Cistanche Herba cistanozīds mazina hipoksijas izraisītos vīriešu reproduktīvos bojājumus, nomācot oksidatīvo stresu-Ⅰ

Ievads

Pašlaik aptuveni 48,5 miljonus (15%) reproduktīvā vecuma pāru visā pasaulē skar neauglība, tostarp 40-50% gadījumu ir saistīti ar vīriešu neauglību, kas ir cieši saistīta ar vides un dzīvesveida faktoriem. Pierādījumi liecina, ka zīdītāju sēklinieku jutīgums pret zemu skābekļa spiedienu ir dažu vīriešu neauglības veidu cēlonis. Kā parādīts iepriekšējos pētījumos, pēc hipobariskās hipoksijas iedarbības tiek traucēta un samazināta spermatoģenēze.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA SEKSUĀLĀS FUNKCIJAS UZLABOŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Lai izpētītu pamatā esošo mehānismu, pētījumi ir parādījuši, ka hipobariskās hipoksijas iedarbība palielina reaktīvo skābekļa sugu (ROS) veidošanos. ROS ir svarīga loma vīriešu reproduktīvajā sistēmā. Zemā līmenī tie ir nepieciešami spermas kapacitātei, akrosomu reakcijai un spermatozoīdu un olšūnu saplūšanai [10]. Tomēr pārmērīga ROS var izraisīt spermas kodola/mitohondriju DNS bojājumus un plazmas membrānas peroksidatīvus bojājumus, kas savukārt ir galvenie etioloģiskie faktoripalielināts vīriešu neauglības risks. Tādējādi hipoksijas izraisītas ROS uzkrāšanās varētu būt viens no vīriešu neauglības cēloņiem.

Cistanches Herba, daudzgadīgs parazītu ārstniecības augs, ir plaši izplatīts sausos apgabalos un plaši izmantots tā farmakoloģisko aktivitāšu dēļ. Starp visu efektīvu saturuCistanches Herba, PhG ir uzskatīti par galveno aktīvo sastāvdaļu. Līdz šim ir izolēti 34 PhG noCistanču augi. Cistanosīds(Cis), aktīvs PhG, kas izolēts noCistanches Herba, ir pievērsusi uzmanību tās antioksidanta iedarbībai.

Ņemot vērā Cis antioksidantu iedarbību un ROS lomu hipoksijas izraisītā vīriešu neauglībā, Cis tiek uzskatīts par potenciālu zāļu kandidātu, lai ārstētu.hipoksijas izraisīta vīriešu neauglība. Tomēr daži ziņojumi ir aplūkoti no Cistanches Herba iegūtās Cis antioksidanta iedarbības hipoksijas izraisītas vīriešu neauglības ārstēšanā vai iesaistītajiem signalizācijas ceļiem. Šajā pētījumā tika izveidoti in vitro un in vivo hipoksijas eksperimentālie modeļi un novērtēti dažādu Cis iedarbības komponenti.

materiāli un metodes

Šūnu kultūra un reaģents

Peļu spermatogoniju šūnu līnija GC-1spg (GC-1) tika iegādāta no American Type Culture Collection (ATCC) un kultivēta DMEM (Invitrogen, ASV), kas papildināta ar 10% liellopu augļa serumu, 1% L-glutamīns (100 mM), penicilīns (100 U/ml) un streptomicīns (100 ug/ml) 37 grādu temperatūrā mitrinātā inkubatorā ar 5% CO2. Cis (Cis-A, B, C, H) iegādājās no Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (Ķīna).

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA SEKSUĀLĀS FUNKCIJAS UZLABOŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Šūnu dzīvotspējas tests

Šūnu dzīvotspēja tika pārbaudīta ar šūnu skaitīšanas komplekta{{0}} testu (CCK-8). Īsi sakot, GC-1 šūnas tika iesētas 96-iedobju plāksnēs ar ātrumu 1,5 × 103 katrā iedobē un kultivētas 37 grādu temperatūrā 24 stundas. Pēc tam šūnas tika apstrādātas ar dažādām koncentrācijām (20%, 15%, 10%, 5%) skābekļa vai dažādām koncentrācijām (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) Cis (Cis-A, Cis-B, Cis- C, Cis-H) nepieciešamo laiku. Pēc tam supernatants tika izmests, un šūnu dzīvotspēja tika noteikta, izmantojot CCK-8 komplektu (Dojindo Japāna). Katras iedobes absorbcija tika mērīta pie 450 nm, izmantojot mikroplašu lasītāju (BioRad USA). Visbeidzot, šūnu dzīvotspējas tika aprēķinātas pēc šādas formulas: Šūnu dzīvotspēja=(ODeksperimentālā grupa - ODtukšā grupa)/ (ODkontroles grupa - ODtukšā grupa) × 100%.

Western blot analīze

Savāktās šūnas vai audi tika homogenizēti RIPA buferšķīdumā, lai ekstrahētu olbaltumvielas (RIPA Beyotime China; Cocktail Roche Switzerland). Supernatanti tika savākti, un olbaltumvielu koncentrācija tika pārbaudīta ar BCA metodi (Beyotime). Aptuveni 40 ug ekstrahēto proteīnu no katra parauga tika atdalīti ar SDS-PAGE un elektropārnesti uz nitrocelulozes (NC) filtra membrānu (Beyotime China). NC filtru membrānas tika bloķētas ar 5% beztauku pienu 1,5 stundas un inkubētas ar specifiskām antivielām (anti-PARP 1:1000, antiCaspase-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti-Bax 1 :1000, anti-GAPDH 1:1000 visas antivielas tika iegādātas no Cell Signaling Technology, ASV) nakti 4 grādu temperatūrā; Pēc tam visas NC membrānas tika inkubētas ar atbilstošo mārrutku peroksidāzes konjugētu sekundāro antivielu 1, 5 stundas istabas temperatūrā un attēlotas ar attēlveidošanas sistēmu (Tannon, Ķīna).

Šūnu cikla noteikšana

Lai analizētu šūnu ciklu, tika veikts plūsmas citometriskais tests (FCM). Šūnas tika apstrādātas dažādos apstākļos 72 stundas un novāktas. Pēc tam šūnas tika mazgātas ar PBS, fiksētas 75% etanolā un iekrāsotas ar propīdija jodīdu (PI). Katram paraugam tika savāktas 1 × 104 šūnas un analizētas ar plūsmas citometriju (FACS Calibur, BD Biosciences). Pēc tam tika aprēķināts G1/S/G2 fāzes šūnu īpatsvars un proliferācijas indekss [fāze(S+G2)/fāze(G1+S+G2) × 100%].

Ki-67 krāsošana

Šūnas tika kultivētas konfokālā traukā un apstrādātas ar hipoksiju vai dažādiem Cis apakštipiem 72 stundas. Pēc visu šūnu fiksēšanas ar 4% paraformaldehīdu tās tika inkubētas ar anti-Ki-67 antivielu (1:200, Cell Signaling Technology). Pēc tam visas šūnas tika inkubētas ar atbilstošu CY-3-konjugētu anti-trušu IgG antivielu (1:200, Boster, Ķīna) un DAPI šķīdumu (1,0 ug/ml, Beyotime). Fluorescence tika novērota ar Fluoview FV1000 konfokālo mikroskopu (Olympus, Japāna).

AUGSTĀKĀS LĪMEŅA CISTANČES TUBULOZAS EKSTRAKTS TESTOTERONA PASTIPRINĀŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

ROS noteikšana

FCM tika ieviests, lai izmērītu intracelulāros ROS līmeņus, izmantojot DCFH-DA. Suspendētās šūnas tika iesētas 6-iedobju plāksnēs un pakļautas dažādai apstrādei. Pēc 72 stundu ilgas apstrādes šūnas tika suspendētas serumu nesaturošā DMEM ar 10 μM DCFH-DA (Beyotime). Pēc tam ROS saturu noteica ar fluorescences aktivētu šūnu šķirošanu Beckman Coulter plūsmas citometrijas sistēmā ar ierosmes viļņa garumu 488 nm un emisijas viļņa garumu 525 nm [18].

Lipīdu peroksidācijas (LPO) noteikšana

Lai noteiktu LPO, tika veikts tiobarbitūrskābes reaktīvo vielu (TBARS) tests. Visas darbības tika veiktas saskaņā ar instrukcijām (Sigma USA). Koncentrācijas tika aprēķinātas, izmantojot molāro ekstinkcijas koeficientu 1,56 × 105/(M·cm), kas iegūts, izmantojot malondialdehīdu kā standartu. Rezultāti ir izteikti kā nmol MDA ekvivalentu/mg proteīna.

Fermentu aktivitāšu noteikšana

Fermentu aktivitātes tika pārbaudītas, izmantojot testu komplektus, tostarp glutationa reduktāzi (GR), glutationa peroksidāzi (GPx) un superoksīda dismutāzi (SOD). Visas darbības tika veiktas saskaņā ar pievienotajām instrukcijām (Nan Jing Jian Cheng Bioinženierijas institūts Ķīnā).

Dzīvnieki un eksperimentālais protokols

Nobrieduši Wistar žurku tēviņi (180-220 g, 8 w veci) tika iegūti no Ceturtās Militārās medicīnas universitātes dzīvnieku centra Sjaņā, Ķīnā. Dzīvnieku izmantošanas atļauja tika saņemta no Universitātes Ētikas komitejas (atsauces numurs: 20190506). Eksperiments ar dzīvniekiem tika veikts saskaņā ar universitātes vadlīnijām par laboratorijas dzīvnieku kopšanu un izmantošanu.

Visām žurkām tika atļauts pielāgoties apmēram 1 nedēļu pirms eksperimenta sākuma. Pēc aklimatizācijas žurkas nejauši tika sadalītas 6 grupās ar 5 dzīvniekiem katrā grupā. Kontroles grupas žurkas tika audzētas normālā spiedienā (PO2: 20%; gaisa spiediens: 101,3 kPa), savukārt žurkas modelī un grupās, kas tika ārstētas ar Cis, tika audzētas zema spiediena skābekļa kamerā (iekšējais spiediens 61,6 kPa). , kas atbilst 4000 metru augstumam virs jūras līmeņa, PO2: 14,55%), lai modelētu augstkalnu hipoksisku vidi. Visām žurkām bija brīva piekļuve pārtikai un ūdenim plastmasas būros 22 ± 2 grādu temperatūrā un mitruma apstākļos ar automātisku 12-h gaismas/tumsas ciklu. Žurkas modeļa un Cis apstrādātajās grupās palika hipobariskos apstākļos, bet ik pēc 96 stundām tika pārvietotas uz normobariskiem apstākļiem, šajā laikā tām tika nodrošināta barība un ūdens, un būri tika iztīrīti. Pārejas ilgums no hipobariskas uz hipobarisku bija aptuveni 2 stundas. Visas ārstēšanas grupas tika ārstētas ar atbilstošo Cis (8 mg / kg / dienā), izmantojot orālo zondi 8 nedēļas, savukārt kontroles un modeļa žurkas tika apstrādātas ar vienādu ūdens daudzumu.

Pēc 8 nedēļām žurkas tika nogalinātas anestēzijā. Sēklinieki, epididīms un sēklas pūslīši tika atdalīti un nosvērti, un orgānu indekss tika aprēķināts pēc šādas formulas: (orgāna/dzīvnieka svars) × 100%. Pēc tam tika savākti spermatozoīdi epididīmā un pārbaudīta to kustība un akrosomu enzīmu aktivitāte. Līdzīgi tika savākti sēklinieku audi histopatoloģiskiem pētījumiem un ROS, LPO un antioksidantu enzīmu aktivitātes noteikšanai.

CISTANŠES TUBULOZAS EKSTRAKTS CISTANŠES ZĀĻU PALIELINĀŠANA DZIMUMSPĒKU PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Dzīvas spermas ātruma novērtējums

Epididīms tika iegriezts ar ķirurģiskām šķērēm, un spermas suspensija tika pagatavota normālā fizioloģiskā šķīdumā. Lai novērtētu dzīvās spermas ātrumu, 5 μL spermas suspensijas rūpīgi sajauca ar vienādu tilpumu eozīna-Y traipu. Pēc tam spermas tika skaitītas gaismas mikroskopā. Dzīvās spermas līmenis tika novērtēts, aprēķinot gan iekrāsotu (mirušu spermu), gan nekrāsotu spermu (dzīvu spermu).

Spermas akrosomu enzīmu aktivitātes noteikšana

Spermas akrosomu enzīmu noteikšanai tika izmantots spermas akrosomu enzīmu aktivitātes tests [19]. Rezultāti katrā grupā tika aprēķināti, izmantojot šādu formulu: Akrosomu enzīmu aktivitāte (μIU)=(ODExperiment group - ODBlank group)/(247,5×10) × 106.

Rezultāti

Hipoksijas ietekme uz GC{0}} šūnām

Lai noteiktu hipoksijas ietekmi uz dzimumšūnām, mēs vispirms pārbaudījām šūnu dzīvotspējas izmaiņas pēc hipoksijas ārstēšanas ar dažādām skābekļa koncentrācijām (20%, 15%, 10% un 5%) 1, 3, 5 , un attiecīgi 7 dienas. CCK-8 testa rezultāti parādīja, ka, salīdzinot ar kontroles grupu (20% skābekļa koncentrācija), šūnām, kas pakļautas hipoksijai, bija ievērojams dzīvotspējas samazinājums (P < 0,01; 1.A attēls). Turklāt to izdzīvošanas līmenis bija apgriezti proporcionāls skābekļa koncentrācijai un vēl vairāk samazinājās līdz ar indukcijas laiku. Lai izvairītos no pārmērīgas citotoksiskas iedarbības, 10% skābekļa koncentrācija un 3-dienas indukcijas laiks tika izvēlēti kā hipoksijas modeļa kritēriji turpmākajiem in vitro eksperimentiem.

Pēc tam tika veikta FCM un imunofluorescences krāsošana, lai tālāk novērtētu GC{{0}} šūnu proliferācijas izmaiņas hipoksijas ārstēšanas laikā. Rezultāti parādīja, ka hipoksija var izraisīt GC-1 šūnu apstāšanos G1 fāzē, tādējādi samazinot šūnu iekļūšanu S fāzē un kavējot DNS replikāciju. Tādējādi hipoksija ievērojami samazināja GC-1 šūnu proliferācijas indeksu (P < 0,01; 1.B attēls). Pozitīva Ki-67 iekrāsošanās ir vēl viens specifisks proliferējošo šūnu biomarķieris. Tāpēc mēs pārbaudījām arī Ki-67-pozitīvo šūnu attiecību ar vai bez hipoksijas ārstēšanas. Salīdzinot ar kontroles grupu, hipoksijas terapija ievērojami samazināja Ki-67-pozitīvās šūnas, kā parādīts 1.C attēlā.

Tālāk mūsu mērķis bija izpētīt GC{{0}} šūnu dzīvotspējas inhibīcijas veidu, ko izraisa hipoksija. Kā ziņots literatūrā, ROS līmenis palielinājās, jo žurkas tika pakļautas hipobariskai hipoksiskai videi [8, 20]. Tādējādi endogēnie ROS līmeņi GC-1 šūnās tika mērīti, izmantojot FCM testu. Rezultāti uzrādīja augstāku ROS līmeni hipoksijas apstākļos, salīdzinot ar parasto skābekļa grupu (P <0,01; 1.D attēls). Uzkrātais ROS izraisa izteiktus DNS traucējumus, kas savukārt izraisa šūnu apoptozes ceļa aktivāciju un var būt galvenais etioloģiskais faktors pieaugošajam vīriešu neauglības riskam [21, 22]. Pēc tam mēs atklājām hipoksijas apoptotisko aktivācijas efektu uz GC-1 šūnām ar TUNEL krāsošanu. Kā parādīts 1E attēlā, ārstēšana ar hipoksiju palielināja TUNEL fluorescenci salīdzinājumā ar kontroles grupu, kas liecina par apoptozes palielināšanos modeļa grupā.

Tā kā ROS izraisītos šūnu bojājumus parasti izraisa OS, mēs tālāk pārbaudījām GC-1 šūnu OS. Kā parādīts 1. F attēlā, GC-1 šūnu LPO līmeņi modeļu grupā bija ievērojami paaugstināti, salīdzinot ar GC-1 šūnu LPO līmeņiem kontroles grupā. Šie atklājumi liecināja, ka hipoksijas izraisīts GC-1 šūnu bojājums varētu būt saistīts ar OS, ko izraisa ROS uzkrāšanās.