Alox15 dzēšana uzlabo nieru disfunkciju un kavē fbrozi, palielinot PGD2 nierēs
Mar 12, 2022
CISTANČE UZLABOS NIeru/NIeru INFEKCIJU
Ievads
Polinepiesātinātās taukskābes (PUFA) un to metabolīti ir saistīti ar iekaisumu un tā izzušanu vairākos orgānos [1]. Oksilipīni, kas rodas, oksidējoties PUFA, ir svarīgi PUFA bioloģiskajai aktivitātei kā lipīdu mediatori [1, 2]. Oksilipīnu biosintēzi veicina vairāki enzīmi, piemēram, lipoksigenāze (LOX), ciklooksigenāze (COX) un citohroms P450 (CYP) [3]. Šie fermenti ražo vairākus lipīdu metabolītus, piemēram, prostaglandīnus, leikotriēnus un lipoksīnus, kas visi ir ļoti iesaistīti iekaisuma regulēšanā [1, 4]. Piemēram, ALOX15, galvenajam LOX apakštipam, ar tā metabolītiem ir divējāds pretiekaisuma un pretiekaisuma īpašību aspekts [5]: ALOX15 ir ļoti izteikts eozinofilos, bronhoalveolārajās epitēlija šūnās un alveolārajos makrofāgos nepatoloģisku apstākļu apstākļos [5, 6]. ], kā arī veicina astmas [7], plaušu traumas [8] un sirds mazspējas [9] smagumu, savukārt tas novērš iekaisumu artrīta [10] un išēmisku smadzeņu [11] gadījumā. Turklāt lipīdu mediatori un to fermenti ietekmē orgānu fibrozi, kā arī iekaisumu. Specifiski lipīdu mediatori ir iesaistīti plaušu [12], aknu [13] un sirds [14] fibrozes patoģenēzē. Tāpat iepriekš minētais ALOX15 ir saistīts arī ar fibrozes, piemēram, ādas fibrozes, patoģenēzi [15].
Viena no izplatītākajām hroniskām slimībām ir hroniska nieru slimība(CKD), kas skar aptuveni 8–16 procentus no kopējās populācijas visos posmos kopā [16]. Lai gan HNS patoģenēze ir sarežģīta un atšķiras atkarībā no pamatslimības,nieresaudi parasti kļūst disfunkcionāli, izraisot beigu stadijunieru mazspējako izraisa hronisks iekaisums un sekojoša fibroze [17]. Kā minēts, lipīdu mediatori, kas iegūti no PUFA, ir cieši saistīti ar iekaisumu un tā izraisīto fibrozi. Piemēram, lipoksīni un resolvīni inhibē nieru fibrozi [18, 19], bet šie efekti vēl nav pārbaudīti HNS modelī ar traucējumiem.nieru darbība.Turklāt visaptveroši lipidomiskie profili CKDnieresaudi joprojām nav reģistrēti. Tādējādi lipīdu metabolisma enzīmu un to produktu loma CKD patoģenēzē joprojām ir slikti izprotamaŠī pētījuma mērķis bija noskaidrot taukskābju metabolizējošo enzīmu un to produktu iesaistīšanosnierutraucējumi 5/6 nefrektomizētām (Nx) CKD modeļa pelēm. Šis pētījums atklāja, ka gan Alox15 transkripcijas, gan proteīna ekspresijas līmenis tika paaugstināts CKDnieres, un Alox15−/− pelēm uzrādīja uzlabojumusnieresdisfunkcija un fibroze CKD modelī. Turklāt PGD2, kas ir palielināts lipīdu metabolīts CKDnieresAlox15-/- pelēm, inhibēja epitēlija-mezenhimālo pāreju (EMT) proksimālajās cauruļveida kultivētajās šūnās. Tāpēc Alox15 inhibīcija un/vai PGD2 ievadīšana varētu būt jauns HNS un fibrozes terapeitiskais mērķis.
Atslēgvārdi:hroniska nieru slimība; Lipoksigenāze; ALOX15; Mediatora lipidomika; Polinepiesātinātās taukskābes; nieru
CISTANČE UZLABOS NIeru/NIeru FUNKCIJU
materiāli un metodes
Dzīvnieki un eksperimentiŠajā pētījumā tika izmantoti 8-nedēļu veci C57BL/6 J peles tēviņi (CLEA, Japāna), kas tika aklimatizētas 1 nedēļu pirms visu eksperimentu veikšanas. Turklāt Alox15-/- peles tika ģenerētas C57BL/6 J fonā (Jackson Laboratory), un 5/6 Nx modelis tika izveidots saskaņā ar iepriekšējo pētījumu [20]. Mēs savācām asins paraugus novērtēšanainieru funkcijaunnieresaudu paraugi imūnblotēšanai un polimerāzes ķēdes reakcijai 8 nedēļas pēc 5/6 Nx un histoloģiskai analīzei 40 nedēļas pēc 5/6 Nx. Visi eksperimenti atbilda TMDU dzīvnieku pētījumu vadlīnijām, un TMDU Dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja apstiprināja mūsu pētījuma protokolu (apstiprinājuma numurs: A2019-117C4).
LC–MS/MS balstīta mediatora lipidomikaMēs veicām LC-MS/MS analīzi, kā aprakstīts iepriekš [21, 22]. Sīkāka informācija par procedūru ir aprakstīta sadaļā Papildu metodes,Citas eksperimentālās metodesCitas eksperimentālās metodes mēs aprakstījām sadaļā Papildu metodes.
Rezultāti
Alox15 mRNS līmenis ir palielinājies 5/6 Nx nierēsOksilipīna enzīmu kvantitatīvās izmaiņas CKDnierestika pētītas, fiktīvai operācijai izmantojot C57BL/6 peles vai 5/6 Nx, kā aprakstīts iepriekš [20]. Lai analizētu galveno oksilipīna enzīmu ekspresiju nierēs (Alox15, Alox5, Ptgs1 (COX1), Ptgs2 (COX2), Cyp4a12 un Cyp2c44) [23, 24], mēs ekstrahējāmnieresparaugi. Starp fermentiem Alox15 5/6 Nxnieresbija ievērojami paaugstināts mRNS līmenis (P=0.0004), salīdzinot ar fiktīvu līmeninieres(1. att.). Un otrādi, citu galveno enzīmu mRNS līmenis šajā CKD modelī būtiski nemainījās.
Alox15 proteīna līmenis tika paaugstināts nieru proksimālajās kanāliņu šūnās5/6 Nxnieres, tika paaugstināts arī ALOX15 proteīna līmenis (P=0.0078), kā to paredzēja paaugstināts transkripcijas līmenis (2.a attēls). Lai noteiktu, kuri šūnu veidi ir palielinājuši Alox15 proteīna līmeni CKDnieres,mēs pārbaudījām Alox15 mRNS lokalizāciju, izmantojot in situ hibridizāciju. In situ hibridizācija ar mRNS atklāja, ka Alox15 augstais ekspresijas līmenis tika lokalizētsnierutubulārās šūnas 5/6 Nx modelī, bet ne glomerulos (2.b att.). Histoloģiskās pazīmes liecināja, ka Alox15 mRNS bija spēcīgi izteikta proksimālajās kanāliņos.
Alox15−/− peles bija izturīgas pret nieru bojājumiem un fibrozi 5/6 Nx modelī5/6 Nx CKDnieres, ALOX15 transkripcijas un olbaltumvielu ekspresijas līmenis bija paaugstināts. Tāpēc mēs pētījām, vai un kā ALOX15 spēlē lomu CKD ziņānieresdisfunkcija un nieru fibroze. Šim nolūkam Alox15-/- peles tika izmantotas 5/6 Nx CKD modelim. Interesanti, ka Alox15−/−5/6 Nx pelēm Cre seruma un asins urīnvielas slāpekļa (BUN) līmenis bija zemāks.
nekā savvaļas tipa (WT) pelēm (3.a att.), kas norāda, ka Alox15 izsīkums uzrādīja aizsargājošu efektu CKD patoģenēzē. Attiecīgi NGAL (anieru bojājumimarķieris) olbaltumvielu ekspresija tika nomākta Alox15-/- pelēm, salīdzinot ar WT pelēm (3.b att.). Turklāt Alox15−/− pelenieresuzrādīja samazinātu Col1a1, Fn un Acta2 (SMA) mRNS līmeni (3.c att.), kā arī uzrādīja samazinātu fibronektīna un SMA proteīna ekspresiju (3.d attēls). Turklāt Alox15−/− pelenieresuzrādīja skaidri nomāktas intersticiālas fibrotiskas izmaiņas, kas parādītas Masona trihroma krāsojumā (3.e attēls). Tāpēc Alox15 dzēšana uzlabojasnieresdisfunkcija un fibroze CKD dzīvnieku modelī.
Mediatoru lipidomika atklāja izmainītu PUFA metabolismu Alox15-/- CKD nierēsKā minēts šī raksta ievada sadaļā, Alox15 bioloģiskā ietekme ir saistīta ar Alox15 radītajiem lipīdu mediatoriem. Lai noskaidrotu Alox15 ražoto lipīdu metabolītu profilu HNSnieres,mēs pārbaudījām un salīdzinājām fiktīvu un 5/6 Nxnieresparaugi ar LC-MS / MS balstītu mediatoru lipidomiku, lai noteiktu lipīdu mediatoru profilus starp WT pelēm un Alox15 - / - CKD pelēm (1. papildu tabula). 1. tabulā parādīti lipīdu metabolīti, kas būtiski atšķiras starp Alox15 plus/plus un Alox15−/− pelēm 5/6 Nx apstākļos. Turklāt mēs izveidojām lipīdu mediatoru ceļu kartes ar klasifikāciju pēc to substrātiem un to metabolizējošiem enzīmiem (4. att.). Vairāki Alox{10}}atvasināti PUFA metabolīti, piemēram, 14-HDoHE, 17-HDoHE un 15-HEPA [5, 25–27], tika būtiski palielināti HNS modeļos, kas korelēja. labi līdz paaugstinātam ALOX15 ekspresijas līmenimnieres (P=0.0018, 0.0008,<0.0001, respectively),="" and="" their="" elevations="" under="" ckd="" conditions="" were="" completely="" suppressed="" in="" alox15−/−="" mice="" (fig. 5).="" besides="" 14-hdohe,="" 17-hdohe,="" and="" 15-hepa,="" the="" levels="" of="" 18-hepa,="" 10-hdohe,="" 11-hdohe,="" 13-hdohe,="" 16-hdohe,="" and="" dgla="" were="" also="" significantly="" decreased="" in="" alox15−/−="" ckd="">nieressalīdzinot ar WT CKD nierēm, turpretim tikai PGD2 bija ievērojami palielināts Alox15−/− CKD nierēs (6. att.).
PGD2 nomāca EMT kultivētās nieru šūnāsLipīdu metabolītu iedarbība, kas bija būtiski atšķirīga starp Alox15 plus/plus un Alox15−/− pelēm 5/6 Nx stāvoklī, tika pārbaudīta, ievadot šos lipīdus NRK-52E šūnām, kuras aktivizēja profibrotiskais citokīns TGF. - 1. Mēs novērtējām Cola1a un Acta2 (SMA) mRNS ekspresiju, reaģējot uz TGF- 1, lai noteiktu šo lipīdu ietekmi kultūrā (7.a attēls). Tostarp PGD2 sniedza spēcīgu antifibrotisku iedarbību uz NRK-52E šūnām, reaģējot uz TGF- 1. PGD2 nomācošā ietekme uz COL1A1 un SMA ekspresiju bija atkarīga no devas ar EC50 attiecīgi 7,12 μM un 6,48 μM (7.b attēls). Turklāt mēs veicām tos pašus eksperimentus ar HK-2 šūnām, kas ir iemūžinātas normāla pieauguša cilvēka proksimālās kanāliņu epitēlija šūnas.nieres,un konstatēja līdzīgu iznākumu, tas ir, COL1A1 un SMA inhibīciju atkarībā no devas, reaģējot uz ārstēšanu ar PGD2 (7.c attēls). Tāpēc paaugstināts PGD2 līmenis Alox15−/− CKDnieresvar veicināt antifibrotisko iedarbību HNS.
CISTANČE UZLABOS NIERU/NIeru SĀPES
15-PGDH, galvenais PGD2 metabolizējošs enzīms, tika samazināts Alox15-/- CKD nierēsLai noskaidrotu PGD2 palielināšanās mehānismunieresAlox15−/− CKD modeļa pelēm mēs izmērījām PGD2 sintāzes mRNS līmeni. PGD2 sintāzei (PGDS) ir divas izoformas: lipokalīna PGDS (L-PGDS) un hematopoētiskā PGDS (H-PGDS) [28]. Gan L-PGDS, gan H-PGDS līmenis bija ievērojami paaugstināts 5/6 Nx apstākļos, salīdzinot ar fiktīviem apstākļiem valstī.nieresno WT pelēm (8.a attēls, abas P<0.0001) indicating="" that="" increased="" pgd2="" in="" ckd="" is="" due="" to="" increased="" pgd2="" synthases.="" conversely,="" the="" increase="" in="" l-pgds="" and="" h-pgds="" under="" 5/6="" nx="" conditions="" was="" significantly="" inhibited="" in="" alox15−/−="" mice="" (fig. 8a)="" indicating="" that="" the="" increase="" in="" pgd2="" in="" alox15−/−="" ckd="" model="" mice="" was="" not="" due="" to="" increased="" production="" by="" pgds.="" then,="" we="" examined="" mrna="" levels="" of="" cox-1="" and="" cox-2="" as="" more="" upstream="" synthases="" of="" the="" prostaglandin-producing="" pathway.="" we="" also="" measured="" mrna="" levels="" of="" 15-pgdh="" and="">1C18, kas, kā zināms, ir galvenie PGD2-metabolizējošie enzīmi [29, 30]. Kamēr COX-1, COX-2 un AKR1C18 mRNS līmenis nemainījās, 15-PGDH mRNS līmenis HNS bija ievērojami samazināts.nieresAlox15−/− pelēm, salīdzinot ar WT pelēm (8.b att., P=0.0325), kas, iespējams, izraisa PGD2 palielināšanos HNS gadījumānieresAlox15−/− pelēm.
Diskusija
Šis pētījums parādīja, ka CKDnieresparaugos tika paaugstināts gan Alox15 transkripcijas, gan olbaltumvielu līmenis, unnieresdisfunkcija un fibroze tika uzlabota Alox15-/- pelēm. Turklāt uz LC-MS/MS balstīta mediatoru lipidomika atklāja, ka Alox15−/− CKD pelenieresbija ievērojami paaugstināts PGD 2 līmenis, salīdzinot ar WT pelēm. PGD2 inhibēja NRK-52E un HK-2 šūnu EMT; tādējādi PGD2 palielināšanās var veicināt Alox15-/- peļu rezistenci pretnieru bojājumsun fibroze. Attiecības starpnieru slimībaun lipīdu profili, izmantojot lipidomiku cilvēka serumā vai plazmā, ir plaši pētīti [31–33], bet ne uznieresaudi. Līdzīgi, lai gan ziņojumu par lipidomiku, izmantojot HNS dzīvnieku modeļus, ir maz [34–36], visos šajos pētījumos tika veikta lipidomika plazmas paraugos no HNS dzīvnieku modeļa; tomēr nav visaptverošas lipidomikasnieresvēl ir ziņots par audiem no CKD modeļa. Funkcionālo metabolītu identificēšanā efektīva ir arī tieša lipidomika uz audiem, kā arī plazmas paraugi. Turklāt metabolītu izmaiņas audos, kā arī asins paraugi ir ievērojami atšķirīgi atkarībā no orgāna [20]. Šajā pētījumā mēs rūpīgi analizējām no PUFA iegūto lipīdu mediatoru profilunieresCKD dzīvnieku modeļa audi.
Šajā pētījumā galvenā uzmanība tika pievērsta ALOX15, kas ir viens no galvenajiem fermentiem, kas metabolizē PUFA. Šajā pētījumā gan olbaltumvielu, gan mRNS ekspresijas līmenis ALOX15 bija skaidri paaugstināts CKDnieres. Mēs pievērsāmies šūnu tipiem, kas ir atbildīgi par ALOX15 ekspresiju CKDnieres,un, veicot in situ hibridizāciju, mēs atklājām paaugstinātu ALOX15 mRNS ekspresijunierucauruļveida šūnas 5/6 Nx modelī.
ALOX15 ir iesaistīts hroniskās slimībās, piemēram, aterosklerozē, un tā dzēšana dzīvnieku slimību modeļos uzlabo šīs slimības [5]. Attiecībā uz ALOX15 saistību arnieru slimība, proteīnūrija ir samazināta Alox15-/- pelēm ar glomerulāru traumu, izmantojot streptozotocīna izraisītu diabētiskās nefropātijas modeli [37]. Tomēr šis cukura diabēta peles modelis neuzrāda nekādu samazināšanosnieru darbība; tādējādi mehānisms, kā ALOX15 ir saistīts ar traucējumiemnieru darbībaCKD modeļos ir palicis neskaidrs. Šajā pētījumā, izmantojot 5/6 Nx peles modeli, mēs atklājām, ka ALOX15 dzēšana uzlabojanieresdisfunkcija unnierufibroze CKD modelī. Līdz šim ir zināms, ka tikai IL-4 un IL-13 monocītos ir regulējoši faktori, kas tieši palielina ALOX15 ekspresiju [5]. Tomēr joprojām nav skaidrs, kas palielina ALOX15nierucauruļveida šūnas. Ir zināms, ka HNS plazmā un nierēs ir palielināts dažādu citokīnu un urēmisko toksīnu daudzums [38, 39]. Starp tiem varētu būt jauni ALOX15 regulatori. Ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai noskaidrotu galvenos ALOX15 regulējošos faktorus CKD. Mūsu pētījumos, lai identificētu specifiskus iejauktos oksilipīnus, kas saista Alox15 dzēšanu ar tā renoprotektīvo efektu 5/6 Nx modelī, mēs atklājām, ka PGD2 var būt iesaistīts rezistencē pretnieru bojājumiizraisīja ALOX15 dzēšana. Vispārīgi saprotot, lai ģenerētu PGD2, COX-1 un
CCOX-2 no arahidonskābēm ražo PGG2, kas pēc tam tiek pārveidots par PGH2. Kad PGH2 tiek metabolizēts ar PGD2 sintāzi (PGDS), veidojas PGD2 [28]. PGDS ir divas ģenētiski atšķirīgas izoformas, proti, lipokalīntipa PGDS (L-PGDS) un hematopoētiskā tipa PGDS (H-PGDS) [28]. Lai gan PGD2 tika palielināts Alox15-/- CKD pelēnieres, ne L-PGDS, ne H-PGDS netika palielināts Alox15−/− CKD pelē.nieres, neskatoties uz lielo PGDS pieaugumu WT CKD pelēnieres(8.a att.). Turklāt mēs arī atklājām, ka Alox15−/− CKD peles nierēs netika palielināts ne COX-1, ne COX-2 (8.b attēls). Šie rezultāti liecina, ka PGD 2 palielināšanos Alox15−/− CKD peles nierēs izraisīja nevis sintāžu palielināšanās, bet gan palielināta substrāta pieejamība vai degradācijas kavēšana, un patiesībā mēs esam atklājuši, ka samazinās {{ 7}}PGDH, viens no galvenajiem PGD2 metabolizējošiem enzīmiem [29], Alox15−/− CKD peles nierēs (8.b attēls). Ir nepieciešama turpmāka izmeklēšana, lai noskaidrotu iemeslu, kāpēc Alox15 dzēšana izraisa 15-PGDH samazināšanos.
Kā minēts iepriekš, PGD2 varētu būt iesaistīts rezistencē pretnieru bojājumsizraisīja ALOX15 zudums. Šajā pētījumā PGD2 inhibēja EMT ar TGF- 1 NRK-52E un HK-2 šūnās, kas pārstāv proksimālās cauruļveida šūnas. PGD2 saistās ar diviem dažādiem ar G proteīnu saistītiem receptoriem, proti, DP1 un DP2, kuru funkcijas ir atšķirīgas [28]. Tomēr mūsu in vitro eksperimentos PGD2 bija efektīvs koncentrācijās no 4 līdz 32 μM, kas ir salīdzinoši augstas, ņemot vērā, ka DP1 un DP2 Ki vērtības ir attiecīgi 1, 7 nM un 2, 4 nM [28]. Šis rezultāts norāda, ka PGD2 var izraisīt antifibrotisku iedarbību nevis caur G proteīnu saistītiem receptoriem, bet ar citiem ceļiem, piemēram, PPAR , caur kuriem ir zināms, ka 15-d-PGJ2, pakārtotais PGD2 metabolīts, iedarbojas [28]. Šajā pētījumā, kas koncentrējas uz lipīdu metabolisma enzīmiem un to metabolītiem, ALOX15 inhibīcija un / vai PGD2 ievadīšana varētu būt daudzsološs terapeitiskais mērķis HNS. Diemžēl nav izstrādāts neviens ALOX15 specifisks inhibitors, ko varētu izmantot klīniskajā praksē [40, 41]. Pakārtoto funkcionālo metabolītu, piemēram, PGD2, terapeitiskā mērķēšana, nevis taukskābju metabolizējošo enzīmu inhibīcija, kas ietekmē dažādus metabolītus, varētu būt jauna ideāla CKD terapija.
CISTANCHE UZLABOS NIeru/NIeru DIALĪZI
