Cistanche Tubulosa halkona sintāzes klonēšana, funkcionālā identifikācija un ekspresijas analīze
Mar 25, 2024
Kopsavilkums: Mērķis Izpētīt halkona sintāzes funkciju no Guanhuaroucongrong (Cistanche tubulosa) un CtCHS gēna ekspresijas modeli baltos, sarkanos un purpursarkanos ziedos.
Metodes CtCHS gēns tika klonēts ar RT-PCR un tika veikta bioinformātikas analīze. pET-28a-CtCHS plazmīda tika pārnesta uz Escherichia coli, lai izraisītu proteīnu ekspresiju ar IPTG palīdzību. CtCHS rekombinanto proteīnu inkubēja ar substrātiem p-kumaroil CoA un malonil CoA, un produkti tika noteikti ar HPLC un MS. Plazmīda pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS tika pārnesta uz Arabidopsis thaliana protoplastu, lai novērotu CtCHS proteīna subcelulāro lokalizāciju. CtCHSgēna izteiksmes modelis ziedosC. tubulosaar trim krāsām tika atklāts ar qRT-PCR.
Rezultāti Tika klonēts CtCHS gēns. Atvērtā nolasīšanas rāmja (ORF) garums bija 1173 bp, kas kodē 390 aminoskābes, un proteīna molekulmasa bija 42 8000. CtCHS saturēja katalītiskos atlikumus Cys164, His303, Asn336, kas tika konservēti halkona sintāzē. CtCHSproteīns tika ekspresēts E. coli un attīrīts, lai iegūtu rekombinanto proteīnu. CtCHS proteīns varētu katalizēt p-kumaroila CoA un malonil CoA, lai iegūtu naringenīna halkonu. CtCHS proteīns galvenokārt tika lokalizēts citoplazmā. CtCHS gēns bija ļoti izteikts purpursarkanos un sarkanos ziedos, un relatīvie ekspresijas līmeņi bija attiecīgi 8, 44 un 3, 21 reizes augstāki nekā baltajiem ziediem.
Secinājums CtCHS gēns tika klonēts no ziedaC. tubulosaun tika ekspresēts proteīns. CtCHSproteīnam ir halkona sintāzes funkcija, un CtCHS gēna ekspresija ir augstāka tumšākos ziedos, kas norāda, ka CtCHSgēns var regulēt C. tubulosa ziedu krāsu, kas ir pamats turpmākiem pētījumiem parC. tubulosa ziedu krāsas regulēšanas mehānisms.
Atslēgvārdi:Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; halkona sintāze; fermentu aktivitātes analīze; subcelulāra lokalizācija; izteiksmes analīze
KLIKŠĶINIET ŠEIT, LAI IEGŪTU DABĪGU ORGANISKO CISTANŠES EKSTRAKTU AR 30% EHINAKOZĪDU UN 12% AKTEOZĪDU
Wecistanche atbalsta dienests - lielākā cistanche eksportētāja Ķīnā:
E-pasts:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel.:+86 15292862950
Iegādājieties sīkāku informāciju par specifikācijām:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-veikals
Biosintētikaflavonoīdu ceļšsākas ar fenilpropanoīda ceļu.Fenilalanīnsvispirms tiek pārvērsts kanēļskābē zemfenilalanīna amonialiāzes darbība(PAL), un kanēļskābe tiek 4-hidroksilēta ar kanēļskābi. Enzīms (kanēļskābes-4-hidroksilāze, C4H) un 4-kumarāta enzīma A ligāze (4-kumarāta enzīma A ligāze, 4CL) katalizē reakciju, veidojot 4-kumaroil-CoA [11 ]. Viena 4-kumaroil-CoA molekula un trīs malonil-CoA molekulas tiek katalizētas ar halkona sintāzi (CHS), lai iegūtu naringenīna halkonu, kurā ir flavonoīdu savienojumi. Halkona izomerāzes, flavanona{12}}hidroksilāzes pamats dihidroflavonola 4-reduktāze utt. rada dažādus flavonoīdus, piemēram, izoflavonus, flavonolus, antocianīnus utt. [12]. Kā galvenais enzīms flavonoīdu biosintēzes ceļā CHS regulē flavonoīdu saturu augos, kā arī spēlē nozīmīgu lomu augu ziedu krāsas regulēšanā [13]. Piemēram, Gentiana scabra Bunge CHS pēctranskripcijas gēnu klusēšana var kavēt antocianīnu biosintēzi un izraisīt specifisku vainaga daivu balināšanu [14]. CHS gēnu klusēšana Actinidia erianthaBenth. CHS samazina antocianīna saturu ziedlapiņās un padara ziedlapiņas sarkanas. Ziedlapiņas kļūst gaišākas[15]. Tāpēc šajā pētījumā no Cistanche tubulosa ziediem tika klonēts CtCHS gēns, un tam tika veikta bioinformātikas analīze, prokariotu ekspresija un attīrīšana, enzīmu aktivitātes analīze, subcelulārās lokalizācijas analīze un ekspresijas analīze trīs ziedu krāsās, lai izpētītu CtCHS funkciju. proteīns un CtCHS gēna ekspresijas modelis tika izmantoti, lai provizoriski izpētītu saistību starp CtCHS un Cistanche tubulosa ziedu krāsu, kas lika pamatu CtCHS regulējošā mehānisma izpētei.Cistanche tubulosa ziedu krāsa.
1 Materiāli un instrumenti
1.1 Materiāli
Cistanche tubulosa ziedi tika savākti no Yutian apgabala Hotan prefektūrā, Sjiņdzjanas štatā 2018. gada maijā. Paraugu ņemšanas laikā tika ievērots nejaušības princips, un tika atlasīti Cistanche tubulosa ziedi ar labu fizioloģisko stāvokli un nemainīgu augu augstumu. Pekinas Universitātes Farmācijas skolas profesors Tu Pengfei paņēma trīs Cistanche tubulosa celmus ar trim ziedu krāsām - baltu, sarkanu un purpursarkanu, un tos identificēja kā Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. Tie tika ātri sasaldēti šķidrā slāpeklī un pēc tam transportēti uz Pekinu sausā ledus krātuvē. Ķīmiski kompetentās E. coli DH5 šūnas tika iegādātas no Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., un E. coli BL21 (DE3) ķīmiski kompetentās šūnas tika iegādātas no Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektors tika iegādāts no Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonil-CoA tika iegādāts no Sigma Company, 4-kumaroil-CoA, naringenīns -halkons tika iegādāts no Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., un naringenīns tika iegādāts no Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.
1.2 Instrumenti
Nanodrop 2000C spektrofotometrs (Thermo Fisher Company, ASV); gradienta PCR instruments (Eppendorf Company, Vācija); CFX 96 fluorescences kvantitatīvais PCR instruments, UVP gēla attēlveidotājs, gēla elektroforēzes instruments, proteīnu elektroforēzes instruments (BioRad Company, ASV); EnSpire
Mikroplašu lasītājs (PerkinElmer Company, ASV); pastāvīgas temperatūras inkubators (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D lielas jaudas pilnas temperatūras oscilators (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82ūdens vannas nemainīgas temperatūras oscilators (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); AIRTECH īpaši tīrs darbagalds (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); augstspiediena tvaika sterilizators (ToMY Company, Japāna); Milli Q tīra ūdens instruments (Millipore, Amerikas Savienotās Valstis); LC-20Augstas efektivitātes šķidruma fāzes hromatogrāfs (Shimadzu Company, Japāna); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap augstas izšķirtspējas masas spektrometrija (Thermo Fisher Company, ASV); FV1200 lāzera konfokālais mikroskops (Olympus Company, Japāna).
2 Eksperimentālās metodes
2.1. RNS ekstrakcija un cDNS sintēze.
Cistanche tubulosa ziedi tika samalti šķidrā slāpeklī un pēc tam pakļauti RNS ekstrakcijas pārbaudei.
Kopējā RNS tika ekstrahēta, izmantojot komplektu (Norgen, Cat 17200), RNS koncentrācija un kvalitāte tika noteikta ar NanoDrop 2000C, un RNS paraugi ar A260/A280 attiecību no 1,8 līdz 2,1 tika atlasīti reversajai transkripcijai, lai sintezētu cDNS. M-MLV reversā transkriptāze (Promega, M170B) tika izmantota, lai reversi transkribētu kvalificēto kopējo RNS uz cDNS. Eksperimentālās darbības tika veiktas saskaņā ar instrukcijām.
2.2. CtCHS gēna klonēšana
Pamatojoties uz mūsu pētniecības grupas Cistanche tubulosa ziedu transkripta datiem [16], tika atlasīts CtCHS ar pilnu atvērtu nolasīšanas rāmi, un SnapGene programmatūra tika izmantota, lai izstrādātu specifiskus primerus, pamatojoties uz gēnu secību (1. PCR amplifikācija tika veikta, izmantojot Cistanche tubulosa ziedu cDNS kā veidni. Pastiprināšanas sistēma bija 2 × Phanta Max Buffer 25 μL, dNTPMix (10 mmol/L) 1 μL, augšpus un lejpus praimeri (10 μmol/L) katrs 2 μL, cDNS 2 μL, Phanta Max Super Fidelity DNS polimerāze, 1 μL. ddH2O 17 μL. Reakcijas apstākļi bija šādi: iepriekšēja denaturācija 95 grādu temperatūrā 3 minūtes; 25 denaturēšanas cikli 95 grādos 15 s, atkausēšana 55 grādos 15 s un pagarināšana 72 grādos 1 minūti; reakcijas pagarināšana 72 grādos 5 minūtes. PCR produkts tika noteikts ar 1% agarozes gēla elektroforēzi, un gēla atgūšanai tika izmantots DNS attīrīšanas komplekts (Novizan, Cat DC301-01), un pēc tam atgūtā DNS tika attīrīta ar ātrās klonēšanas komplektu (Novizan, Cat. C601-01). DNS fragments tika ligēts ar pCE2TA/Blunt-Zero vektoru, transformēts Escherichia coli DH5 kompetentās šūnās, un pēc kultivēšanas pa nakti 37 grādu temperatūrā tika atlasīti viena klona celmi un nosūtīti uzņēmumam sekvencēšanai.
1. tabula Praimeru secības
2.3. Bioinformātikas analīze
Izmantojiet ProtParam tiešsaistes programmatūru, lai analizētu olbaltumvielu fizikālās un ķīmiskās īpašības; izmantojiet Prot Scale tiešsaistes rīku, lai analizētu olbaltumvielu hidrofilitāti/hidrofobitāti; izmantot tiešsaistes rīku SOPMA, lai prognozētu olbaltumvielu sekundāro struktūru; izmantot tiešsaistes analīzes programmatūru SWISS-MODEL, lai prognozētu proteīna terciāro struktūru; izmantot tiešsaistes programmatūru TMHMM Prognozēt proteīna transmembrānu struktūru; izmantot DNAMAN programmatūru, lai salīdzinātu CtCHS homoloģiju ar citu sugu CHS aminoskābju sekvencēm; izmantojiet MEGA-X programmatūru, lai izveidotu filoģenētisku koku, izmantojot kaimiņu savienošanu (NJ) un Puasona korekciju. Evolūcijas attālums tiek aprēķināts, izmantojot Bootstrap metodi, un Bootstrap atkārtojumu skaits ir 1000 reizes.
2.4 CtCHS prokariotu ekspresija un attīrīšana
Izstrādājiet primerus ar restrikcijas vietām BamHⅠ un XhoⅠ, pamatojoties uz CtCHS secību, un PCR pastiprina atbilstošos mērķa fragmentus. pET-28a vektors un mērķa fragments tika sagremoti, izmantojot endonukleāzes BamHI un Klonētais celms tiek sekvencēts, un pēc pareizas sekvencēšanas tiek ekstrahēta plazmīda. PET-28a-CtCHS plazmīda, kas pārbaudīta ar sekvencēšanu, tika pārnesta uz Escherichia coli BL21 (DE3) kompetentajām šūnām. Skatiet Ding Ning et al. metodi. [17] ar izopropilu
-D-tiogalaktopiranozīds (IPTG) tika izmantots, lai izraisītu olbaltumvielu ekspresiju zemā temperatūrā, un tika attīrīts caur Ni2+ afinitātes hromatogrāfijas kolonnu (Cytiva, Cat 17531901). Olbaltumvielu koncentrēja, centrifugējot ultrafiltrācijas mēģenē (Millipore, 30 000), un atsāļoja. Uzglabāt 20 mmol/L KPB buferšķīdumā (pH 8,0, kas satur 1 mmol/LEDTA) un uzglabāt –80 grādu ledusskapī ilgstošai uzglabāšanai.
2.5 CtCHS enzīmu aktivitātes analīze
CtCHS enzīmu reakcijas sistēma: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonil-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-kumaroil-CoA 2 μL, CtCHS rekombinants olbaltumvielas 20 μL, in Pēc 12 stundu ilgas reakcijas ūdens vannā 37 grādu temperatūrā, maisījumu trīs reizes ekstrahēja ar 800 μL etilacetāta, žāvēja ar slāpekļa plūsmu un pēc tam izšķīdina 100 μL metanola. Lai noteiktu produktu, izmantojiet augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju. Nosacījumi ir Ultimate LP-C18 kolonna (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), kolonnas temperatūra 30 grādi, parauga tilpums 10 μL un ūdens (A) un acetonitrils (B) kā plūsma. Fāze, eluēšanas gradients: 0-10
min, 30% B; 10-20 min, 30%~60% B; 20-25 min, 60%~70% B; 25-30 min, 70%~80% B; 30–35 min, 80–100 % B; 35-40 min, 100% B; 40-46 min, 100%-30% B. Tilpuma plūsmas ātrums ir 1 ml/min, un noteikšana notiek pie viļņa garuma 290 nm.
Turpmākai noteikšanai tika izmantota UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Šķidrās fāzes apstākļi bija Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 kolonna (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), kolonnas temperatūra 40 grādi, naringenīna- halkona un naringenīna kontroles. Produkta iekraušanas tilpums ir 4 μL, un fermenta reakcijas produkta iekraušanas tilpums ir 7 μL. Kā kustīgo fāzi izmanto ūdeni (A)-acetonitrilu (B). Elucijas gradients ir: 0 līdz 5 min, 30% B; 5 līdz 15 min, 30 %-60% B; 15-20 min, 60%-100% B; 20-25 min, 100% B; 25-31 min, 100%-30% B. Tilpuma plūsmas ātrums ir 0,3 ml/min. Masu spektrometrijas apstākļi ir elektrosmidzināšanas jonu avots, slāpeklis kā nesējgāze, apvalka gāzes spiediens 3,5 MPa, palīggāzes spiediens 1,0 MPa, smidzināšanas spiediens 3500 V, kapilārā temperatūra 350 grādi, papildu gāzes sildīšanas temperatūra 200 grādi, pozitīvo un negatīvo jonu režīmi, skenēšana jonu diapazons m/z ir 100-1500, pilna MS izšķirtspēja ir 35 000, dd-MS2 izšķirtspēja ir 17 500, (N)
CE/pakāpju nce iestatīts uz 35, 60.
2.3. Bioinformātikas analīze
Izmantojiet ProtParam tiešsaistes programmatūru, lai analizētu olbaltumvielu fizikālās un ķīmiskās īpašības; izmantojiet Prot Scale tiešsaistes rīku, lai analizētu olbaltumvielu hidrofilitāti/hidrofobitāti; izmantot tiešsaistes rīku SOPMA, lai prognozētu olbaltumvielu sekundāro struktūru; izmantot tiešsaistes analīzes programmatūru SWISS-MODEL, lai prognozētu proteīna terciāro struktūru; izmantot tiešsaistes programmatūru TMHMM Prognozēt proteīna transmembrānu struktūru; izmantot DNAMAN programmatūru, lai salīdzinātu CtCHS homoloģiju ar citu sugu CHS aminoskābju sekvencēm; izmantojiet MEGA-X programmatūru, lai izveidotu filoģenētisku koku, izmantojot kaimiņu savienošanu (NJ) un Puasona korekciju. Evolūcijas attālums tiek aprēķināts, izmantojot Bootstrap metodi, un Bootstrap atkārtojumu skaits ir 1000 reizes.
2.4 CtCHS prokariotu ekspresija un attīrīšana
Izstrādājiet primerus ar restrikcijas vietām BamHⅠ un XhoⅠ, pamatojoties uz CtCHS secību, un PCR pastiprina atbilstošos mērķa fragmentus. pET-28a vektors un mērķa fragments tika sagremoti, izmantojot endonukleāzes BamHI un Klonētais celms tiek sekvencēts, un pēc pareizas sekvencēšanas tiek ekstrahēta plazmīda. PET-28a-CtCHS plazmīda, kas pārbaudīta ar sekvencēšanu, tika pārnesta uz Escherichia coli BL21 (DE3) kompetentajām šūnām. Skatiet Ding Ning et al. metodi. [17] ar izopropilu
-D-tiogalaktopiranozīds (IPTG) tika izmantots, lai izraisītu olbaltumvielu ekspresiju zemā temperatūrā, un tika attīrīts caur Ni2+ afinitātes hromatogrāfijas kolonnu (Cytiva, Cat 17531901). Olbaltumvielu koncentrēja, centrifugējot ultrafiltrācijas mēģenē (Millipore, 30 000), un atsāļoja. Uzglabāt 20 mmol/L KPB buferšķīdumā (pH 8,0, kas satur 1 mmol/LEDTA) un uzglabāt –80 grādu ledusskapī ilgstošai uzglabāšanai.
2.5 CtCHS enzīmu aktivitātes analīze
CtCHS enzīmu reakcijas sistēma: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonil-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-kumaroil-CoA 2 μL, CtCHS rekombinants olbaltumvielas 20 μL, in Pēc 12 stundu ilgas reakcijas ūdens vannā 37 grādu temperatūrā, maisījumu trīs reizes ekstrahēja ar 800 μL etilacetāta, žāvēja ar slāpekļa plūsmu un pēc tam izšķīdina 100 μL metanola. Lai noteiktu produktu, izmantojiet augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju. Nosacījumi ir Ultimate LP-C18 kolonna (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), kolonnas temperatūra 30 grādi, parauga tilpums 10 μL un ūdens (A) un acetonitrils (B) kā plūsma. Fāze, eluēšanas gradients: 0-10
min, 30% B; 10-20 min, 30%~60% B; 20-25 min, 60%~70% B; 25-30 min, 70%~80% B; 30–35 min, 80–100 % B; 35-40 min, 100% B; 40-46 min, 100%-30% B. Tilpuma plūsmas ātrums ir 1 ml/min, un noteikšana notiek pie viļņa garuma 290 nm.
Turpmākai noteikšanai tika izmantota UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Šķidrās fāzes apstākļi bija Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 kolonna (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), kolonnas temperatūra 40 grādi, naringenīna- halkona un naringenīna kontroles. Produkta iekraušanas tilpums ir 4 μL, un fermenta reakcijas produkta iekraušanas tilpums ir 7 μL. Kā kustīgo fāzi izmanto ūdeni (A)-acetonitrilu (B). Elucijas gradients ir: 0 līdz 5 min, 30% B; 5 līdz 15 min, 30 %-60% B; 15-20 min, 60%-100% B; 20-25 min, 100% B; 25-31 min, 100%-30% B. Tilpuma plūsmas ātrums ir 0,3 ml/min. Masu spektrometrijas apstākļi ir elektrosmidzināšanas jonu avots, slāpeklis kā nesējgāze, apvalka gāzes spiediens 3,5 MPa, palīggāzes spiediens 1,0 MPa, smidzināšanas spiediens 3500 V, kapilārā temperatūra 350 grādi, papildu gāzes sildīšanas temperatūra 200 grādi, pozitīvo un negatīvo jonu režīmi, skenēšana jonu diapazons m/z ir 100-1500, pilna MS izšķirtspēja ir 35 000, dd-MS2 izšķirtspēja ir 17 500, (N)
CE/pakāpju nce iestatīts uz 35, 60.
2.6. CtCHS proteīna subcelulāra lokalizācija
Pamatojoties uz CtCHS secību un bezšuvju klonēšanas principu, tika izstrādāti primeri ar enzīmu griešanas vietām Kpn Ⅰ un BamH Ⅰ, un atbilstošie mērķa fragmenti tika pastiprināti ar PCR. pCAMBIA1300-35S-GFP plazmīda tika sagremota ar restrikcijas endonukleāzēm Kpn Ⅰ un BamH Ⅰ, un mērķa fragments un vektors tika savienoti, izmantojot bezšuvju klonēšanas komplektu (Novizan, Cat C115-01), un pēc tam tika pārnesti. E. coli DH5 kompetentajās šūnās. , atlasiet viena klona celmus sekvencēšanai un ekstrahējiet plazmīdas no pareizajiem celmiem. Plazmīdas pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS un pCAMBIA 1300-35S-GFP tika pārveidotas Arabidopsis thaliana protoplastos, izmantojot PEG4000, un kultivētas vājā apgaismojumā 8 līdz 10 stundas. CtCHS proteīna subcelulārā lokalizācija tika novērota ar lāzera konfokālo mikroskopu.
2.7 CtCHS izteiksmes modeļa analīze
Reālā laika fluorescējošie kvantitatīvie primeri tika izstrādāti, izmantojot DNAMAN, pamatojoties uz CtCHS secību, ar F-box kā iekšējo atsauces gēnu. Praimeru secības ir parādītas 1. tabulā. CtCHS relatīvā ekspresija dažādu krāsu Cistanche tubulosa ziedos tika noteikta ar reāllaika fluorescējošu kvantitatīvu PCR. Izmantojiet TransStart Green qPCR SuperMix (pilnzelts, AQ101-02), lai mērītu ar SYBRGreen fluorescējošās krāsas metodi. Reakcijas sistēma: 2×TransStartGreen qPCR SuperMix 5 μL, augšpus un lejpus praimeri (10 μmol/L) 0,2 μL katrs, cDNS veidne 0,5 μL, tika izmantots 4,1 μL ūdens bez nukleotidāzes reakcijai, izmantojot divpakāpju metodi. Reakcijas procedūras pamatā bija Dong Xianjuan et al. [18]. Katrs paraugs saturēja 3 bioloģiskos atkārtojumus, un eksperiments tika atkārtots trīs reizes. Eksperimentālie dati tika analizēti, izmantojot programmu Excel, CtCHS relatīvā izteiksme tika aprēķināta, izmantojot 2-ΔΔCt metodi, un GraphPadPrism 8 tika izmantots, lai veiktu nozīmīguma analīzi un zīmētu histogrammas.
