Cistanche Tubulosa saharozes sintāzes gēnu klonēšana, funkcionālā identifikācija, strukturālā un ekspresijas analīze Ⅱ

Rezultāti un analīze

1 Saharozes sintāzes gēnu ieguve un klonēšana Cistanche tubulosa

The amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 was used as a template[16], and sequence alignment was performed in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data, which were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>gaisa daļa.

Tāpēc divu kandidātu saharozes sintāzes gēnu ekspresijas līmeņa FPKM vērtības, kas iegūtas sākotnējā skrīningā dažādu Cistanche tubulosa daļu transkripta datos, tika normalizētas ar Z-Score un tika veikta diferenciālā analīze (1.A attēls). Rezultāti parādīja, ka CtSus gēnam bija visaugstākais ekspresijas līmenis haustorijā, un ekspresijas līmenis pazemes daļā bija augstāks nekā gaisa daļā, kas atbilst glikozīdu savienojumu uzkrāšanās modelim dažādās Cistanche tubulosa daļās, savukārt CtSus1 gēna ekspresijas līmenis haustorijā bija zems. Tāpēc, pamatojoties uz iepriekšminētajiem rezultātiem, CtSus gēns tika izvēlēts turpmākai sekvences amplifikācijai, eksogēnai ekspresijai un funkcionālai identifikācijai. Izmantojot Cistanche tubulosa cDNS kā veidni, pēc PCR amplifikācijas tika iegūts vienas joslas produkts pie ~ 2500 bp (1B attēls). PCR produkts tika iegūts no gēla un ligēts ar klonēšanas vektoru, un mērķa gēna pilna garuma kodējošais reģions tika iegūts, veicot sekvencēšanu. CtSus sekvences garums bija 2418 bp.

1. attēls Gēnu izpēte un CtSus klonēšana no C. tubulosa un tā kodētā proteīna bioinformātiskā analīze. A: CtSus un CtSus1 gēnu ekspresijas līmeņi dažādās C. tubulosana daļās, kas normalizēti kā Z-scores, pamatojoties uz to FPKM vērtībām; B: CtSus gēnu amplifikācija; M: DNS marķieris; C: CtSus proteīna konservatīvais domēns, ko paredz SMART; D: CtSus un saharozes sintāžu vairāku secību saskaņošana, kas identificēta no citiem augiem, tostarp Arabidopsis thaliana, Solanumtuberosum un Albuca bracteata. Saharozes sintēzes domēns un cukura pārneses domēns ir attiecīgi attēloti ar sarkanu un zilu lodziņu; E: CtSus un citu augu saharozes sintēžu filoģenētiskā analīze; F: CtSus heterologās ekspresijas SDS-PAGE analīze, izmantojot pCold™ I vektoru E. coli. 1. josla: proteīna marķieris; 2. josla: Supernatanta frakcija; 3. josla: nokrišņu frakcija. Sarkanā bultiņa parāda CtSus proteīnu. G: viena klona kolonijas PCR, kas satur abas divas rekombinantās plazmīdas. M: DNS marķieris; 1: pET-28a-UGT71BD1; 2: pCold™ I-CtSus

HETIAN DICHEN CISTANCHE CULTIVES BAESES SADARBOJAS AR PEKINGAS UNIVERSITĀTI

Wecistanche atbalsta dienests - lielākā cistanche eksportētāja Ķīnā:

E-pasts:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel.:+86 15292862950

KLIKŠĶINIET, LAI LAIK SĪKĀK INFORMĀCIJAS

2 CtSus gēna un tā kodētā proteīna bioinformātikas analīze

2.1. CtSus fizikāli ķīmisko īpašību analīze un transmembrānas domēna struktūras prognozēšana

CtSus kodētā proteīna fizikāli ķīmiskās īpašības tika analizētas, izmantojot ProtParam tiešsaistes programmatūru. Proteīns satur 805 aminoskābes, ar molekulāro formulu C4189H6548N1104O1187S28 un relatīvo molekulmasu 92266,44; teorētiskais izoelektriskais punkts ir 6.00; nestabilitātes koeficients II ir 35,45, kas ir stabils proteīns; kopējā vidējā hidrofilitāte (GRAVY) ir –0,187, kas ir hidrofils proteīns. MHMM 2.0 tika izmantots, lai prognozētu saharozes sintāzes CtSus transmembrānu domēnu, un rezultāti parādīja, ka šī gēna kodētajam proteīnam nav transmembrānas domēna.

HETIAN DICHEN CISTANCHE CULTIVES BAESES SADARBOJAS AR PEKINGAS UNIVERSITĀTI

2.2. CtSus konservatīvās struktūras un secību saskaņošanas prognozēšana

Tiešsaistes programmatūra SMART tika izmantota, lai prognozētu CtSus proteīna konservatīvos domēnus (1.C attēls). Proteīns satur divus konservatīvus domēnus. N-gals (aminoskābes no 8. līdz 553.) ir saharozes sintāzes domēns, kas var katalizēt UDP un saharozes atgriezenisko reakciju, veidojot UDP-glikozi un D-fruktozi; C-gals (aminoskābes no 557. līdz 739.) pieder pie glikoziltransferāzes domēna (1. D attēls). DNAMAN programmatūra tika izmantota, lai saskaņotu CtSus proteīna secību ar saharozes sintāzes aminoskābju secību NCBI datu bāzē (2. tabula). Rezultāti parādīja, ka CtSus aminoskābju secībai bija liela līdzība ar saharozes sintāzes sekvencēm no citiem augiem. Vislielākā līdzība starp CtSus un saharozes sintāzes secību no sezama (Sesamum indicum) bija 94,78%, un līdzība ar saharozes sintāzes sekvencēm no citiem augiem arī bija virs 65%, norādot, ka saharozes sintāzes no augiem ir augsta sekvences pakāpe. saglabāšanu.

2. tabula Aminoskābju secību līdzības starp CtSus un saharozes sintēzēm, kas identificētas no citiem augiem

2.3. Filoģenētiskā analīze

Filoģenētiskais koks, ko konstruēja MEGA programmatūra, tika izmantots, lai analizētu filoģenētiskās attiecības starp saharozes sintāzes CtSus no Cistanche tubulosa un saharozes sintēzēm no citiem augiem. Rezultāti ir parādīti 1E attēlā. Saharozes sintāzes no augiem uzrāda atšķirīgas evolucionāras atzaras divdīgļos (I un II reģions) un viendīgļaudzēs (III reģions). CtSus atrodas divdīgļdīgļu zarā, un visas ar CtSus cieši saistītās sekvences ir no Lamiaceae augiem (Cistanche tubulosa ir Lamiaceae Orobanchaceae augs), savukārt otru zaru galvenokārt veido Solanales augi, kas vēl vairāk norāda uz augsto saglabāšanos un homoloģiju. augu izcelsmes saharozes sintāzes gēni augu evolūcijā tādā pašā secībā. Tostarp saharozes sintāzes PrSus (AEN79500.1) no Phelipanche ramosa no Orobanchaceae auga ir vistuvāk CtSus.

3 CtSus eksogēnā ekspresijas un aktivitātes analīze

3.1. CtSus gēna eksogēnā ekspresija

Ar sekvencēšanu pārbaudītās pET-28a-CtSus, pET-24b-CtSus un pCold™ I-CtSus plazmīdas tika pārnestas uz ekspresiju kompetento E. coli Transetta (DE3), un pozitīvie kloni tika pārbaudīti. ar koloniju PCR sekvences pārbaudei. Iegūtie rekombinantie ekspresijas celmi tika inducēti ar IPTG zemu temperatūru proteīna ekspresijai, un baktērijas tika savāktas, centrifugējot. Lizes buferis tika pievienots, lai salauztu baktērijas, lai iegūtu supernatantu un nogulsnes, un noteikšanai tika veikta SDS-PAGE. Rezultāti parādīja, ka tad, kad pET-28a un pET-24b tika izmantoti kā ekspresijas vektori, CtSus netika ekspresēts E. coli, savukārt, kad pCold™ I tika izmantots kā ekspresijas vektors, skaidrs CtSus. rekombinantā proteīna josla tika atklāta ~ 100 kDa reģionā, kas atbilda tās teorētiski prognozētajai relatīvajai molekulmasai 92, 2 kDa (1. attēls F).

HETIAN DICHEN CISTANCHE CULTIVES BAESES SADARBOJAS AR PEKINGAS UNIVERSITĀTI

3.2. Veselas šūnas transformācija

Lai provizoriski pārbaudītu CtSus katalītisko funkciju, tika izveidots CtSus un glikoziltransferāzes gēna UGT71BD1 koekspresijas celms. UGT71BD1 tika klonēts un identificēts no Cistanche tubulosa, un tā ir UDP-glikoziltransferāze, kas var plaši pieņemt aromātiskus savienojumus, piemēram, feniletanoīdu glikozīdus, dažāda veida flavonoīdus, stilbēnu un kumarīnu kā receptorus un katalizēt substrāta grupas glikozilācijas reakciju, izmantojot UDP-substrātu grupas fenola hidroksglikozi. kā cukura donors[18]. CtSus ieviešana teorētiski var nodrošināt pietiekami daudz glikozildonora UDP-glikozes UGT71BD1 katalizētajai glikozilācijas reakcijai, tādējādi veicinot reakcijas līdzsvaru, lai virzītos uz glikozilācijas produktu veidošanos, tādējādi palielinot glikozilācijas produktu iznākumu. pCold™ I-CtSus plazmīda un pET-28a-UGT71BD1 plazmīda vienlaikus tika pārveidotas par ekspresiju kompetento E. coli Transetta (DE3). Atsevišķi kloni, kas satur abas rekombinantās plazmīdas, tika pārbaudīti ar koloniju PCR, un pozitīvi rekombinantie ekspresijas celmi tika iegūti, veicot sekvences pārbaudi (1G attēls). Duālā gēnu koekspresija tika ierosināta in vitro, un pET-28aUGT71BD1 viena gēna ekspresijas celms tika izmantots kā kontroles grupa. CtSus aktivitāte, katalizējot UDP-glikozes donora veidošanos, tika provizoriski pārbaudīta ar visu šūnu transformāciju. HPLC un augstas izšķirtspējas masas spektrometrijas rezultāti parādīja, ka, veicot visu šūnu transformācijas reakciju ar eskuletīnu 1 un resveratrolu 2 kā substrātiem, pēc 24 h transformācijas tika konstatēta acīmredzamu glikozilācijas produktu rašanās, kā parādīts 2.

2. attēls 1. vai 2. substrāta veselu šūnu biotransformācija ar rekombinanto celmu, kas satur attiecīgi UGT71BD1 vai rekombinanto celmu, kas satur UGT71BD1 savienojumu ar CtSus, attiecīgi. A: 1. substrāta visu šūnu biotransformācijas HPLC hromatogrammas. Detekcijas viļņa garums bija 360 nm; B: produkta 1a HRESI-MS un MS2 spektri; C: 2. substrāta visu šūnu biotransformācijas HPLC hromatogrammas; Noteikšanas viļņa garums bija 330 nm. D: produktu 2a un 2b HRESI-MS spektri

Ja par substrātu tika izmantots 1 (m/z 179.{2}} [M+H]+, molekulārā formula C9H6O4), produkta hromatogrāfiskais maksimums 1a (m/z 41.{10}} [M+H] +, prognozētā molekulārā formula C15H16O9) tika konstatēta 5,39 minūtēs, kas atbilda substrāta un kontroles produkta UV absorbcijai. Tajā pašā laikā fragmenta maksimums m/z 179.{19}} [M+H]+ tika konstatēts 1a MS2 spektrā, kas tika iegūts, 1a zaudējot glikozes molekulu (162 Da), norādot ka 1a bija substrāta 1 produkts, kas savienots ar glikozes molekulu. Konversijas līmenis tika aprēķināts, integrējot pīķa laukumu. Tika konstatēts, ka UGT71BD1 veselu šūnu konversijas ātrums, kas katalizē substrātu 1, lai radītu glikozilētu produktu 1a, bija 71,87%, savukārt CtSus pievienošana palielināja reakcijas konversijas ātrumu līdz 95,84%, kas bija 1,3 reizes vairāk nekā kontroles grupā. Ja substrāts bija savienojums 2 (m/z 227.072 5 [MH]-, molekulārā formula C14H12O3), produkta hromatogrāfijas maksimumi 2a (m/z 389.123 4 [MH]-, paredzamā molekulārā vērtība formula C20H22O8) un 2b (m/z 575.175 9 [M+Na]+, paredzamā molekulārā formula 26H32O13) tika noteiktas attiecīgi 10,32 un 6,52 minūtēs, kas atbilda substrāta raksturīgajai UV absorbcijai un kontroles produkts. Fragmenta maksimums tika konstatēts pie 227.071 3 [MH]-, kas radās, zaudējot vienu glikozes molekulu (162 Da), norādot, ka 2a bija 2. substrāta produkts, kas savienots ar vienu glikozes molekulu. Salīdzinot ar literatūras datiem [18] un masu spektrometrijas prognozēšanas informāciju, tika noteikts, ka produkts 2b ir substrāta 2 produkts, kas savienots ar divām glikozes molekulām. Konversijas kurss tika aprēķināts, izmantojot integrēto pīķa laukumu. Tika konstatēts, ka CtSus pievienošana varētu palielināt substrāta 2 glikozilācijas reakcijas konversijas ātrumu no 64,01% līdz 78,51%, tostarp monosaharīda produkta 2a iznākums palielinājās no 45,09% līdz 63,58%, un disaharīda produkta 2b iznākums. mainījās no 18,92% uz 14,93%.

3

HETIAN DICHEN CISTANCHE CULTIVES BAESES SADARBOJAS AR PEKINGAS UNIVERSITĀTI

3.3 CtSus

Rekombinanto proteīnu attīrīšana un in vitro enzīmu katalītiskās aktivitātes identifikācija Visu šūnu konversijas eksperimenta rezultāti liecināja, ka CtSus katalizē aktīvās glikozes donora UDP-glikozes veidošanos. Lai vēl vairāk pārbaudītu katalītisko aktivitāti, izmantojot in vitro fermentatīvo katalīzi, CtSus gēna saplūšanas proteīns pCold™ ekspresijas sistēmā tika atdalīts un attīrīts ar afinitātes hromatogrāfiju. Rezultāti parādīja, ka tad, kad pCold™ I tika izmantots kā ekspresijas vektors, rekombinantais proteīns tika ekspresēts lielos daudzumos, bet galvenokārt nogulsnēs. Kad pCold™ TF tika izmantots kā ekspresijas vektors, CtSus gēns tika ekspresēts lielos daudzumos E. coli (3.A attēls). Sapludinātais proteīns tika attīrīts ar HisTrap FF afinitātes hromatogrāfiju in vitro fermentatīvai reakcijai. Rezultāti ir parādīti 3.B attēlā. Kad saharoze un UDP tika izmantoti kā substrāti, salīdzinot ar negatīvās kontroles grupu, jauns produkta maksimums tika konstatēts 10, 32 minūtēs. Tās aiztures laiks un UV absorbcija atbilda UDP-glikozei. Salīdzinot ar standartu, tika pierādīts, ka produkts ir UDP-glikoze. Tomēr, tā kā sapludinātais proteīns, ko ekspresē pCold™ TF ekspresijas vektors, satur lielu trigerfaktorā šķīstošu marķējumu (taga proteīna izmērs ir 48 kDa), tam būs liela ietekme uz proteīna katalītisko aktivitāti. Tāpēc kodolsintēzes proteīna marķējumu tālāk sagrieza Xa faktora enzīms, un CtSus proteīns bez eksogēniem marķējumiem tika attīrīts (3.A attēls). Proteīns tika pakļauts in vitro enzīmu katalīzei, un rezultāti parādīja, ka UDP-glikozes iznākums palielinājās no 3,53% līdz 10,66% (3.B attēls). Iepriekš minētie rezultāti apstiprināja CtSus aktivitāti UDP-glikozes ražošanas katalizēšanā, izmantojot in vitro enzīmu katalīzi, kā arī parādīja, ka lielas afinitātes marķējuma klātbūtne veicina CtSus šķīstošo ekspresiju, taču tā arī būtiski ietekmēs fermenta katalītiskā aktivitāte.

3. attēls CtSus heterologā ekspresija un funkcionālā identifikācija. A: CtSus proteīnu SDS-PAGE analīze. 1. josla: proteīna marķieris; 2. josla: rekombinantā CtSus ar trigera faktoru; 3. josla: Trigger13factor tag šķelšana, izmantojot faktora Xa proteāzi, lai iegūtu CtSus proteīnu, kas apzīmēts ar sarkano bultiņu. B: Invitro fermentatīvie testi, izmantojot saplūsmes proteīnu un bezfaktora CtSus proteīnus, lai katalizētu UDP-glikozes sintēzi attiecīgi saharozes un UDP klātbūtnē ar atsauces standartu UDP-glikozi. Tādos pašos apstākļos kā kontroles grupa tika izmantota vārīta olbaltumviela. Noteikšanas viļņa garums bija 260 nm