Cistanche Tubulosa ekstraktu ietekme uz vīriešu reproduktīvo funkciju streptozotocīna-nikotīnamīda izraisītām diabēta žurkām -Ⅰ

1. Ievads

Cukura diabēts (DM) ir stāvoklis, kurā palielināsglikozes līmenisaizkuņģa dziedzera nepietiekama insulīna ražošanas efektivitātes dēļ vai organisma nespēja to efektīvi izmantot. Saskaņā ar PVO datiem, cilvēku ar cukura diabētu skaits pieauga no 108 miljoniem 1980. gadā līdz 422 miljoniem 2014. gadā [1]. Ir četras galvenās kategorijas: pirmsdiabēts (posms pirms diabēta), 1. tips (kad aizkuņģa dziedzeris nespēj ražot insulīnu), 2. tips (organisms nespēj izmantot insulīnu) un gestācijas diabēts (kas rodas grūtniecības laikā). Oksidatīvais stress rodas nelīdzsvarotības dēļ starp reaktīvo skābekļa sugu (ROS) un antioksidantu ražošanu [2], kas galu galā noved pie diabēta stāvokļa. Cukura diabēta komplikācijas ir nieru mazspēja, nervu bojājumi, aklums, insults, sirdslēkme, augļa nāve un neauglība. [1]. Pētījumi liecina, ka vīriešiem ar cukura diabētu tika būtiski bojāti spermas kodoli, dezoksiribonukleīnskābe (DNS) un mitohondriji [3]. Oksidatīvais stress spermas transportēšanas laikā mainīs vīriešu reproduktīvās sistēmas procesu [4,5].

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA SEKSUĀLĀS FUNKCIJAS UZLABOŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Spermatoģenēzes procesu kontrolē hipotalāma–hipofīzes–gonādu (HPG) ass. Gonadotropīnu atbrīvojošais hormons (GnRH), ko ražo hipotalāms, stimulē luteinizējošā hormona (LH) un folikulus stimulējošā hormona (FSH) ražošanu. Leidiga šūnas atrodas blakus sēklu kanāliņiem unražot testosteronuLH kontrolē. FSH izraisa antigēnu saistoša proteīna (ABP) ražošanu, kas palīdz izvadīt vīrišķo hormonu. Tādējādi neauglība un citas problēmas galvenokārt rodas traucējumu dēļ, kas rodas HPG asī. Streptozotocīna-nikotinamīda kombinācijas ievadīšana eksperimentālām žurkām izraisa diabētu. Streptozotocīns ir ķīmisks savienojums, kas ir toksisks insulīnu ražojošām aizkuņģa dziedzera šūnām, un nikotīnamīds ir ūdenī šķīstošs vitamīns, kas aizsargā šūnas no pilnīgas bojājuma [6].

Cistanche tubulosa ir tuksneša augu suga, kas pazīstama arī kā "Rou Cong-Rong" [7]. Tas ir nehlorofilisks parazitārs augs, kas aug galvenokārt uz Calotropis procera koka saknēm un ir plaši izplatīts Gansu, Cjinhajas, Sjiņdzjanas, Mongolijas, Irānas un Indijas sausajā zemē. Cistanche tubulosa parastais nosaukums ir "Tuksneša hiacinte". Tas ir plaši pieņemts ķīniešu tradicionālajā medicīnā, un tam ir dots nosaukums "Tuksneša žeņšeņs". To plaši izmanto medicīnas jomā, lai ārstētu slimīgu leikoreju, bagātīgu metrorāģiju, hroniskas nieru slimības, aizcietējumus, impotenci un neauglību. Ķīmiskās sastāvdaļasCistanche tubulosa sastāv no negaistošiem feniletanoīdu glikozīdiem(PHG), iridoīdi, lignāni, gaistošās eļļas, alditoli, oligosaharīdi un polisaharīdi [8]. Pētījumi liecina, kaehinakozīdsno šī auga aizsargā bojātos fibroblastus, regulējot ROS līmeni [9]. Šis savienojums rada antioksidantu, vazorelaksācijas un pretiekaisuma aktivitātes, kā arī neiroprotekciju un osteoporozes profilaksi [10,11].

Šī pētījuma mērķis bija izpētīt ietekmiCistanche tubulosa ekstraktskas satur ECH par streptozotocīna-nikotinamīda izraisītas diabēta žurkas reproduktīvo disfunkciju.

2. Materiāli un metodes

2.1. Materiāli

ECH un CTE iegādājās no Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taivāna). Uzlabotie glikācijas gala produkti (AGE) tika iegādāti no Biovision (Sanfrancisko, CA, ASV). LC-540 un TM3 šūnu līnijas tika iegādātas no Pārtikas rūpniecības pētniecības un attīstības institūta (Hsinču, Taivāna). Piecas nedēļas vecas Sprague-Dawley (SD) žurku tēviņi tika iegādāti no Nacionālā laboratorijas dzīvnieku centra (Taipeja, Taivāna). Feed Lab Diet® iegādājās no PMI Nutrition International, Inc. (Taipeja, Taivāna). 2,2-difenil-1-pikrilhidrazils (DPPH) tika iegūts no Sigma (St. Louis, MO, ASV). Metanols un 4-(2-hidroksietil)-1-piperazīnētānsulfonskābe (HEPES) arī tika iegādāti no Sigma. Dulbecco modificētā Eagle barotne/F12 un tripsīns-EDTA tika iegūti no GIBCO (Ņujorka, NY, ASV). 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolija bromīds (MTT), dihlordihidrofluoresceīna diacetāts (DCFH-DA), dimetilsulfoksīds (DMSO) un nitrozilais tetrazolijs (NBT) tika iegādāti no Sigma. Glikozes enzīmu komplekti tika iegūti no Kyokutoseiyaku, Tokija, Japāna. Insulīna ELISA komplekti tika iegādāti no Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Upsala, Zviedrija). T-PER audu proteīna ekstrakcijas reaģents tika iegūts no Thermo Scientific (Čikāga, IL, ASV). Pretcilvēka / peles / žurkas kodolfaktora-kappa B NF-κB poliklonālās antivielas tika iegādātas no Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ASV. Anti-Peles/Žurkas receptori uzlaboto glikācijas galaproduktu (RAGE) poliklonālajām antivielām, anti-cilvēka/peles/žurkas StAR poliklonālajām antivielām un anti-cilvēka/peles/žurkas citohroma P450 17A1 monoklonālajām antivielām tika iegādātas no Gene. Teksa (Irvina, Kalifornija, ASV). Anti-cilvēka/peles/žurkas CYP11A1 poliklonālās antivielas tika iegūtas no Cell Signaling Technology (Beverly, PA, ASV). Easy-Blue reaģents tika iegādāts no Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, ASV). Agaroze un DNS marķieris 100 bp tika iegūti no Promega, Corporation (Madison, WI, ASV). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit tika iegādāts no QIAGEN, Hilden, Vācija.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA SEKSUĀLĀS FUNKCIJAS UZLABOŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.2. Metodes

2.2.1. In vitro analīze

LC{{0}} un TM3 šūnu kultūra: LC-540 šūnu līnijas tika kultivētas 37 ◦C temperatūrā Ērla līdzsvarotā sāls šķīduma (EBSS) barotnē, kas papildināta ar nātrija bikarbonātu (1,5 g/l), L-glutamīns (2 mM), neaizvietojamās aminoskābes (0,1 mM), nātrija piruvāts (10 mM) un liellopu augļa serums (FBS) (10%) 5% CO2 inkubators (CO2 inkubators, Napco 5410, Taivāna). TM3 šūnu līnija tika kultivēta Dulbecco modificētajā Eagle barotnē (DMEM), kas papildināta ar glikozi (4,5 g/l), nātrija piruvātu (0,5 mM), L-glutamīnu (2,5 mM), nātrija bikarbonātu (1,2 g/l), {{ 28}}(2-hidroksietil)-1-piperazīnsulfonskābe (HEPES, 15 mM) un teļa augļa serums (FCS, 10%) vai zirga serums (5%) 37 ◦C temperatūrā 5% CO2 inkubators.

Šūnu dzīvotspējas noteikšanaehinakozīds (ECH): 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolija bromīda (MTT) reaģents tika izmantots šūnu dzīvotspējas testā. Šūnu koncentrācija tika noregulēta uz 2 × 105 šūnām/ml 96-iedobes plāksnē. Pēc tam pievienoja 20 µL ECH (atšķaidīts ar 2% barotnes) un inkubēja 24 stundas 37 ◦C temperatūrā 5% CO2 inkubatorā. Vēlāk pievienoja 100 µL MTT reaģenta un inkubēja 4 stundas 37 ◦C temperatūrā tumšos apstākļos. Absorbcija tika mērīta pie 570 nm (ELISA lasītājs, Dynatech MR5000, Kloten, Šveice).

Šūnu relatīvā dzīvotspēja (%)=[(Paraugs pie 570 nm – tukšais pie 570 nm)]/[(Akontrole pie 570 - Tukšais pie 570)] × 100.

Nitroblue Tetrazolium (NBT) samazināšanas tests un 2,2-difenil-1-pikrilhidrazila (DPPH) tests: šūnu skaits tika pielāgots 1 × 1{{10}}6 šūnām/ ml. Pēc tam tika pievienoti 50 mg/mL ECH, resveratrola (RES) un uzlabotās glikācijas galaprodukti (AGE) (kontrole) un kopā kultivēti 18 stundas 37 ◦C temperatūrā. Pēc tam pievienoja 0,3 ml NBT šķīduma (0,1 mg/ml NBT, 5% FBS un 3% dimetilsulfoksīda (DMSO), kas izšķīdināts 10 ml DMEM) un inkubēja 37 ◦C temperatūrā 5% CO2 1 stundu. Pēc centrifugēšanas (pie 800 × g 3 minūtes) supernatants tika noņemts, pievienoja 200 µL DMSO un 5 minūtes krata ultraskaņas oscilatorā (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Taivāna). Absorbcija tika mērīta pie 630 nm. DPPH radikāļu testam par standartu tika izmantots Trolox (95% spirtā). Pēc tam 75 µL 0, 5 mM DPPH šķīduma sajauca ar 25 µL paraugu un ļāva reaģēt istabas temperatūrā tumšā vietā 30 minūtes. Maisījums tika sakrata un absorbcija tika mērīta pie 517 nm.

Reaktīvo skābekļa sugu (ROS) satura analīze: šūnu skaits tika noregulēts uz 2 × 105 šūnām/ml 12-iedobes plāksnē, kas satur 2% FBS. Pēc tam plāksnei pievienoja 50 µL/mL ECH, RES un AGE un inkubēja 37 ◦ C temperatūrā 24 stundas. Pēc 24 stundām tika pievienots 20 70 -dihlorfluoresceīna diacetāts (DCFH-DA) un inkubēts 30 minūtes 37 ◦C temperatūrā. Pēc centrifugēšanas (400 × g, 5 minūtes) supernatants tika noņemts un šūnas divas reizes nomazgāja ar fosfātu buferšķīdumu (PBS). Pēc tam šūnas tika suspendētas 1 ml PBS un ROS līmenis tika noteikts, izmantojot plūsmas citometru (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, ASV).

Olbaltumvielu identifikācija un kvantitatīvā analīze: olbaltumvielas tika ekstrahētas, izmantojot proteīna ekstrakcijas reaģentu (T-PER). Šūnu blīvums tika noregulēts uz 2 × 105 šūnām/ml 12-iedobes plāksnē un 50 µL/mL ECH, RES un progresīvā glikācijas galaprodukta (RAGE) antagonista receptora, un tika pievienoti un inkubēti AGE. 37 ◦C temperatūrā 5% CO2 inkubatorā 24 stundas. Pēc tam tika pievienoti 400 µL T-PER, nokasīti no šūnām un centrifugēti pie 125,000 × g 20 minūtes (4 ◦C). Supernatants tika savākts un uzglabāts -80 ◦ C temperatūrā (-80 ◦ C saldētava, Nuaire, Plimuta, MN, ASV) turpmākai analīzei. Olbaltumvielu kvantitatīvai noteikšanai tika izmantots bicinhonīnskābes (BCA) komplekts. Pēc tam 8-iedobju plāksnēm pievienoja 10 µL standarta šūnu šķīduma un 200 µL BCA reaģenta un 30 minūtes inkubēja 37 ◦ C temperatūrā 5% CO2 inkubatorā. Absorbcija tika mērīta pie 562 nm. Olbaltumvielu identifikācijas analīze tika veikta ar nātrija dodecilsulfāta (SDS)-poliakrilamīda gēla (SDS-PAGE) elektroforēzi. Paraugus sagatavoja, pievienojot proteīna lizātu proteīna iekraušanas buferim, un tika veikta Western blot analīze, lai noteiktu specifiskos proteīnus.

2.2.2. In vivo analīze

Dzīvnieku modeļa dizains: sešdesmit {{0}}nedēļu vecas Sprague–Dawley (SD) žurkas tika iegādātas no Nacionālā laboratorijas dzīvnieku centra (Taipeja, Taivāna). Katra žurka tika izmitināta atsevišķi dezinfekcijas nerūsējošā tērauda būros kontrolētā temperatūrā (23 ± 1 ◦C) un mitrumā (40–60%) ar 12 stundu gaismas/12 stundu tumšuma ciklu. Pārtika un ūdens tika nodrošināti ad libitum. Katra žurka tika pieradināta pirmajā nedēļā un kā galvenā diēta tika dota laboratorijas grauzēju diētai 5001. Visas procedūras atbilst Taivānas Nacionālās okeāna universitātes Taivānas Institucionālās dzīvnieku kopšanas un lietošanas komitejas (IACUC apstiprinājuma Nr. 101026) standartam. Pēc pieradināšanas žurkas tika sadalītas divās grupās: kontroles grupā (Con), kas tika barota ar laboratorijas diētu 5001, un diabēta grupā, kas tika barota ar diētu ar augstu tauku saturu (HFD, 40%) visa eksperimenta laikā. Pēc 4 nedēļu ilgas barošanas ar HFD diabēta grupas žurkām tika injicēts streptozotocīns (65 mg / kg) (STZ), lai izraisītu cukura diabētu (DM). 15 minūšu laikā pēc STZ injicēšanas tika injicēts nikotīnamīds (230 mg/kg ķermeņa svara). Nedēļu pēc injekcijas tika veikts perorālais glikozes tolerances tests (OGTT), lai noteiktu veiksmīgu cukura diabēta (DM) ierosināšanu. Pēc tam dzīvnieki tika sadalīti sešās grupās: kontrole (barota ar laboratorijas diētu 5001); DM grupa (DM + 45% HFD); DMR grupa (DM + rosiglitazons: 0,571 mg/kg ķermeņa masas) + 45% HFD; DME1 grupa (DM + CTE: 80 mg/kg ķermeņa masas) + 45% HFD; DME2 grupa (DM + CTE: 160 mg/kg ķermeņa masas) + 45% HFD; un DME4 grupa (DM + CTE: 320 mg/kg ķermeņa masas) + 45% HFD. Rosiglitazons (RSG) tika ņemts par pozitīvo kontroli. Trīs CTE devas (80, 160 un 320 mg/kg) tika izmantotas saskaņā ar Taivānas Pārtikas un zāļu pārvaldes (TFDA) veselīgas pārtikas funkcionālās novērtēšanas vadlīnijām. Ārstēšana tika veikta līdz eksperimenta beigām. Visas eksperimentālās žurkas tika nogalinātas pēc 6 nedēļām. No žurkām savāktās asinis tika centrifugētas ar ātrumu 3000 apgr./min 15 minūtes 4 ◦C temperatūrā. Supernatants tika pārbaudīts, lai veiktu šādu analīzi:

Kopējā glikozes, triglicerīdu un holesterīna noteikšana: glikozes noteikšana tika veikta, izmantojot glikozes enzīmu komplektus. Pēc tam reaģentiem pievienoja 20 µL asins plazmas paraugu un 5 minūtes turēja 37 ◦C temperatūrā. Kopējo triglicerīdu un kopējā holesterīna koncentrācija tika noteikta, izmantojot triglicerīdu un holesterīna enzīmu komplektus. Pēc tam reaģentiem pievienoja 10 µL asins plazmas un eksperimentu veica saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Absorbcija tika mērīta pie 510 nm.

Plazmas kopējā glikoze/triglicerīds/holesterīns (mg/dL)=(Paraugs — ABlank)/(Astandarta — ABlank) × 200.

Paraugs: Asins paraugu absorbcija, Ablak: Absorbcijas vērtība komplektiem bez parauga, Astandarts: standarta reaģenta absorbcijas vērtība, 200: standarta reaģenti ar koncentrāciju 200 mg/dL.

Insulīna, leptīna un homeostatiskā modeļa novērtēšana – insulīna rezistences (HOMA-IR) noteikšana:Insulīna līmenis tika noteikts ar insulīna ELISA komplektiem. Šeit, 25µL asins plazmas tika pievienotsreaģenti, un absorbcija tika mērīta pie 450 nm. Kopējais leptīna saturs tika noteikts, izmantojot aleptīna enzīmu imunometriskās analīzes komplekts.Tad 100µTika analizēts L plazmas un absorbcijatika mērīts pie 450 nm, izmantojot ELISA lasītāju. Viss eksperiments tika veikts saskaņā arražotāja norādījumiem. HOMA-IR vērtība tika noteikta no homeostāzes modeļanovērtējuma vienādojums=Insulīna koncentrācija plazmā tukšā dūšā (mg/ml)× plazmas glikoze tukšā dūšākoncentrācijas (mmol/L)/22,5.

Plazmas lipīdu peroksidācija: šeit {{0}},5 ml asins plazmas tika sajaukti ar 1 ml reaģenta (15%, w/v trihloretiķskābe 0,25 N sālsskābē (HCl) ) un 0,375%, w/v tiobarbitūrskābi 0,25 N HCl) un ievieto ūdens vannā (Water Bath, BUCHI 461, Cīrihe, Šveice) 100 ◦C 15 minūtes. Pēc atdzesēšanas pievienoja 1 ml n-butanola, enerģiski sakrata un centrifugēja ar ātrumu 1500 × g 10 minūtes. Supernatants tika savākts un absorbcija tika mērīta pie 532 nm [12].

Malondialdehīda (MDA) koncentrācija (nM/mL)=[(Paraugs pie 532 nm – Tukšais paraugs pie 532 nm)/ (Standarts pie 532 nm – Tukšais paraugs pie 532 nm)] × 5.

standarts pie 532 nm – tukšais pie 532 nm)] × 5. Testosterona un luteinizējošā hormona (LH) līmeņa noteikšana plazmā: Testosterona ELISA komplektu izmantoja, lai mērītu testosterona līmeni asins plazmā. Lai noteiktu LH koncentrāciju, tika izmantots RIA komplekts. Pēc tam tika pievienoti 50 µL plazmas, un aprēķini tika balstīti uz hormona LH-RP-3 (standarta) koncentrāciju. Turpmākās darbības tika veiktas saskaņā ar ražotāja norādījumiem.

Audzēja nekrozes faktora (TNF) un interleikīna-6 (IL-6) koncentrācijas noteikšana: notvertā antiviela tika atšķaidīta 250 reizes pārklājuma buferšķīdumā, pievienota 96-. iedobes plāksni (100 µL/iedobē) un uz nakti tur 4 ◦C temperatūrā. Supernatants tika aspirēts un piecas reizes mazgāts ar mazgāšanas buferi (1 reizi PBS, 0, 05% Tween 20). Pēc inkubācijas (1 h) ar 200 µg testa šķīdinātāja šūnas 5 reizes nomazgāja ar mazgāšanas buferi un katrai iedobei pievienoja 100 µL TNF standartšķīduma vai testa paraugus un inkubēja 2 stundas. Pēc mazgāšanas pievienoja 100 µL IL-6-konstatēto antivielu un inkubēja 1 stundu istabas temperatūrā. Supernatants tika aspirēts un mazgāts 5 reizes. Pēc tam pievienoja 480 µL enzīma avidīna-mārrutku peroksidāzes (HRP) un inkubēja 30 minūtes istabas temperatūrā. Supernatants tika aspirēts un piecas reizes mazgāts ar mazgāšanas buferšķīdumu. Pēc tam pievienoja 100 µL substrāta šķīduma un inkubēja 15 minūtes istabas temperatūrā. Vēlāk katrai iedobei pievienoja 50 µL apturēšanas šķīduma (1 M fosforskābe) un izmērīja absorbciju pie 450 nm.

NATURAL CISTACHHE TUBULOSA SEKSUĀLĀS FUNKCIJAS LABOŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Spermas un sēklinieku parametru analīze

Spermas paraugu ņemšana: Spermas paraugu ņemšana tika veikta saskaņā ar metodi, kas iepriekš aprakstīta [13]. Spermas tika savāktas no supernatanta un izmantotas turpmākai analīzei.

Spermas skaits, spermatozoīdu kustīgums un patoloģiskas spermas: Spermas skaits tika aprēķināts, izmantojot hemocitometru un tripāna zilo šķīdumu. Pēc tam 100 µL spermas šķidruma tika sajaukti ar tripānzilo šķīdumu un, izmantojot hemocitometru un mikroskopu, tika aprēķināts spermatozoīdu skaits, kustīgums un patoloģiskas spermas [14].

Spermas un sēklinieku nitrozilā tetrazolija NBT samazināšana un lipīdu peroksidācija: lipīdu peroksidācija un NBT reducēšana tika analizēta saskaņā ar to pašu plazmas analīzes procedūru.

Superoksīda dismutāzes (SOD) un katalāzes aktivitātes noteikšana: Superoksīda dismutāzes (SOD) aktivitāte tika analizēta, izmantojot RANSEL komplektu. Šeit {{0}}.05 ml sēklinieku homogenātu tika pievienoti 1,7 ml reakcijas šķīduma (0,05 mM ksantīna, 0,025 mM 2-({ {9}}jodfenils)- 3-(4-nitrofenols)-5-feniltetrazolija hlorīds (INT)). Pēc sajaukšanas pievienoja 0,25 ml ksantīna oksidāzes (80 U/L) un reaģēja istabas temperatūrā 30 sekundes. Absorbcija tika mērīta pie 505 nm. Sēklinieku homogenāta olbaltumvielu koncentrācija tika noteikta ar Bio-Rad DC proteīna testa komplektu un aprēķināta tā specifiskā aktivitāte (U/mg proteīna). Katalāzes (CAT) aktivitāte tika noteikta saskaņā ar iepriekš aprakstīto metodi [15].

H&E (hematoksilīna un eozīna) krāsošana

Sēklinieku 24 stundas iemērc 10% formalīnā un uzglabāja 4 ◦C temperatūrā. Audi bija mikroizmērā un piestiprināti pie priekšmetstikliņa. Pēc fiksācijas (95% metanola + 5% etiķskābes) priekšmetstikliņus uz 3 minūtēm iegremdēja hematoksilīnā, 5 minūtes mazgāja ar tekošu ūdeni un pēc tam mērcēja ar 50%, 70% un 90% spirtu. vienu minūti. Pēc tam priekšmetstikliņus 10 sekundes iekrāsoja ar eozīnu un vienu minūti iemērc 100% spirtā, līdz tas izbalēja. Visbeidzot, priekšmetstikliņu vienu minūti iemērc ksilolā. Vēlāk priekšmetstikliņus izžāvēja gaisā un aizzīmogoja. Nokrāsotā caurule tika ievietota apgrieztās fāzes kontrasta mikroskopā (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokija, Japāna), lai novērotu morfoloģiju.

Hipotalāmu analīze

Peles KISS1, G-proteīnu savienotais receptors (GPR) 54, citokīnu signalizācijas 3 nomācējs (SOCS-3) un sirtuīna 1 (SIRT1) gēnu sekvences tika identificētas no NCBI (Nacionālais biotehnoloģijas informācijas centrs) gēnu datu bāzes. un tika izstrādāts īpašs gruntējums, izmantojot Primer 5.{8}} PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, ASV.). Eksperimentā izmantotie primeri ir uzskaitīti 1. tabulā.

Ribonukleīnskābes (RNS) ekstrakcija no hipotalāma. RNS ekstrakcija no smadzeņu hipotalāma tika veikta, izmantojot RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. Iegūtās mRNS tika kvantitatīvi mērītas ar reverso transkripciju (RT) un polimerāzes ķēdes reakciju (PCR). Komplimenta DNS, kas iegūta no RT analīzes, tika uzglabāta –20 ◦C vēlākai lietošanai. Ekstrahētā DNS tika pakļauta polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) analīzei, izmantojot Taq polimerāzi. Pēc tam tika ņemti 5–10 µL PCR produkta un analizēti ar elektroforēzi uz 1, 5% agara koloīda. Attēls tika uzņemts UVP BioDoc-It attēlveidošanas sistēmā. Tika ņemta reversi transkribēta komplementārā dezoksiribonukleīnskābe (cDNS) un veikta PCR, izmantojot IQ SYBR Green Supermix komplektu. Vēlāk tas tika analizēts ar iQTM 5 Optical System Software. Olbaltumvielas tika ekstrahētas, izmantojot proteīna ekstrakcijas reaģentu (T-PER). Pēc tam 20 mg sēklinieku homogenāta pievienoja 400 µl T-PER un centrifugēja (ātrgaitas centrifūga, Hettich CR-12, Tutlingen, Vācija) 4 ◦C (125,000 × g) temperatūrā. ) 20 minūtes. Sekojošā metode bija līdzīga "olbaltumvielu identifikācijai un kvantitatīvai noteikšanai" in vitro analīzē.

2.3. Statistiskā analīze

Eksperimenta rezultāti tika izteikti kā vidējā ± standartnovirze (Mean ± SD), un dati tika analizēti, izmantojot Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0 programmatūru, IBM, Armonk, Ņujorka, NY, ASV. Atšķirības starp grupām tika analizētas ar vienvirziena dispersijas analīzi (ANOVA). Vairāki dažādu grupu salīdzinājumi tika analizēti ar Dankana testu pie vērtības p < 0.05 kā nozīmīgais līmenis.

3. Rezultāti

3.1. In vitro analīze

3.1.1. ECH, CTE un RES antioksidantu aktivitāšu salīdzinājums

Ilgtermiņa haugsts oksidatīvais stress un hronisks iekaisums ir galvenie diabēta cēloņikomplikācijas [16]. CTE satur dažādasfeniletanoīdu glikozīdi, piemēram, ehinakozīds(ECH) un akteozīds, ar potenciālu antioksidantu aktivitāti [17]. DPPH radikāļu attīrīšanatests tika veikts, lai novērtētu ECH antioksidantu aktivitāti. Trolox un resveratrol(3,5,4'-trihidroksistilbēns, RES) tika ņemti attiecīgi par standarta un pozitīvo kontroli. Kā parādītsattēlā1, ECH uzrādīja labāku radikāļu attīrīšanas aktivitāti, un aktivitāte bija ievērojami augstākanekā pozitīvās kontroles (RES).

3.1.2. ECH šūnu dzīvotspēja LC-540 un TM3 Leydig šūnās

MTT tests tika veikts, lai novērtētu dažādu ECH koncentrāciju šūnu dzīvotspēju. LC-540 Leidiga šūnas un TM3 Leidiga šūnas uzrādīja vairāk nekā 80% dzīvotspējas pēc apstrādes ar ECH (2. attēls). Salīdzinot ar citām koncentrācijām, ECH koncentrācija 100-µM (atšķaidījums 100 µM 2% FBS) uzrādīja labāku šūnu dzīvotspēju TM3 Leydig šūnās. Rezultāts liecināja, ka palielinātā ECH koncentrācija šūnām neveicina būtisku toksicitāti.

3.1.3. ECH ietekme uz AGE izraisītu superoksīda veidošanos ar NBT testu LC-540 un TM3 Leidiga šūnās

AGE izraisa oksidatīvus bojājumus organismā, jo notiek glikozes oksidēšanās un brīvo radikāļu, piemēram, O2-, hidroksilgrupu un karbonilgrupu veidošanās [18]. Pēc stimulēšanas ar 50 ug/mL AGE šūnas LC-540 (3.a attēls) un TM3 (3.b attēls) apstrādāja ar ECH un RES (katra 5 μM un 10 μM). Rezultāti parādīja, ka superoksīda anjonu ražošana tika palielināta kontroles grupā (stimulēti AGE), bet superoksīda anjonu ražošana pēc kontroles grupas (stimulētie AGE) tika samazināta, bet superoksīda anjonu ražošana samazinājās pēc superoksīda ražošanas un aizsargāta. šūnas no oksidatīviem bojājumiem. LC-540 šūnu gadījumā 10 µM ECH uzrādīja gandrīz līdzīgu aktivitāti ar parasto grupu. Superoksīda ražošana abās šūnās tika samazināta, palielinoties gan ECH, gan RES koncentrācijai.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA SEKSUĀLĀS FUNKCIJAS UZLABOŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.1.4. ECH ietekme uz H2O2 ražošanu AGE-stimulētās LC-540 Leydig šūnās

Lai noteiktu oksidatīvo sugu klātbūtni, tika veikts DCFH-DA tests. Pēc iekļūšanas šūnās fluorescējošā krāsviela DCFH-DA tiek oksidēta ar intracelulāru H2O2 un veido dihlorfluoresceīnu (DCF). Kā parādīts 4. attēlā, AGE stimulētajā grupā (kontrolē) bija ievērojams intracelulārā H2O2 ražošanas pieaugums, turpretim 10 µM ECH un RES pievienošana ievērojami samazināja H2O2 veidošanos šūnās. 10 µM ECH ievadīšana izraisīja tikai aptuveni 47,1% H2O2 ražošanas, kas ir ievērojami mazāk nekā kontroles grupā.

3.1.5. ECH ietekme uz RAGE un NF-κB proteīna ekspresijas līmeņiem AGE-stimulētās LC-540 Leydig šūnās

Tika veikta Western blot analīze, lai apstiprinātu RAGE klātbūtni LC-540 Leydig šūnās. ECH ietekme uz RAGE (5.a attēls) un NF-κB (5.b attēls) proteīna ekspresijas līmeņiem AGE stimulētajās Leidiga šūnās parādīta 5. attēlā. Rezultāti parādīja, ka AGE 50 µg/ml koncentrācija izraisīja augstāku RAGE un NF- κB ekspresija LC-540 Leidiga šūnās un 10 µM ECH un RES koncentrācija būtiski samazināja RAGE un NF-κB ekspresiju. NF-κB ekspresija bija ievērojami zemāka RES un ECH nekā RAGE antagonistos. Tātad rezultāti apstiprināja, ka ECH samazināja iekaisuma līmeni, samazinot RAGE un NF-κB līmeni.

3.1.6. ECH ietekme uz testosterona sintēzes ceļu AGE-stimulētās LC-540 Leydig šūnās.

Spermatoģenēzes un vīriešu neauglības process ir atkarīgs no testosterona klātbūtnes. Kā parādīts 6. attēlā, StAR (6. attēls), CYP11A1 (6.b attēls), CYP17A1 (6.c attēls) un HSD17 3 (6.d attēls) proteīnu ekspresija bija ievērojami samazināta AGE stimulētajā LC{{11. }} Leidiga šūnas (kontrolgrupa). StAR, CYP11A1, CYP17A1 un HSD17 3 proteīnu ekspresijas ievērojami palielinājās, pievienojot RAGE antagonistu RES un ECH. Paaugstināta StAR un CYP11A1 proteīnu ekspresija tika novērota gan ar ECH, gan ar RES ārstētajās grupās. CYP17A1 ekspresijas līmenis bija gandrīz līdzīgs RES un ECH grupās. HSD17 3 proteīna ekspresija ar ECH apstrādātajās Leidiga šūnās bija daudz augstāka nekā ar RES un RAGE antagonistiem apstrādātajām šūnām. Paaugstināta StAR, CYP11A1, CYP17A1 un HSD17 3 proteīnu ekspresija liecināja par normālu testosterona veidošanos.