferāzes reportiera konstrukciju (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). Transfektētās šūnas tika kultivētas 48 bedrīšu plāksnēs ar blīvumu 1,5 × 105 šūnas vienā iedobē un iepriekš apstrādātas ar dažādām CDP koncentrācijām.(Cistanchedeserticolapolisaharīds)uz 1h. Pēc pirmapstrādes šūnas tika stimulētas ar GST-rRANKL (100 ng/ml) 24 stundas, un luciferāzes aktivitāte tika mērīta, izmantojot luciferāzes reportiera testa sistēmu saskaņā ar ražotāja protokolu (Promega).

2,8|Kvantitatīvā reversās transkripcijas-polimerāzes ķēdes reakcijas (RT-PCR) analīze

Kopējā RNS tika izolēta no šūnām, izmantojot Trizol reaģentu saskaņā ar ražotāja protokolu (Thermo Fisher Scientific). Komplementārā DNS tika sintezēta, izmantojot Moloney peles leikēmijas vīrusa reverso transkriptāzi ar 1 ug RNS veidnes un oligo-dT primeriem. Specifisku secību polimerāzes ķēdes reakcijas pastiprināšana tika veikta, izmantojot šādu programmu: 94 grādi 5 minūtes, kam sekoja 30 cikli 94 grādi 40 s, 60 grādi 40 s un 72 grādi 40 s, un pēdējais pagarināšanas solis 5 minūtes 72 grādos. Detalizēta informācija par konkrētiem primeriem ir parādīta 1. tabulā. Relatīvie ziņojuma RNS līmeņi tika aprēķināti, normalizējot mājturības gēna Hmbs ekspresiju.

2,9|Western blot analīze

BMM tika kultivēti pilnā barotnē ar M-CSF sešu iedobju plāksnēs un stimulēti ar GST-rRANKL (100 ng/ml) norādītos laikus. Šūnas tika lizētas radioimunoprecipitācijas līzes buferī, un olbaltumvielas tika izšķīdinātas ar nātrija dodecilsulfāta-poliakrilamīda gēla elektroforēzi un pārnestas uz polivinilidēnfluorīda membrānām (GE Healthcare, Silverwater, Austrālija). Membrānas 1 stundu tika bloķētas 5% vājpienā un pēc tam zondētas ar dažādām specifiskām primārajām antivielām, maigi kratot nakti 4 grādu temperatūrā. Membrānas tika mazgātas un pēc tam inkubētas ar mārrutku peroksidāzes konjugētām sekundārajām antivielām. Pēc tam antivielu reaktivitāte tika noteikta ar pastiprinātu hemiluminiscences reaģentu (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) un vizualizēta ar Image-quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2.10|Intracelulārā ROS noteikšana

Intracelulārie ROS līmeņi tika noteikti, izmantojot 2′,7′′-dihlorfluoresceīna diacetāta šūnu ROS noteikšanas testa komplektu (Abcam, Melburna, Austrālija). BMM (5 × 103 šūnas katrā iedobē) tika kultivētas 96 bedrīšu plāksnēs un 72 stundas apstrādātas ar RANKL (100 ng/ml), M-CSF (50 ng/ml) un CDP. Intracelulārie ROS līmeņi tika mērīti, izmantojot 2′, 7′′-dihlorfluoresceīna diacetātu, kas ROS klātbūtnē oksidējas par fluorescējošu DCF. Šūnas tika mazgātas Henka buferšķīdumā un inkubētas tumsā 30 minūtes ar 10 µM DCFH-DA. Attēli tika iegūti, izmantojot konfokālo mikroskopiju.

2,11|Statistiskās analīzes

Visi dati atspoguļo vismaz trīs eksperimentus, kas veikti trīs eksemplāros, ja vien nav norādīts citādi. Dati ir izteikti kā vidējais ± SD. Lai noteiktu rezultātu atšķirību nozīmīgumu, tika izmantota vienvirziena dispersijas analīze, kam sekoja Stjudenta–Ņūmena–Keula post hoc testi, un p < 0,05="" tika="" uzskatīts="" par="">

3|REZULTĀTI

3.1|CDP inhibē RANKL izraisītu osteoklastoģenēzi un osteoklastu saplūšanu

Lai noteiktu, vai CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)var nomākt RANKL izraisītu osteoklastu veidošanos, mēs vispirms veicām osteoklastoģenēzes testu, izmantojot peles BMM (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). BMM tika ārstēti ar RANKL un M-CSF 5 dienas, palielinoties CDP koncentrācijām. CDP samazināja TRAcP-pozitīvo daudzkodolu šūnu skaitu, kad CDP koncentrācija(Cistanchedeserticolapolisaharīds)sasniedza 5 µM vai vairāk (1.a, b attēls). Lai novērtētu CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)toksicitāti un apstiprinām, ka šie rezultāti neatspoguļo šūnu nāvi vai skaitu, mēs veicām MTS testu. BMM tika ārstēti ar RANKL un M-CSF 48 stundas ar dažādām CDP devām(Cistanchedeserticolapolisaharīds). CDP neietekmēja BMM proliferāciju koncentrācijā 15 µM vai mazāk (1.c attēls).

Lai pārbaudītu CDP ietekmi(Cistanchedeserticolapolisaharīds)osteoklastu saplūšanas gadījumā osteoklasti tika inducēti ar RANKL un M-CSF ārstēšanu ar vai bez dažādām CDP devām(Cistanchedeserticolapolisaharīds). Osteoklasti tika iekrāsoti ar rodamīna-faloidīnu un DAPI, lai novērtētu kodolu skaitu vienā osteoklastā (2.a attēls). Pēc CDP samazinājās gan osteoklastu skaits, gan vidējais kodolu skaits uz vienu osteoklastu(Cistanchedeserticolapolisaharīds)apstrāde (5–10 µM; 2.b, c attēls). Tāpēc CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)bija inhibējoša iedarbība uz RANKL izraisītu osteoklastoģenēzi un osteoklastu saplūšanu atkarībā no devas.

3.2|CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)mazina RANKL izraisīto osteoklastisko hidroksiapatīta rezorbcijas aktivitāti

Lai noteiktu CDP ietekmi, tika veikts hidroksilapatīta rezorbcijas tests(Cistanchedeserticolapolisaharīds)par osteoklastu darbību (3.a attēls). Pēc 24 stundu inkubācijas osteoklastu skaits vienā iedobē nemainījās, savukārt hidroksilapatīta rezorbcijas laukums tika ievērojami samazināts, apstrādājot ar 5 un 10 µM CDP, salīdzinot ar kontroles grupām (3.b, c attēls). Šie rezultāti parāda, ka CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)ir spēcīga inhibējoša iedarbība gan uz osteoklastu veidošanos, gan uz osteoklastu rezorbcijas aktivitāti bez jebkādas citotoksiskas iedarbības.

3,3|CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)inhibē osteoklastu marķiera gēnu ekspresiju

Lai turpinātu pētīt CDP inhibējošo iedarbību(Cistanchedeserticolapolisaharīds)attiecībā uz osteoklastoģenēzi un osteoklastisko kaulu rezorbciju BMM tika ārstēti ar RANKL un M-CSF 5 dienas ar dažādām CDP koncentrācijām(Cistanchedeserticolapolisaharīds). Pēc tam tika veikta RT-PCR, lai noteiktu osteoklastu marķieru gēnu ekspresiju. CDP kavēja Nfatc1 ekspresiju, kas ir būtisks transkripcijas faktors osteoklastoģenēzes laikā.(Cistanchedeserticolapolisaharīds)no devas atkarīgā veidā (4.a attēls). Turklāt CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)(5 un 10 µM) samazināja ar kaulu rezorbciju saistīto gēnu, tostarp Mmp9, Ctsk un Acp5, ekspresiju (4.b–d attēls).

3,4|CDP nomāc NFATc1 aktivitāti un pakārtoto proteīna ekspresiju

Lai pārbaudītu CDP ietekmi(Cistanchedeserticolapolisaharīds)attiecībā uz RANKL izraisīto NFATc1 aktivitāti tika veikts luciferāzes reportiera tests. Ārstēšana ar CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds), koncentrācijās 5 µM un augstāk, būtiski inhibēja RANKL izraisīto NFATc1 aktivitāti (5.a attēls). Turklāt Western blot analīze parādīja, ka CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)ievērojami nomāca NFATc1 un c-Fos proteīnu ekspresiju BMM, kas tika ārstēti ar RANKL un M-CSF 3 un 5 dienas (5.b attēls). Turklāt ar osteoklastu funkciju saistīto proteīnu, piemēram, V‐ATPāzes‐d2 un CTSK, ekspresija CDP klātbūtnē tika samazināta.(Cistanchedeserticolapolisaharīds)salīdzinot ar kontroles grupām. Tomēr CDP neietekmēja RANK izteiksmi (5.b attēls).

3,5|CDP veicina antioksidantu enzīmu ekspresiju, lai novērstu ROS veidošanos RANKL izraisītas osteoklastoģenēzes laikā

Lai izpētītu CDP atkarīgās osteoklastoģenēzes inhibīcijas mehānismu, BMM tika ārstēti ar RANKL (100 ng/ml) un M-CSF (50 ng/ml) kopā ar PBS vai CDP.(Cistanchedeserticolapolisaharīds)uz 72h. Mēs pārbaudījām CDP ietekmi uz intracelulāro ROS ražošanu, ko stimulēja RANKL. Intracelulāro ROS līmeni palielināja RANKL apstrāde, ko vājināja CDP (5 un 10 µM; 6.a attēls). Ar CDP ārstēšanu no devas atkarīgā veidā tika samazināts gan ROS pozitīvo šūnu skaits, gan ROS iekrāsošanās intensitāte (6.b, c attēls). Western blot analīze parādīja, ka CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)veicināja tioredoksīna (TRX1) un glutationa reduktāzes (GSR) ekspresiju, vienlaikus nomācot inducējamās slāpekļa oksīda sintāzes (NOS2) ekspresiju BMM, kas tika ārstēti ar RANKL un M-CSF 3 dienas (6.d attēls).

Lai sīkāk izpētītu, vai CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)nomāca osteoklastu diferenciāciju, samazinot ROS veidošanos, pēc tam mēs apstrādājām BMM ar peroksīdu (10 µM), lai imitētu augsto ROS statusu šūnās. BMM inducēja RANKL un M‐CSF 3 dienas, un Western blot analīzes un RT‐PCR rezultāti parādīja, ka peroksīds veicināja NFATc1 un c‐Fos ekspresiju, salīdzinot ar kontroles grupām. Saskaņā ar rezultātiem 5. attēlā, CDP nomāca NFATc1 un c‐Fos ekspresiju.(Cistanchedeserticolapolisaharīds)savukārt peroksīds izglāba CDP inhibējošo iedarbību (6.e, f attēls). Šie dati liecināja, ka CDP nomāca NFATc1 un c-Fos ekspresiju, novēršot ROS veidošanos.

3,6|CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)nomāc MAPK ceļus RANKL izraisītas osteoklastoģenēzes laikā

Tālāk mēs pētījām CDP ietekmi(Cistanchedeserticolapolisaharīds)ārstēšana ar RANKL mediētu TRAF6 ekspresiju un MAPK ceļa aktivāciju. Pēc 2 stundu inkubācijas serumu nesaturošā vidē BMM tika stimulēti ar RANKL, ar vai bez CDP, 60 minūtes. Stimulācija ar CDP (10 µM) neietekmēja TRAF6 ekspresiju un novājināja JNK2 un ERK1/2 fosforilāciju 10 un 20 minūtēs (7. attēls). Turklāt CDP ievērojami kavēja p38 fosforilāciju(Cistanchedeserticolapolisaharīds)apstrāde 60 min, salīdzinot ar kontroles grupām (7. attēls). Šie dati atklāj, ka CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)nomāc RANKL izraisītos MAPK signalizācijas ceļus, kas atbilst tā inhibējošajai iedarbībai uz osteoklastu veidošanos un aktivitāti.

4|DISKUSIJA

Cistanche, kas pazīstams kā "tuksneša žeņšeņs", pēdējā laikā ir piesaistījis lielu uzmanību tā spējai modulēt imunitāti un darboties aizsargājoši novecošanās un oksidatīvā stresa laikā (Jia et al., 2012; Snytnikova et al., 2012). Ir pierādīts, ka fenilpropanoīdu aizvietotie glikozīdi, galvenie Cistanche aktīvie komponenti, inhibē NO aktivitāti makrofāgos (Ahn, Chae, Chin un Kim, 2017). Turklāt aCistancheekstrakts samazināja oksidatīvo stresu reperfūzētajā miokardā pēc išēmijas, un tam bija nozīmīga loma apoptotisko ceļu kavēšanā, kas noveda pie sirds aizsardzības (Yu, Li un Cao, 2016). Kā svarīga Cistanche sastāvdaļa, CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)ir dažādas farmakoloģiskās funkcijas. Mūsu pašreizējais pētījums atklāja, ka CDP nomāca RANKL aktivētu osteoklastu diferenciāciju un aktivāciju, mazinot ROS ražošanu, kā arī NFAT un MAPK aktivāciju.

Kā skābes fosfatāze TRAcP pastāv dažādās šūnās un ir daudz osteoklastos un alveolārajos makrofāgos (Snipes, Lam, Dodd, Gray un Cohen, 1986). TRAcP ir raksturīgs osteoklastu enzīms, un tā ekspresija ir cieši saistīta ar osteoklastu funkciju, ko uzskata par osteoklastu aktivitātes un kaulu rezorbcijas indikatoru (Minkin, 1982). Mūsu pētījumā CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)inhibēja TRAcP pozitīvo šūnu skaitu, norādot, ka CDP bloķēja RANKL izraisīto osteoklastoģenēzi(Cistanchedeserticolapolisaharīds). Kaulu matricas degradācija, ko veic osteoklasti, ir atkarīga no katepsīna K (CTSK) un MMP (Gruber, 2015). Šeit CDP ievērojami pazemināja osteoklastu funkcionālo gēnu, piemēram, Mmp9, Ctsk un Acp5, ekspresiju.

Osteoklastu diferenciāciju un funkciju regulē vairāki signalizācijas ceļi (Boyle, Simonet un Lacey, 2003). Pēc saistīšanās ar RANK RANKL piesaista adaptera proteīnu TRAF6, lai aktivizētu NFATc1 ekspresiju, kas ir svarīgs osteoklastu veidošanās transkripcijas faktors, kas ietekmē osteoklastu specifisko gēnu ekspresiju, tostarp TRAcP un CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). Šajā pētījumā mēs noskaidrojām, ka CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)neietekmēja RANK un TRAF6 ekspresiju osteoklastos. Tomēr CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)kavēja RANKL izraisītu NFATc1 aktivāciju BMM osteoklastoģenēzes laikā. Turklāt tika pierādīts, ka ROS, ko ražo mitohondriji elektronu piegādes procesā, veicināja osteoklastu proliferāciju un diferenciāciju un regulēja kaulu matricas degradāciju (Ha et al., 2004). Nesenā pētījumā konstatēts, ka RANKL izraisīja Bach1 kodola importu un mazināja Nrf2 mediētu antioksidantu enzīmu veidošanos, tādējādi pastiprinot intracelulāro ROS ekspresiju un osteoklastoģenēzi pelēm (Kanzaki et al., 2017). Turklāt homocisteīna izraisītā palielināta intracelulārā ROS veidošanās uzlaboja osteoklastu veidošanos un aktivitāti (Koh et al., 2006). Mūsu pētījums atklāja, ka CDP samazināja ROS uzkrāšanos osteoklastos, kavējot NOS2 ekspresiju un veicinot antioksidantu enzīmu, piemēram, TRX1 un glutationa reduktāzes, ekspresiju. Kad mēs apstrādājām BMM ar peroksīdu, lai uzlabotu intracelulāro ROS uzkrāšanos, rezultāti, ka palielināts ROS varēja uzlabot NFATc1 ekspresiju, atklāja, ka ROS atrodas augšpus NFATc1. Mēs arī atklājām, ka peroksīds izglāba CDP inhibējošo ietekmi uz NFATc1 ekspresiju. Tātad, mūsu dati liecina, ka CDP nomāc ROS uzkrāšanos, lai inhibētu NFATc1 ekspresiju, pēc tam apspiestu osteoklastu veidošanos un darbību.

ERK, JNK un p38 pieder MAPK saimei, kas arī ir iesaistīta osteoklastu diferenciācijas regulēšanā (Seger & Krebs, 1995). RANKL aktivizē MAPK ceļu, palielinot ERK, JNK un p38 fosforilāciju (Mizukami et al., 2002). Mēs parādījām, ka CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)apspieda RANKL mediēto galveno proteīnu fosforilāciju MAPK ceļā, tādējādi veicinot CDP inhibējošo ietekmi uz osteoklastu marķieru gēnu ekspresiju. Cik mums zināms, šis ir pirmais pētījums, kas parāda CDP inhibējošo iedarbību(Cistanchedeserticolapolisaharīds)par ROS ražošanu, NFAT un MAPK aktivāciju, kas atspoguļo jaunus CDP darbības mehānismus in vitro.

Rezumējot, mēs parādījām, ka CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)vājina osteoklastoģenēzi un hidroksiapatīta rezorbciju, kā arī osteoklastu marķieru gēnu, tostarp Ctsk, Mmp9 un Acp5, ekspresiju. CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)spēja nomākt RANKL mediēto ROS ražošanu, kā arī NFAT un MAPK aktivāciju (8. attēls). Kopumā mūsu rezultāti liecina, ka CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)var būt zāļu kandidāts ar osteoklastiem saistītu stāvokļu ārstēšanai, ko pavada ROS pārprodukcija.

8. ATTĒLS CDP shematiskā diagramma(Cistanchedeserticolapolisaharīds)funkcija osteoklastu diferenciācijā. CDP(Cistanchedeserticolapolisaharīds)nomāc RANKL izraisītu ROS veidošanos, kā arī NFATc1 un MAPK aktivāciju, tādējādi kavējot osteoklastoģenēzi. CDP,Cistanchedeserticolapolisaharīds; MAPK, mitogēnu aktivēta proteīnkināze; NFATc1, aktivētās T šūnas kodolfaktors; RANKL, kodolfaktora κB liganda receptoru aktivators; ROS, reaktīvās skābekļa sugas [Krāsu figūru var apskatīt vietnē wileyonlinelibrary.com]

PATEICĪBA

Šo pētījumu atbalstīja Ķīnas Dabas zinātnes fonds (81572164), Ķīnas Nacionālā galveno tehnoloģiju pētniecības un attīstības programma (2017YFC1103300), Guangxi provinces Dabaszinātņu fonds (2016GXNSFAA380295) un Guangxi Universitātes Zinātnes un tehnoloģiju pētniecības projekts. Province (KY2015YB054). To daļēji atbalsta arī Guangxi zinātniskās pētniecības un tehnoloģiju attīstības plāna projekts (GKG13349003, 1598013‐15), Rietumaustrālijas Medicīnas un veselības pētniecības infrastruktūras fonds, Arthritis Australia Foundation, Rietumaustrālijas Universitātes (UWA) pētniecības sadarbības balvas un Austrālijas Veselības un medicīnas pētījumu padome (NHMRC, Nr. 1107828 un 1027932).

INTEREŠU KONFLIKTI

Autori paziņo, ka interešu konfliktu nav

No: 'Cistanchedeserticolapolisaharīdsmazina osteoklastoģenēzi un kaulu rezorbciju, inhibējot RANKL signālu un reaktīvo skābekļa sugu veidošanos, ko veic Dezhi Song et al

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018;233:9674–9684