No Cistanche Deserticola izolēto oligosaharīdu sastāva analīze un imunoloģiskās aktivitātes

Kontaktpersona: emily.li@wecistanche.com

Abstrakts.Oligosaharīds (CDOS) tika iegūts noCistanche deserticolaar sārmu (pH{0}}) ekstrakciju, etanola izgulsnēšanu un frakcionēšanu divās attīrītās frakcijās (ti, CDOS-1 un CDOS-2) ar Sephadex G-100 un Sephadex G-25 kolonnas filtrēšanas hromatogrāfiju. CDOS monosaharīdu sastāvs tika pārbaudīts ar augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju (HPLC). Tika konstatēts, ka CDOS-1 sastāvēja tikai no saharozes un CDOS-2 galvenokārt sastāvēja no saharozes, ramnozes un mannīta ar molu attiecību 1:0,73:3,61. Imunoloģiskie testi liecināja, ka CDOS būtiski ietekmēja peles liesas indeksu, palielinot makrofāgu fagocitozes aktivitāti un stimulējot antivielas ražojošo šūnu proliferāciju. Ir cerība, ka CDOS tiks pārveidots par funkcionālu pārtiku vai zālēm.

Atslēgvārdi:Cistanchedeserticola, oligosaharīds, attīrīšana, sastāvs, imunoloģiskās aktivitātes.

Cistanche deserticola ir daudz efektu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

1. Ievads

Cistanchedeserticola YCMa. (Orobanchaceae dzimta) ir īss parazītiskais augs, kura dzimtene ir Ķīnas ziemeļrietumi. Visu žāvēto augu (bez ziediem) sauc par toniku un sauc par "Rou Congrong". Austrumu medicīnā tas tiek klasificēts kā salds un sāļš pēc garšas, pēc būtības silts, un tas ir saistīts ar nieru un resnās zarnas kanāliem. funkcijauzmundrinošsuznieresun esences papildināšana, zarnu mitrināšana un zarnu relaksācija [1]-[3]. Mūsdienu farmakoloģiskais pētījums parādīja, ka tas var veicināt DNS sintēzi un aizkavēt senilitātes procesu, palielināt antioksidantu [4], novērst un ārstēt sirds un asinsvadu slimības [3]. Turklāt tas varētu izraisīt arī pretsāpju unanti-iekaisumaietekme [5], uzlabo mācīšanos un atmiņu, izraisot nervu augšanas faktorus [6]. Daži pētījumi norādīja, ka C. deserticola ekstrakti var aktivizēt intraabdominālo makrofāgu fagocītisko funkciju pelēm [7]-[9] unuzlabotķermenis's imunitāte[10]. Saskaņā ar iepriekšējiem pētījumiem šis augs satur vairākas aktīvās sastāvdaļas, tostarp feniletanoīdu glikozīdus, iridoīdus, lignānus, saharīdus, alkaloīdus utt. [11] Kā C.deserticolafeniletanoīdsglikozīdiun polisaharīdi ir atzīti par galvenajiem aktīvajiem komponentiem, daudzi pētījumi ir vērsti uz to struktūrām un bioaktivitāti pēdējo desmitgažu laikā [12]-[17]. Kas attiecas uz vērtīgajiem oligosaharīdiemC. deserticola, pārskati ir diezgan ierobežoti. Oligosaharīdi, īsas ķēdes saharīdi, kas satur homo- vai heterocukurus, ir labi zināmi ar savu labvēlīgo ietekmi uz cilvēka dzīvi, un tie ir plaši izmantoti jau ilgu laiku [18]. Funkcionālie oligosaharīdi, kuriem ir fizioloģiska funkcija, piemēram, zema kariogenitāte un bifidobaktēriju augšanas faktors [19], uzlabo cilvēku un dzīvnieku veselību. Tie ir izmantoti kā pārtikas sastāvdaļa. Nesen tika ziņots par jaunām oligosaharīdu funkcijām, kas spēj modulēt cilvēku, dzīvnieku un zivju imūnsistēmu [20]. Šajā rakstā mēs ziņojam par pētījuma programmas rezultātu pirmo daļu, frakcionēšanu. kopējo oligosaharīdu daudzumu, kas iegūts no C. deserticola sārmu ekstrakta, kombinējot ultrafiltrāciju un gēla caurlaidības hromatogrāfiju, un to sastāva analīzi ar augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju (HPLC). Turklāt mēs piedāvājam arī C. deserticola oligosaharīdu imunoloģiskās aktivitātes. Cik mums zināms, ir publicēti daži ziņojumi par imūnstimulējošās aktivitātes pētījumiemC. deserticolaoligosaharīdi.

2. Eksperimentāls

2.1. Materiāli

C. deserticola tika kultivēta un savākta no Alxa League (Iekšējā Mongolija, Ķīna). Kunmingas peles (GradeII, sešas nedēļas vecas) tika iegādātas no Iekšējās Mongolijas universitātes Farmakoloģijas eksperimentālā centra. Sephadex G-100,Sephadex G-25, trifluoretiķskābe (TFA), 1-fenil-3-metil-5- pirazolons (PMP), D-glikoze, D- galaktoze, D-fruktoze, D-ksiloze, D-mannoze, D-galakturonskābe, D-glikuronskābe, saharoze, ramnoze, mannīts, fukoze, ramnoze tika iegādātas no Sigma (St. Louis, MO, ASV). Vidējs RPMI{12}} tika iegādāts no Gibco Invitrogen Co. (Sandjego, Kalifornija, ASV). Visas pārējās ķīmiskās vielas bija analītiskas kvalitātes.

2.2. Oligosaharīdu ekstrakcija

Žāvētos C. deserticola ķermeņus sagriež mazākos gabaliņos un tālāk dzirnavās samala pulverī, ekstrahēja ar bezūdens etanolu (3×5000 ml) 70 grādu temperatūrā 3 stundas atmosfēras spiedienā. Lai noņemtu lipīdus, tika fiksēts atteces dzesinātājs. Atlikušo atlikumu pēc tam ekstrahēja ar sārmu (pH=10) 60 grādos 3 reizes (2 stundas katru reizi). Pēc centrifugēšanas (2000 g 15 minūtes, 20 grādos) supernatants tika koncentrēts līdz vienai desmitajai daļai no tilpuma rotācijas iztvaicētājā pazeminātā spiedienā 50 grādos un filtrēts. Pēc tam filtrāts tika deproteinizēts, izmantojot Sevag reaģentu [21], un atkrāsots ar aktīvo ogli.

2.3. Oligosaharīdu izolēšana un attīrīšana

Liofilizētie oligosaharīdi tika izšķīdināti destilētā ūdenī, centrifugēti, un pēc tam supernatants tika attīrīts ar Sephadex G -100 kolonnu (1 × 50 cm), kas līdzsvarots ar īpaši tīru ūdeni. Pēc parauga ievietošanas kolonnu eluēja ar īpaši tīru ūdeni ar plūsmas ātrumu 5 ml/min. Izmantojot mēģenes, tika savāktas dažādas frakcijas. Kopējais ogļhidrātu saturs katrā mēģenē tika mērīts pie 490 nm ar fenola-H2SO4 metodi [22]. Ar ūdeni eluētais šķīdums tika sadalīts divās frakcijās: CDOS{10}} un CDO-2. Attiecīgi divas frakcijas tika tālāk attīrītas Sephadex G-25 kolonnā (2,7 × 85 cm), izmantojot īpaši tīru ūdeni (ar plūsmas ātrumu 1 ml/min). Pēc attīrītās frakcijas savākšanas tā tika liofilizēta.

2.4. Monosaharīdu sastāva analīze

CDO monosaharīdu sastāvs tika iegūts ar HPLC analīzi. CDO (2 mg) vispirms hidrolizēja ar bezūdens metanolu, kas satur 2 M HCl, 80 grādu temperatūrā 16 stundas slāpekļa atmosfērā un pēc tam ar 2 M TFA 120 grādu temperatūrā 1 stundu. Pēc tam, kad TFA tika noņemts, iztvaicējot, hidrolizāti pēc tam tika atvasināti ar PMP saskaņā ar ziņoto metodi [23] un analizēti ar HPLC. HPLC atdalīšana tika veikta ar EF-2002 HPLC sistēmu (KNAUER uzņēmums, Vācija). PMP atvasinājumi tika hromatografēti, izmantojot Sugar-PAK tilpumu (6,5 × 300 mm, ūdens kompānijas glāzes, Amerika), un absorbcija tika mērīta pie 245 nm. Injekcijas tilpums bija 20 µL, un kustīgā fāze, kas sastāvēja no PBS (šķīdinātājs A) un acetonitrila (šķīdinātājs B), tika izmantota izokrātiskai eluēšanai ar tilpuma attiecību no 82 procentiem (A) līdz 18 procentiem (B). Kopējais HPLC darbības laiks bija 40 minūtes, un plūsmas ātrums bija 0,5 ml/min.

2.5. Imunobioloģiskās aktivitātes

2.5.1. Monocītu-makrofāgu fagocītiskā funkcija

Sešdesmit Kunmingas peles (GradeII, sešas nedēļas vecas) tika iegādātas no Iekšējās Mongolijas universitātes Farmakoloģijas eksperimentālā centra un pirms lietošanas tika aklimatizētas 1 nedēļu. Visas peles tika nejauši sadalītas četrās grupās, kas sastāvēja no fizioloģiskā šķīduma kontroles grupas, augstu CDO devu grupas, mērenu devu grupas un zemu CDO devu grupas. Pelēm vienu reizi dienā 5 dienas intraperitoneāli injicēja 0,5 ml oligosaharīdu šķīduma. Lielu, vidēju vai zemu CDO devu grupa saņēma attiecīgi 10{{10}}, 50 vai 25 mg/kg/BW CDO; un kontroles grupā tika injicēts 0,5 ml fizioloģiskā šķīduma. Septītajā dienā saskaņā ar Hou [24] tika veikts oglekļa daļiņu attīrīšanas eksperiments, un tika izmērīts liesas indekss un aizkrūts dziedzera indekss. Īsumā, 0, 05 ml / 10 g / bw Indijas tinte tika ievadīta katrai pelei caur vena caudalis, pēc tam 3 un 7 minūtes pēc injekcijas no vena orbitalis posterior tika iegūti 20 μL asiņu. Asins paraugi tika ievietoti mēģenēs ar 2 ml 0,1% Na2CO3, un OD vērtības tika mērītas pie 600 nm. Klīrensa indekss (K), fagocītiskais indekss ( ) un imūno orgānu indekss tika aprēķināts šādi (1), t2 un t1 nozīmē attiecīgi 7 minūtes un 3 minūtes.

2.5.2. Antivielas ražojošo šūnu proliferācija

Kunmingas peļu grupas (piecas katrā grupā) tika imunizētas, intraperitoneāli injicējot 2 x 107 SRBC 1,0 ml PBS, kam pievienoti 50 ug testa materiālu (kontrolē nebija neviena). Nedēļu vēlāk splenocīti (106 šūnas uz 2 ml vienā iedobē) no Kunmingas pelēm tika kultivēti ar testa materiāliem vai bez tiem 72 stundas 10% RPMI 1640 barotnē ar 5% CO2 gaisā, trīs eksemplāros katrai kultūrai. Tika noteikts PFC skaits pret SRBC uz 106 splenocītiem [25], [26].

2.6. Statistiskā analīze

Dati tika izteikti kā vidējās vērtības ± SD. Atšķirība starp pārbaudītajām grupām un kontroli tika analizēta ar Stjudenta t-testu. P < 0.05="" tika="" uzskatīts="" par="">

3. Rezultāti un diskusijas

3.1. Oligosaharīdu izolēšana un attīrīšana

CDO tika izolēti no sārmu ekstrakta no žāvētiem C. deserticola ķermeņiem ar iznākumu 3.07 procenti. Divas CDOS-1 un CDOS-2 frakcijas tika izolētas no destilēta ūdens eluāta attiecīgi ar Sephadex G-100 kolonnu (1. att.). Attīrītās CDOS-1 un CDOS-2 frakcijas Sephadex G-25 kolonnā uzrādīja vienu maksimumu, kas norāda, ka paraugā nebija citu oligosaharīdu. Monosaharīdu kompozīciju rezultāti parādīja, ka CDOS-1 sastāvēja tikai no saharozes (2. att.) un CDOS-2 galvenokārt sastāvēja no saharozes, ramnozes un mannīta (3. att.) ar molu attiecību. no 1:0,73:3,61.

3.2. CDO imūnbioloģiskās aktivitātes

Daudzi in vivo un in vitro pierādījumi liecina, ka dabīgajiem oligosaharīdiem ir imūnmodulējoša funkcija, stimulējot gan šūnu, gan humorālo.imūns atbildes[27], [28]. Šajā rakstā 100 mg/kg/BW CDO palielināja peles liesas indeksu, bet nebija būtisku atšķirību aizkrūts dziedzera indeksā starp ārstētajām grupām un kontroles grupām (1. tabula). Makrofāgi ir svarīga saimnieka aizsardzības pret vīrusu infekciju sastāvdaļa, kavējot vīrusu intracelulāro replikāciju un nogalinot ar vīrusu inficētās šūnas [29]. Aktivizējot, no makrofāgiem izdalās dažādi skābekļa vai slāpekļa starpprodukti un citokīni, kas piedalās dažādās svarīgās bioloģiskās funkcijās, piemēram, pretiekaisuma un pretaudzēju aktivitātēs [30]-[32]. Tāpēc makrofāgu fagocītiskā aktivitāte ir svarīgs organisma imūno funkciju rādītājs. Šajā pētījumā mērenas un lielas CDO devas palielināja makrofāgu fagocitozes aktivitāti (1. Antivielas ražojošo šūnu proliferācija, ko izraisa CDO, tika pētīta, pārbaudot hemolītiskā PFC palielināšanos Kunmingas peļu liesās, kuras tika imunizētas ar SRBC un testa paraugu. Rezultāti liecināja, ka mērenas un lielas CDO devas ievērojami uzlabo antivielas ražojošo šūnu proliferāciju (2. Lielas CDO devas izraisīja ļoti nozīmīgu PFC skaita pieaugumu (P <>

Atsauces

[1] J. Li, Y. Jiang, R. Fan. Jauktu bioloģisko signālu atpazīšana, pamatojoties uz viļņu analīzi. In: Y. Jiang, et al (eds). Proc. Apvienotās Karalistes un Ķīnas sporta inženieru darbnīca. Liverpūle: Pasaules akadēmiskā savienība. 2007, 1-8. lpp.

[2] J. Ouyang, XD Wang, B. Zhao u.c. Retzemju elementu ietekme uz Cistanche deserticola šūnu augšanu un feniletanoīdu glikozīdu ražošanu. JB io-technol, 2003, 102 (2): 129-134

[3] Xu Zhaohui, Yang Junshan, Lu Ruimian u.c. Jauns dabīgs produkts no Cistanche deserticola YCMA. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 1999, 8(2):61-63.

[4] X. Vangs, L. Li, Muhujati, X. Vanags, N. Du. Cistanche glikozīdu antioksidatīva iedarbība peļu audos. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1998, 23(9):554-5.

[5] Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CRANantinociceptīva un pretiekaisuma darbība, ko grauzējiem izraisa Cistanche deserticola. J Etnofarmakols. 2002, 83(3):177-82.

[6] Choi, JG; Mēness, M; Jeong, HU; Kims, MC; Kima, SY; Ak, MS Cistanches Herba uzlabo mācīšanos un atmiņu, izraisot nervu augšanas faktoru. Uzvedības smadzeņu izpēte. 2011, 216 (2): 652–8.

[7] Zong G, He W, Wu G, Chen M, Shen X, Shi M. Cistanche deserticola YC Ma un C, tubulosa (Shenk) Wight salīdzinājums par dažām farmakoloģiskajām darbībām. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1996, 21(7):436-7.

[8] He W, Shu XF, Zeng GZ u.c. Pētījums par C. deserticola dzimumspējas uzlabošanu. J Chin Med.1996, 21(9): 534- 537.

[9] Zeng GZ, He W, Wu GL u.c. Cistanche deserticola YC Ma un C.tubulosa svara salīdzinājumi attiecībā uz dažām farmakoloģiskām darbībām. J Chin Med. 1996, 21(7): 436-438.

[10] Zeng QL, Zheng YF, Lu ZL Cistanche deserticola YC Ma polisaharīda imūnmodulējošā iedarbība. J Zhejiang Univ, Med Sci. 2002, 31(4): 284- 287.

[11] Li Yuan, Song Yuanyuan, Zhang Hongquan. Sasniegumi Cistanche ķīmisko sastāvdaļu un ārstnieciskās darbības izpētē. Ķīnas savvaļas augu resursi, 2010, 29(1):7-11.

[12] Du NS, Wang H, Yi YH. Feniletanoīdu glikozīdu izolēšana un identificēšana no Cistanche deserticola. Nat Prod R&D, 1993, 5(4): 5- 8.

[13] Lu NS, Liu JL Feniletanoīdu glikozīdu noteikšana Cistanche deserticola ar makroretikulāro sveķu spektrofotometriju. Nat Prod R&D, 1993, 5(3): 30-33.

[14] Xiong QB, Tezuka Y, Kaneko T u.c. Slāpekļa oksīda inhibīcija ar feniletanoīdiem aktivētos makrofāgos.

European Journal of Pharmacology, 2000, 400: 137- 144.

[15] Zhao Wei, Yan Hong, Liang Zhong-Yan u.c. Ūdenī šķīstošā polisaharīda SPA, kas izolēts no Cistanche Deserticola Ma stumbra, strukturālā analīze. Chemical Journal of Chinese Universities, 2005, 26(3):461-463.

[16] Van Sjaņjans. Pētījums par Cistanche deserticola polisaharīdu imūnfarmakoloģiju un absorbcijas raksturu. 2011, Nr.S1, Medicīna un veselības zinātnes, E057-235-1-70.

[17] Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. Hepatoprotective activity of phenylethanoids from Cistanche deserticola. Planta Med. 1998, 64(2):120-5.

[18] Handbook of Amylases and Related Enzymes (Japānas Amilāzes pētniecības biedrības red.), Pergamon Press (1988)

[19] Araya, S. (red.) Proceedings of the 5th Conference on Dental Caries and Coupling Sugar (japāņu valodā), Nacionālais veselības institūts, Tokija (1980)

[20] Kodo Otaka. Funkcionālais oligosaharīds un tā jaunais aspekts kā imūnmodulācija. J. Biol. Macromol. 2006, 6(1), 3-9.

[21] Navarini L, Gilli R, Gombac V, Abatangelo A, Bosco M, Toffanin R. Polisaharīdi no grauzdētu Coffea arabica pupiņu karstā ūdens ekstraktiem: izolēšana un raksturojums. Ogļhidrāti. Polym.1999, 40:71–81.

[22] Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Kolorimetriskā metode cukuru un saistīto vielu noteikšanai. Anal. Chem. 1956, 28:350–356.

[23] Yang X, Zhao Y, Wang Q, Wang H, Mei Q. Angelica polisaharīdu monosaharīdu komponentu analīze ar augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju. Anal Sci. 2005, 21:1177–1180.

[24] Yufang Hou, Yubao Hou, Liu Yanyan u.c. Lektīna ekstrakcija un attīrīšana no sarkanajām pupiņām un lektīna un četru ķīniešu augu polisaharīdu sākotnējie imūnfunkciju pētījumi. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2010:1-9.

[25] Cunningham, AJ un A. Szenberg. Turpmāki uzlabojumi plāksnīšu tehnikā atsevišķu antivielu veidojošo šūnu noteikšanai. Immunology.1968, 14:599-600.

[26] Haruhiko Takada, Tomohiko Ogava, Fuminobu Jošimura u.c. No Fusobacterium nucleatum ATCC 10953 [J] izolētas porīna frakcijas imūnbioloģiskās aktivitātes. Infekcija un imunitāte. 1988, 56(4): 855-863.

[27] Wang MQ, Guilbert LJ, Ling L, Li J, Wu YQ, Xu SR, Pang P, Shan JJ CVT-E002 imūnmodulējošā darbība: patentēts ekstrakts no Ziemeļamerikas žeņšeņa (Panax quinque folium). J Pharm Pharmacol.2001, 53:1515–1523.

[28] Nergard CS, Kiyohara H, Reynolds JC, Thomas-Oates JE, Matsumoto T, Yamada H, Patel T, Petersen D, Michaelsen TE, Diallo D, Paulsen BS Trīs mitogēno un komplementu fiksējošo struktūru un struktūras-aktivitātes attiecības pektīna arabinogalaktāni no Mali pretčūlu augiem Cochlospermum tinctorium A. Rich un Vernonia kotschyana Sch Bip. bijušais Volps. Biomakromolekulas. 2006, 7:71–79.

[29] E.-M. Choi, A.-J. Kima, Y.-O. Kima un Dž. K. Hwang, Arabinogalaktāna un fukoidāna imūnmodulējošā aktivitāte in vitro. Medicīniskās pārtikas žurnāls. 2005, 8(4):446–453.

[30] Y. Chen, J.-A. Duan, D. Qian, et al. Četru Angelica Sinensis ūdenī šķīstošo frakciju imūnregulācijas aktivitātes novērtējums un salīdzinājums in vitro uz peritoneālajiem makrofāgiem ICR pelēm. Starptautiskā imūnfarmakoloģija. 2010, 10:422–430.

[31] YS Lee, OK Han, CW Park u.c. Ar ūdeni ekstrahētā Astragali radix iekaisuma citokīnu gēnu ekspresija un slāpekļa oksīda regulēšana RAW 264.7 makrofāgu šūnās. Etnofarmakoloģijas žurnāls. 2005, 100(3): 289–294.

[32] KY Lee un YJ Jeon. Polisaharīds, kas izolēts no Poria cocos sclerotium, izraisa NF-κB / Rel aktivāciju un iNOS ekspresiju peles makrofāgos. Starptautiskā imūnfarmakoloģija. 2003, 3(10-11): 1353–1362.