Cistanche Tubulosa halkona sintāzes klonēšana, funkcionālā identifikācija un ekspresijas analīze Ⅱ

3 Rezultāti un analīze

3.1. CtCHS gēna klonēšana

Četras sekvences, kas anotētas kā "halkona sintāze", tika atlasītas, izmantojot Cistanches tubulosa ziedu transkripta datus. Izmantojot NCBI Blast salīdzinājumu, tika atklāts, ka tikai vienai sekvencei bija pilns CHS gēna garums un FPKM bija lielāks par 10. Pamatojoties uz šo secību, tika izstrādāti specifiski praimeri, un aptuveni 1200 bp liels fragments tika iegūts ar PCR amplifikāciju, izmantojot Cistanches tubulosa ziedu cDNS kā veidne (1. attēls). PCR produkts tika atgūts ar gēlu un savienots ar pCE2TA / Blunt-Zero vektoru. Sekvences rezultāti atbilda transkripta analīzei. Gēnu nosauca par CtCHS. Secības garums ir 1173 bp un kodē 390 aminoskābes.

Wecistanche atbalsta dienests - lielākā cistanche eksportētāja Ķīnā:

E-pasts:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel.:+86 15292862950

Iegādājieties sīkāku informāciju par specifikācijām:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

3.2. CtCHS bioinformātikas analīze

3.2.1. CtCHS fizikālās un ķīmiskās īpašības un transmembrānu domēna analīze

Tiešsaistes programmatūra ProtParam tika izmantota, lai analizētu CtCHS gēna kodētā proteīna fizikālās un ķīmiskās īpašības. CtCHS kodē 390 aminoskābes, molekulārā formula ir C1908H3041N511O562S22, relatīvā molekulmasa ir 42 836,54, teorētiskais izoelektriskais punkts ir 5,85, un tas ir nestabils. Koeficients II ir 43,24, kas ir nestabils proteīns, un kopējā vidējā hidrofilitāte (GRAVY) ir –0,052, kas ir hidrofils proteīns. Prot Scale tiešsaistes rīks tika tālāk izmantots, lai analizētu olbaltumvielu hidrofilitāti / hidrofobitāti. Analīzes rezultāti parādīja, ka CtCHS proteīna hidrofilitātes/hidrofobitātes maksimālā vērtība bija 2,422 (342), bet minimālā vērtība bija –2,489 (119). CtCHS gēna kodētajā aminoskābju peptīdu ķēdē ir vairāk hidrofilo aminoskābju atlikumu nekā hidrofobās aminoskābju atliekās, tāpēc tas ir hidrofils proteīns. Tiešsaistes programmatūra TMHMM tika izmantota, lai prognozētu proteīna transmembrānu struktūru. CtCHS proteīnam nav transmembrānas domēna.

1. attēls CtCHS gēna PCR amplifikācija

3.2.2. CtCHS proteīna sekundārās un terciārās struktūras prognozēšana

Tiešsaistes rīks SOPMA tika izmantots, lai prognozētu olbaltumvielu sekundāro struktūru. Rezultāti ir parādīti attēlā 2-A. 44,87% -spirāles, 31,03% nejaušas spoles, 15,64% pagarinātas ķēdes un 8,46% -loksnes veido CtCHS proteīna sekundāro struktūru. līmeņa struktūra. Tiešsaistes analīzes programmatūra SWISS-MODEL tika izmantota, lai prognozētu proteīna terciāro struktūru, un rīsu CHS1 kristāla struktūra tika izmantota kā veidne, lai prognozētu CtCHS proteīna trīsdimensiju struktūru. Rezultāti ir parādīti attēlā 2-B. Konsistence starp Cistanche tubulosa CtCHS un rīsiem CHS1 ir 83,55%.

3.2.3. Secību salīdzināšana un filoģenētiskā koku analīze un pielietošana

Programmatūra DNAMAN veic homoloģijas salīdzinājumu starp citu sugu CtCHS un CHS aminoskābju sekvencēm. Rezultāti ir parādīti attēlā 3-C. CtCHS aminoskābju secība atbilst Sesamum indicum L. (XP_011091402.1) un Antirrhinum majus L. (P06515. 1), Mazus pumilus (NL Burman)Steenis (AAN05791.1), Erythranthe lewisiiG. L. Nesom & NS Fraga (AHJ80976.1), Perilla frutescens (L.) Britton (O04111.1 ) un Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (NP_196897.1). CHS aminoskābju sekvences ir ļoti līdzīgas, un līdzība ir 90,93%, 90,68%, 90,18%, 89,42%, 89,42% un 81,61%.

DABĪGS ORGANISKS CISTANŠES EKSTRAKTS AR 30% EHINAKOZĪDU UN 12% AKTEOZĪDU

Turklāt vairāku secību izlīdzināšana arī parādīja, ka CtCHS ir saglabājis katalītiskās atliekas Cys164, His303 un Asn336. Lai vēl vairāk izprastu Cistanche tubulosa CtCHS evolūcijas stāvokli augu CHS ģimenē, MEGA-X programmatūra tika izmantota, lai izveidotu filoģenētisku koku starp citu augu CtCHS un CHS proteīniem. Rezultāti ir parādīti attēlā 3-DE lewisii AHJ80976.1) ElCHS ir cieši saistīta.

3.3 CtCHS prokariotu ekspresija un attīrīšana

PET-28a-CtCHS plazmīda tika pārveidota par E. coli ekspresijas celmu BL21 (DE3), un proteīna ekspresija tika inducēta ar IPTG zemā temperatūrā. Proteīns tika attīrīts, izmantojot niķeļa jonu afinitātes hromatogrāfijas kolonnu, un attīrītais proteīns tika noteikts ar 10% SDSPAGE. Rezultāti ir parādīti 3. attēlā. CtCHS proteīna josla parādījās tuvu 40,000, kas atbilst CtCHS proteīna relatīvajai molekulmasai 42 800.

3.4. CtCHS enzīmu aktivitātes analīze

Lai identificētu CtCHS funkciju, attīrītais CtCHS proteīns tika inkubēts ar malonil-CoA, 4- kumaroil-CoA, un produkti tika noteikti, izmantojot HPLC un MS. Dabiskos apstākļos naringenīna-halkons ir nestabils šķīdumā un viegli ciklizējas par naringenīnu. Tāpēc naringenīna-halkons un naringenīns tika izvēlēti kā standarta kontroles.

HPLC testa rezultāti ir parādīti 4-A un B attēlā. Fermenta reakcijas produkta aiztures laiks ir līdzīgs naringenīna standarta aiztures laikam. Abiem ir maksimālā absorbcija pie 289 nm UV absorbcijas spektrā, kas atšķiras no naringenīna-halkona aiztures laika. Laika un UV absorbcijas spektri bija atšķirīgi, taču kā negatīva kontrole produkts pēc augstā temperatūrā inaktivēta CtCHS proteīna inkubācijas ar substrātu nesaturēja naringenīnu, halkonu un naringenīnu. Turpmāka noteikšana, izmantojot masas spektrometriju, pirmā līmeņa masas spektrs (attēls 4-C, D) parādīja, ka fermenta reakcijas produktam ir [MH] maksimums m/z271.060 97, savukārt naringenīnam ir [MH ]-maksimālais m/z 271.{13}}.

Salīdzinot MS2 spektrus (attēls 5-E, F), CtCHS enzīma reakcijas produktam un naringenīnam ir raksturīgi fragmentu maksimumi pie m/z 107, 151 un 177, kas atbilst literatūras ziņojumam [19], norādot, ka CtCHS ir halkona komplekss. Enzīmu aktivitāte, tā var katalizēt malonil-CoA un 4-kumaroil-CoA reakciju uz naringenīna-halkonu.

3.5. Subcelulārās lokalizācijas analīze

Lai izpētītu CtCHS proteīna lomu šūnās, pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS plazmīda tika uzbūvēta un pārveidota Arabidopsis thaliana protoplastos, lai novērotu tās subcelulāro lokalizāciju. Rezultāti parādīti 5. attēlā. Kā kontrole pCAMBIA1300-35S-GFP proteīns tika izplatīts kodolā un citoplazmā, bet pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS saplūsmes proteīns galvenokārt tika izplatīts citoplazmā, norādot, ka CtCHS proteīns var darboties augu šūnu citoplazmā. Funkcija.

3.6. CtCHS izteiksmes modeļa analīze

qRT-PCR tika izmantots, lai noteiktu CtCHS relatīvo ekspresiju Cistanche deserticola ziedos ar trim krāsām: baltu, violetu un sarkanu. Rezultāti parādīti 6. attēlā. CtCHS ekspresija purpursarkanos un sarkanos ziedos bija ievērojami augstāka nekā baltos ziedos. daudzums. Salīdzinot ar baltajiem ziediem, CtCHS ekspresijas līmenis purpursarkanajos ziedos ir 8,44 reizes augstāks, bet CtCHS ekspresijas līmenis sarkanos ziedos ir 3,21 reizi augstāks. Šie rezultāti liecina, ka izmaiņas CtCHS ekspresijas līmeņos var būt saistītas ar Cistanche deserticola ziedu krāsas atšķirību. Jo augstāks izteiksmes līmenis, jo tumšāka ir ziedu krāsa. , jo zemāks izteiksmes līmenis, jo gaišāka ir ziedu krāsa.

****P＜0.000 1Att. 6 CtCHS relatīvais ekspresijas līmenis ziedos ar dažādām krāsām

4 Diskusija

CHS ir agalvenais enzīms flavonoīdu biosintēzes ceļāun ir saistīts ar the ziedu krāsas regulēšanadaudzos augos. Piemēram, ziedu krāsaDianthus chinensisL.[20] un Petunia × hybrida Hort. exVilm.[22] visus ietekmē CHS. kontrole.Cistanches tubulosagalvenokārt ir trīs ziedu krāsas: balta, sarkana un violeta, taču par tās ziedu krāsas regulēšanas mehānismu vēl nav ziņots. Šajā pētījumā CtCHS gēns tika klonēts, izmantojot RT-PCR cauriCistanches tubulosa ziedu transkripta datu analīze, un tas ir

Bioinformātikas analīzetika veikta, un rezultāti parādīja, ka CtCHS ir liela līdzība un cieša ģenētiskā saistība ar Physalis nigra (AHJ80976.1) ElCHS aminoskābju secību. CHS ir III tipa poliketīda sintāze (PKSIII), un pētījumos ir atklāts, ka CHS ir konservēta Cys-His-Asn katalītiskā triāde [23]. Šajā pētījumā aminoskābju secību saskaņošanas analīze parādīja, ka CtCHS ir saglabājuši katalītiskie atlikumi Cys164, His303 un Asn336, norādot, ka CtCHS var būt tipiska halkona sintāzes funkcija.

spēj. Fermentu aktivitātes analīze tika veikta, izmantojot CtCHS proteīna prokariotu ekspresiju Escherichia coli, un tika noteikta ar HPLC un MS. Tika konstatēts, ka CtCHS proteīns var katalizēt 4-kumaroil-CoA un malonil-CoA, veidojot naringenīna-halkonu.

CHS ir iesaistīts flavonoīdu sintēzē daudzos augos, taču tā subcelulārā atrašanās vieta dažādām sugām ir atšķirīga. Piemēram, Carthamus tinctorius L. CtCHS1[24], Morus atropurpurea Roxb. MaCHS[25], Eupatorium adenophorum Spreng. Visi eaCHS[26] atrodas citoplazmā, savukārt Paeonia delavayi var. lutea (Delavay ex Franch.) Finet et Gagnep. PdCHS

[27], baklažāns Solanum melongena L. SmCHS [28] atrodas citoplazmā un kodolā, un vīnogā Vitis vinifera L. VvCHS atrodas citoplazmā, kodolā un šūnas sieniņā [29]. Šajā pētījumā pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS plazmīda tika izmantota, lai pārveidotu Arabidopsis thaliana protoplastus, un tika novērots, ka CtCHS proteīns galvenokārt lokalizējas citoplazmā un var katalizēt naringenīna-halkona veidošanos citoplazmā. veicina flavonoīdu uzkrāšanos.

Fenilpropanoīdu ceļš atzarojas no 4-kumaroil-CoA uz flavonoīdu sintēzes ceļu un lignāna biosintēzes ceļu. CHS katalizē 4-kumaroil-CoA un malonil-CoA, lai radītu naringenīnu un halkonu, lai ierosinātu flavonoīdus. Savienojumiem līdzīgu savienojumu biosintētiskais ceļš ir pirmais galvenais enzīms šajā ceļā [30]. Tāpēc augsti izteikts CHS ir labvēlīgs augiem, lai uzkrātu augstāku flavonoīdu līmeni un iegūtu tumšākus ziedus. Piemēram, CHS ekspresijas līmenis Hosta plantaginea (Lam.) Aschers purpura ziedu šķirnēs ir augstāks nekā baltziedu šķirnēm. Hosta HpCHS tiek pārveidots par tabaku, lai iegūtu Salīdzinot ar savvaļas tabaku, pārmērīgas ekspresijas augiem ir tumšākas ziedlapiņas un lielāks kopējais antocianīna saturs [31].

Šajā pētījumā CtCHS gēna ekspresijas līmenis ir saistīts ar Cistanches tubulosa ziedu krāsu. Tas ir ļoti izteikts tumšāk purpursarkanos ziedos un sarkanos ziedos, un ir maz gaiši baltu ziedu. CtCHS izteiksmes atšķirības var būt saistītas ar atšķirību Cistanches tubulosa ziedos. Viens no iemesliem, kāpēc ir dažādi tērpi un krāsas. Kopumā šis pētījums klonēja CtCHS gēnu no Cistanche deserticola ziediem un veica tam bioinformātikas analīzi. CtCHS rekombinantais proteīns tika iegūts ar eksogēnu ekspresiju Escherichia coli. Enzīmu aktivitātes analīze pierādīja, ka CtCHS proteīns var katalizēt 4-kumaroilkoenzīmu. A un malonil-koenzīms A rada naringenīna-halkonu. Tika konstatēts, ka CtCHS gēns ir ļoti izteikts purpursarkanos un sarkanos ziedos un maz baltos ziedos. Šie rezultāti liecina, ka CtCHS gēns var regulēt dažādu ziedu krāsu veidošanos Cistanche deserticola, kas ir izdevīgi turpmākiem pētījumiem par Cistanche tubulosa ziedu krāsas regulēšanas mehānismu un nodrošina atsauci turpmākiem pētījumiem par CtCHS lomu ziedu krāsa Cistanche deserticola.