Iespējamo 3,5-dihloranilīna (3,5-DCA) metabolītu nefrotoksiskais potenciāls un 3,5-DCA biotransformācija izolētās nieru šūnās no Fischer 344 žurkām

Lai uzzinātu vairāk, lūdzu, sazinieties ar:tina.xiang@wecistanche.com

Abstract:Pašreizējais pētījums tika izstrādāts, lai izpētītu četru 3,5-dihloranilīna(3,5-DCA) metabolītu (3,5-dihloracetanilīda,3,5- nefrotoksisko potenciālu in vitro. DCAA;3,5-dihlorfenilhidroksilamīns,3,5-DCPHA;2-amino-4,6-dihlorfenols,2-A-4 ,6-DCP;3,5-dihlornitrobenzols,3,5-DCNB) un noteikt 3,5-DCA metabolismu nierēs in vitro. Citotoksicitātes pārbaudē,izolētas nieru šūnas(IKC) no Fischer 344 žurku tēviņiem (~4 miljoni/ml, 3 ml) tika pakļauti metabolīta (0-1,5 mM; līdz 90 minūtēm) vai nesēja iedarbībai. No šiem metabolītiem 35-DCPHA bija visspēcīgākais nefrotoksiskais, ar 35-DCNB starpproduktu nefrotoksiskā potenciālā.2-A-4,6-DCP un 3,{ {12}}DCAA nebija citotoksiskas. Atsevišķos eksperimentos 35-DCNB citotoksicitāte tika samazināta, iepriekš apstrādājot IKC ar antioksidantiem un citohroma P450, flavīna monooksigenāzes un peroksidāzes inhibitoriem, savukārt 3,5-DCPHA citotoksicitāte tika vājināta ar diviem nukleofiliem.antioksidanti(glutations un N-acetil-L-cisteīns). IKC inkubācija ar 3,5-DCA(0.5-1.0 mm,90 min) radīja tikai 3,5-DCAA un 3,{{12 }}DCNB kā nosakāmi metabolīti. Šie dati liecina, ka 3,5-DCNB un 3,5-DCPHA ir potenciāli nefrotoksiski metabolīti un var veicināt 3,5-DCA izraisītu nefrotoksicitāti in vivo. Turklāt nieres var bioaktivizēt3,5-DCNB toksiskos metabolītus, un 3,5-DCPHA, šķiet, rada reaktīvus metabolītus, kas veicina 3,5-DCA nefrotoksicitāti. Šķiet, ka in vitro 3,5-DCA N-oksidācija ir galvenais 3,5-DCA bioaktivācijas mehānisms nefrotoksiskiem metabolītiem.

Atslēgvārdi:nefrotoksicitāte; in vitro; žurka;3,5-dihloranilīns;35-dihlorfenilhidroksilamīns;3,5-dihloracetanilīds;2-amino-4,6-dihlorfenols;3,{{ 9}}dihlornitrobenzols

noklikšķiniet, lai uzzinātu vairāk informācijas.

1. Ievads

Hloranilīni ir ķīmiski starpprodukti, ko parasti izmanto daudzu krāsvielu, lauksaimniecības ķīmisko vielu, zāļu un rūpniecisko ķīmisko vielu ražošanas procesā. Hloranilīnu iedarbība notiek darba vidē, to izdalīšanās vai daudzu savienojumu [1-3] metabolisma laikā zīdītājiem vai pesticīdu noārdīšanās rezultātā[1,4-6]. Hloranilīnu noteikšana cilvēka urīnā vai asinīs ir izmantota kā biomarķieris hloranilīna pesticīdu iedarbībai [7-10]. Toksicitāte, kas saistīta ar hloranilīnu iedarbību, ietver hematotoksicitāti (piemēram, anēmiju vai methemoglobinēmiju)[11-13], splenotoksicitāti [11,14], hepatotoksicitāti [14-17], endokrīnās sistēmas traucējumus [18] un nefrotoksicitāti [16,19 ,20]. Hloranilīni arī tiek uzskatīti par prioritāriem piesārņotājiem vides riska novērtējuma pētījumos, jo tie var nelabvēlīgi ietekmēt veselību un izdalīties vidē pēc pesticīdu sadalīšanās lauksaimniecības apgabalos [21,22].

No trim monohlorētajiem un sešiem dehlorētajiem anilīniem 3,5-dihloranilīns (3,5-DCA) ir visspēcīgākais nefrotoksiskais in vivo unin vitro[16,19,23]. In vivo 3,5-DCA iedarbība Sprague-Dawley vai Fischer, 344 žurkām izraisīja paaugstinātu urīnvielas slāpekļa (BUN) koncentrāciju asinīs, samazinātu organisko jonu transportu proksimālajās kanāliņu šūnās, samazinātu nieru svaru, proteīnūriju un hematūriju. [23,24]. Vissmagākās morfoloģiskās izmaiņas notiek nieru proksimālajās kanāliņu šūnās, bet distālās kanāliņu šūnas un savācējvadus ietekmē arī 3,{10}}DCA iedarbība [23]. Turpmākie pētījumi, izmantojotizolētas nieru šūnas(IKC) no Fischer 344 žurku tēviņiem parādīja, ka koncentrācija 10 mm vai lielāka 3,5-DCA iedarbība 90 minūtes palielina laktātdehidrogenāzes (LDH) izdalīšanos, kas ir citotoksicitātes rādītājs [25]. ].

Anilīna savienojumu toksicitāte in vivo galvenokārt ir saistīta ar toksisku metabolītu veidošanos. Pamatojoties uz pētījumiem ar anilīnu un dažiem tā hlorētiem atvasinājumiem, šo anilīna savienojumu biotransformācijas ceļi ir skaidri noteikti, un tie ietver N-oksidāciju, N-acetilēšanu un fenilgredzena oksidāciju [13, 26-28]. Lai gan 35-DCA metabolisms in vivo nav detalizēti pētīts, šie biotransformācijas ceļi var radīt vairākus potenciāli toksiskus metabolītus (1. attēls), kā tas notiek ar citiem hloranilīniem, kuros ir veikti biotransformācijas pētījumi [26, 29,30]. Jaunākie Racine et al. [25] ir pierādījuši, ka 35-DCA tiek metabolizēts toksiskos metabolītos, izmantojot vairākas nieru enzīmu sistēmas. Tomēr nav skaidrs, kuri metabolīti tiek ražotinieres.

Viens potenciālais 3, 5-DCA metabolīts, 4-amino-2, 6-dihlorfenols (4-A-2, 6-DCP) , ir novērtēts attiecībā uz nefrotoksisko potenciālu, un tas ir spēcīgs nefrotoksisks in vivo un in vitro Fischer 344 žurku tēviņiem [31-33]. Salīdzinošā in vitro pētījumā par nefrotoksisko potenciālu bieži vien mono-, di- un trihlornitrobenzoli nieru garozas šķēlēs atklāja, ka 3,5-dihlornitrobenzols (35-DCNB) ir vismazāk spēcīgais nefrotoksiskais starp dihlornitrobenzoliem [34]. . Līdz šim pašlaik nav pētījumu, kas pētītu citu iespējamo 3,5-DCA metabolītu nefrotoksisko potenciālu.

Pašreizējais pētījums tika izstrādāts, lai noteiktu trīs papildu iespējamo 3,5-DCA metabolītu, kas rodas N-acetilēšanas rezultātā, (3,5-dihloracetanilīda) nefrotoksisko potenciālu.

3.5-DCAA), N-oksidācija (3,5-dihlorfenilhidroksilamīns; 35-DCPHA) vai fenilgredzena oksidēšana (2-amino-4,{{ 8}}dihlorfenols;2-A-4,6-DCP)(1. attēls) pēc 35-DCA ārpusnieru biotransformācijas. Tika izpētīts 3,5-DCNB nefrotoksiskais potenciāls IKC modelī un tā iespējamais(-ie) bioaktivācijas mehānisms(-i). Turklāt tika noteikta iespēja, ka brīvie radikāļi/reaktīvie metabolīti var veicināt 3,5-DCPHA citotoksicitāti. Visbeidzot, tika veikts biotransformācijas pētījums, lai noskaidrotu, cik lielā mērā 3,{20}}DCA tiek biotransformēts IKC no Fischer 344 žurku tēviņiem, un lai noteiktu, kuri metabolīti veidojas.

2. Rezultāti

2.1. Laika un koncentrācijas citotoksicitātes attiecības 3,5-DCA metabolītiem

Lai noteiktu katra 3, 5-DCA iespējamā metabolīta, koncentrācijas un laika gaitas pētījumi tika veikti IKC. 3,5-DCAA iedarbība nevienā brīdī (60 vai 90 min) vai koncentrāciju (0-1) būtiski nepalielināja LDH izdalīšanos, kas ir citotoksicitātes marķieris. 5 mM)pārbaudīts (2.A attēls). Turklāt 2-A-4,6-DCP iedarbība neizraisīja būtisku LDH izdalīšanās palielināšanos nevienā pārbaudītajā koncentrācijā (līdz 1,5 mM) pēc 60 vai 90 minūšu ilgas iedarbības ( 2.B attēls). IKC inkubācija ar 3,5-DCNB vai 3,5-DCPHA izraisīja no laika un koncentrācijas atkarīgu LDH izdalīšanās pieaugumu abiem savienojumiem, lai gan 3,5-DCPHA izraisīja vislielāko LDH izdalīšanās. Ievērojama LDH izdalīšanās tika novērota pie 3,5-DCNB koncentrācijas 1,0 vai 1,5 mM vai lielākas pēc 90 minūtēm, bet tikai 1,5 mM pēc 60 minūtēm (2. C attēls). Turpretim 35-DCPHA izraisīja ievērojamu pieaugumu. LDH izdalīšanā pie 0,25 mM vai lielāka pēc 60 un 90 minūtēm, un LDH izdalīšanās palielināšanās, kas novērota pēc 90 minūtēm, ir ievērojami palielināta, salīdzinot ar attiecīgiem LDH izdalīšanās palielinājumiem par 60 minūtēm (2.D attēls). Tāpēc no pārbaudītajiem metabolītiem 3,5-DCPHA bija nefrotoksiskākās.

2.2. Nieru biotransformācija un 3,5-DCNB citotoksicitāte

Tā kā anilīnus un nitrobenzolus var metabolizēt savā starpā, tika izstrādāti turpmāki pētījumi, lai izpētītunieru biotransformācijaun brīvie radikāļi citotoksicitātē pēc 1.0 mM 3,5-DCNB iedarbības 60 minūtes. Lai noteiktu brīvo radikāļu iespējamo lomu 3,5-DCNB citotoksicitātē, IKC tika iepriekš apstrādāts ar antioksidantu. Iepriekšēja apstrāde ar visiem antioksidantiem (-tokoferolu, glutationu, askorbātu un N-acetil-L-cisteīnu; 3. attēls) ievērojami mazināja 3,5-DCNB izraisīto citotoksicitāti.

Lai izpētītu nieru biotransformācijas lomu 3,5-DCNB toksicitātē IKC, tika izmantota pirmapstrāde ar citohromu P450 (CYP), flavīnu saturošām monooksigenāzēm (FMO) un peroksidāzēm. CYPinhibitoru lietošana (4. attēls) parādīja, ka divi vispārīgie CYP inhibitori (piperonilbutoksīds [PiBx]; metirapons) ievērojami mazināja 3,5-DCNB citotoksicitāti. Iepriekšēja apstrāde ar FMO inhibitoriem (n-oktilamīns; metimazols) un peroksidāzes inhibitoru merkaptosukcinātu ievērojami mazināja 3,5-DCBN citotoksicitāti (5. attēls). Indometacīnam, kas inhibē ciklooksigenāzes peroksidāzes aktivitāti, bija tendence samazināt 3,5-DCNB izraisīto LDH izdalīšanos, taču tas nesasniedza būtisku atšķirību (5. attēls).

2.3. Antioksidanti un 3,5-DCPHA citotoksicitāte

Lai sāktu izpētīt brīvo radikāļu lomu 3,5-DCPHA izraisītā citotoksicitātē, IKC tika iepriekš apstrādāti arantioksidanti(glutationu, askorbātu vai N-acetil-L-cisteīnu) pirms 3,5-DCPHA (0,5 mM) iedarbības. Rezultāti liecina, ka atšķirībā no 3, 5-DCNB, 3,{{10}}DCPHA izraisītā citotoksicitāte tika daļēji vājināta ar N-acetil-L-cisteīnu un pilnībā aizsargāta ar glutationu (6. attēls). ).Askorbāts (1.0 vai 2,0 mM) nebija efektīvs, lai samazinātu 3,5-DCPHA citotoksicitāti.

2.4.3.,5-IKC nodrošina DCA metabolismu

Iepriekšējie salīdzinošie citotoksicitātes pētījumi tika izstrādāti, lai izpētītu ārēji ražoto iespējamo 3,5-DCA metabolītu nefrotoksisko potenciālu. Mēs arī pārbaudījām, kā IKC metabolizēja 3,5-DCA, lai noskaidrotu, kurus metabolītus tieši ražo nieru šūnas. Šajos eksperimentos IKC tika inkubēts ar netoksisku koncentrāciju 3, 5-DCA (0,5 mM) vai citotoksisku koncentrāciju (10 mM) 90 minūtes un barotnes paraugus. un šūnas, kas analizētas ar HPLC, lai noteiktu 3,{12}}DCA un tā metabolītus. 3,5-DCA un tā metabolītu aiztures laiki, noteikšanas robežas un ekstrakcijas koeficienti ir parādīti 1. tabulā autentiskiem 3,5-DCA un katra metabolīta (4-A{{) standartiem. 19}},6-DCP,2-A-4,6-DCP, 3,5-DCPHA, 3,5-DCAA un 3 ,5-DCNB).

Abās koncentrācijās galvenais savienojums barotnē un šūnās inkubācijas perioda beigās bija pamatsavienojums 3, 5-DCA. Mazāk nekā 5 procenti no 3,5-DCA tika metabolizēti par 3,5-DCAA un 3,5-DCNB (2. tabula). Nebija pierādījumu par nekonjugētu aminohlorfenola metabolītu 2-A-46-DCP vai 4-A-2,6-DCP.35-DCPHA veidošanos. netika atklāts, kas nebija pārsteidzoši, ņemot vērā šī metabolīta ļoti reaktīvo raksturu, taču konstatējums, ka 3,5-DCNB atradās barotnēs un šūnās, apstiprina secinājumu, ka veidojās 3,5-DCPHA un pēc tam tālāk oksidē līdz 3,5-DCNB.

Pastāvēja iespēja, ka aminohlorfenoli veidojās, bet tika metabolizēti par sulfātu vai glikuronīda konjugātiem. Lai noteiktu, vai ir izveidojušies konjugāti, 3,5-DCA (10 mM) tika inkubēts ar IKC 45 vai 90 minūtes. Tomēr barotnes vai šūnu lizātu apstrāde ar arilsulfatāzi vai glikuronidāzi neatklāja brīvu 2-A-4,6-DCP vai 4-A-2,{ {12}}DCP (dati netiek rādīti). Šie rezultāti liecina, ka šie divi metabolīti neveidojās nosakāmā līmenī vai tika tālāk oksidēti par reaktīviem metabolītiem (1. attēls). Tomēr, tā kā būtībā notika pilnīga 35-DCA ekvivalentu atgūšana, ir maz ticams, ka ļoti daudz no šiem metabolītiem, ja tādi vispār tika izveidotinieru šūnas.

2.5. Dietilditiokarbamskābes (DEDTCA) ietekme uz 3,5-DCA metabolismu

Iepriekšējie pētījumi parādīja, ka IKC iepriekšēja apstrāde ar CYP2C inhibitoriem ievērojami samazināja 3,5-DCA citotoksicitāti [25]. Viens no efektīvākajiem 35-DCA toksicitātes inhibitoriem bija CYP2C inhibitors DETCA. Lai pārbaudītu, kā DEDTCA ietekmē 3,5-DCA metabolismu, IKC tika iepriekš apstrādāts ar DEDTCA (0,1 mM), kam sekoja {{10}}DCA (1,0 mM) 90 min inkubācija. Nosakot 35-DCA un 3,5-DCA metabolītu līmeni, atklājās, ka kopējais 3,5-DCA līmenis barotnē un šūnās ir tikai nedaudz palielināts, savukārt 3,{{{ 20}}DCAA un 3,5-DCNB tika samazināti (3. tabula). Netika konstatēts 2-A-4.6-DCP 4-A-2,6-DCP vai 3,5-DCPHA, kas saskan ar iepriekšējiem pētījumiem (2. tabula).

3. Diskusija

Svarīgs šī pētījuma aspekts bija iespējamo ārēji ražoto 3,5-DCA metabolītu nefrotoksiskā potenciāla noteikšana uz nieru mērķa šūnām. Paredzams, ka šie metabolīti veidosies, pamatojoties uz anilīna un hloranilīnu metabolismu (1. attēls)[13.26,28,29]. Mēs iepriekš esam aprēķinājuši, ka nefrotoksiska 3,5-DCA deva Fischer 344 žurkām nodrošinātu maksimālo līmeni asinīs ~1,25 mM [25]. Tādējādi metabolītu koncentrācija, kas ir zemāka par šo koncentrāciju, varētu būt fizioloģiski nozīmīga. Pašreizējā pētījuma rezultāti liecina, ka metabolītam, kas rodas, N-acetilējot 3,5-DCA, 3,5-DCAA, bija ievērojami samazināts nefrotoksiskais potenciāls salīdzinājumā ar 3,5-DCA. Šis rezultāts nav pārsteidzošs un saskan ar iepriekšējiem pētījumiem ar monohloranilīniem un to metabolītiem, kas parāda, ka N-acetilēšana rada hloracetanilīda metabolītus ar samazinātu nefrotoksisko potenciālu, salīdzinot ar sākotnējo savienojumu [35, 36]. Tādējādi N-acetilēšana, šķiet, ir detoksikācijas ceļš hloranilīna izraisītai nefrotoksicitātei, tostarp 3,5-DCA. Turklāt IKC spēj metabolizēt 3,5-DCA līdz 3,{{30} }DCAA (2. tabula). Taču, ņemot vērā 3,5-DCAA vājo nefrotoksisko potenciālu, maz ticams, ka šis metabolīts veicinās 3,5-DCA izraisītu nefrotoksicitāti in vitro.

Atšķirībā no 3,5-DCAA, vismaz viens metabolīts, kas rodas, oksidējoties 3,5-DCA fenilgredzenā, izraisa nefrotoksicitāti. 3,5-DCA oksidēšana pozīcijā 4- rada 4-A-2,6-DCP (1. attēls), kas ir spēcīgs nefrotoksisks in vivo un in vitro [31-33]. In vivo 4-A-2,6-DCP(0.38 mmol/kg,ip) izraisa izteiktu nefrotoksicitāti Fischer 344 žurku tēviņiem, kam raksturīga proteīnūrija, glikozūrija, paaugstināts asins urīnvielas slāpekļa (BUN) koncentrācija unnieressvars un proksimālā tubulārā nekroze S3 segmentā [3132].In vitro,4-A-2,6-DCP samazināja p-aminohippurāta (PAH) un tetraetilamonija (TEA) uzņemšanu žurkānieru garozas šķēleskoncentrācijās attiecīgi 5 μM un 50 uM 【31】 un palielināta LDH izdalīšanās pie 50 μM vai lielāka pēc 2 stundu iedarbības 【33】. IKC, lai palielinātu LDH izdalīšanos, ir nepieciešama 4-A-2,6-DCP koncentrācija 250 μM vai lielāka un 90 minūšu ekspozīcija. Lielākas koncentrācijas, kas nepieciešamas citotoksicitātes izraisīšanai šajā modelī, visticamāk, ir saistītas ar albumīna klātbūtni IKC inkubācijas vidē, bet ne Krebsa-Ringera šķīdumā, ko izmantoja nieru garozas šķēles inkubācijas pētījumos. Šajā pētījumā 2-A-4,6-DCP, kas rodas oksidācijas rezultātā 35-DCA 2-pozīcijā, nepalielināja LDH izdalīšanos koncentrācijās. līdz 1,5 mM un līdz 90 ekspozīcijai, kas norāda, ka 4-A-2,6-DCP bija spēcīgāks nefrotoksisks nekā 2-A-4, 6-DCP. Šis atklājums saskan ar citu 4-amino- un 2-aminofenolu[37,38] nefrotoksiskā potenciāla salīdzinājumiem. Tādējādi 4-A-2.6-DCP, visticamāk, nekā 2-A-4,6-DCP veicinās 3,{{38 }}DCA izraisīta nefrotoksicitāte in vivo.

IKC3,5-DCA metabolisma pētījumos ne 2-A-4, ne 6-DCA, ne 4-A-2,6- DCA tika atklāti kā brīvi metabolīti vai kā glikuronīdu vai sulfātu konjugāti (2. tabula), lai gan ir iespējams, ka tika ražoti nelieli šo aminodihlorfenolu daudzumi, tika pilnībā atjaunota IKC inkubācijai pievienotā 3,{10}}DCA. konstatēts kā pamatsavienojums plus citi metabolīti (2. tabula). Šie rezultāti liecina, kanieresneveido pietiekami daudz aminodihlorfenola metabolītu, lai veicinātu 3,5-DCA nefrotoksicitāti in vitro.

Ir pierādīts, ka N-oksidācija ir svarīgs anilīna un hloranilīna metabolisma biotransformācijas ceļš, kas var veicināt hepatotoksicitāti un, iespējams, citu toksicitāti, ko izraisa šie savienojumi [11, 39-41]. Anilīna N-oksidēšana rada fenilhidroksilamīna metabolītu, kas tālāk tiek oksidēts par nitrosobenzola metabolītu [39] (1. attēls). Fenilhidroksilamīna un nitrozobenzola metabolīti var redoksēties, veidojot brīvos radikāļus un oksidējot hemoglobīnā esošo melno dzelzi un citus melno dzelzi saturošus proteīnus par dzelzs dzelzi. Šis cikls pārvērš hemoglobīnu par methemoglobīnu eritrocītos, bet var ietekmēt arī citu proteīnu un enzīmu bioloģisko aktivitāti, kam bioloģiskai aktivitātei nepieciešama dzelzs dzelzs molekula. Nitrosobenzola metabolīti ir arī reaktīvi un var kovalenti saistīties ar nukleofiliem makromolekulās šūnā [42, 43]. Nitrozogrupu var tālāk oksidēt, veidojot nitrobenzola metabolītus (1. attēls). Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka 3,5-DCA var izraisīt methemoglobinēmiju in vivo un ka 3,5-DCPHA (1. attēls) galvenokārt ir atbildīga par šo toksicitāti [40,44,45]. Šie atklājumi liecina, ka 3,5-DCPHA tiek ražots ārēji, visticamāk, aknās, un nonāk asinīs, lai izraisītu methemoglobinēmiju, kā tas notiek ar anilīnu [44,45]. Šie atklājumi arī liecina, ka nieres tiek pakļautas 3,{23}}DCPHA iedarbībai, kas veidojas ārpus nieres vietās.

3,5-DCNB veidošanās, ko veic IKC (2. tabula), parāda, ka nieres var veidot 3,5-DCPHA no 3,5-DCA. Tādējādi nieres var tikt pakļautas 3,5-DCPHA iedarbībai gan no intranieres, gan ārpus tās veidošanās.3,5-DCPHA izrādījās toksiskākais pārbaudītais metabolīts, un ir iespējams, ka 3,{ {13}}DCPHA ir galvenais 3,5-DCA nefrotoksicitātes veicinātājs tieši nieru šūnās un/vai netieši ar hematotoksicitāti. Iespējams arī, ka vairākas enzīmu sistēmas spēj veidot 35-DCPHA no 3,5-DCA, un šīs enzīmu sistēmas var veidot arī citus 3,5-DCA nefrotoksiskus metabolītus [46, 47]. Ir pierādīts, ka anilīna savienojumu N-oksidāciju katalizē CYP, flavīna monooksigenāzes (FMO),

peroksidāzes un prostaglandīnu sintetāze [48-51]. Iepriekšējie mūsu laboratorijas pētījumi ir parādījuši, ka 3,5-DCA nefrotoksicitāti IKC var mazināt šo dažādo enzīmu grupu inhibitori dažādās pakāpēs [25], kas liecina, ka vienas enzīmu grupas inhibēšana ļaus 35- DCA jāturpina bioaktivēt ar citām metabolizējošām enzīmu sistēmām. Lai noteiktu, vai Racine et al. [25] mainīja 3,5-DCA N-oksidāciju, tika pārbaudīta dietilditiokarbamāta (DEDTCA), kas ir CYP2C inhibitors, un mazākā mērā CYP2E1 spēja samazināt DCNB veidošanos. DETCA tika izvēlēts pētījumam, jo ​​tas ievērojami samazināja 3,{13}}DCA citotoksicitāti IKC [25]. Atklājums, ka DEDTCA samazināja 3,5-DCNB veidošanos IKC, apstiprina secinājumu, ka DEDTCA vismaz daļēji mazināja 3,5-DCA nefrotoksicitāti, kavējot 3,{{21} }DCA. Tā kā CYP2E1 inhibitors izoniazīds neietekmēja 3,5-DCA citotoksicitāti, šķiet, ka CYP2C enzīmi bioaktivē 3,5-DCA uz toksiskiem metabolītiem, veidojot 3,5-DCPHA.

Citotoksicitāti in vitro IKC var radīt 3,5-DCPHA, izmantojot divus iespējamos mehānismus; redoksciklēšana, lai radītu brīvos radikāļus (piemēram, superoksīda anjonu radikāļus) un oksidatīvo stresu vai alkilējoša(-u) metabolīta(-u) veidošanos. Racine et al. [25] atklāja, ka 3,5-DCA izraisīta citotoksicitāte IKC nav saistīta ar oksidatīvo stresu. Gan samazinātais, gan kopējais glutationa līmenis tika samazināts par3,5-DCA iedarbību, kas liecina par reaktīva metabolīta veidošanos. Pašreizējā pētījumā 35-DCPHA citotoksicitāti samazināja nukleofīlie antioksidanti (glutations un N-acetil-L-cisteīns), bet ne nenukleofīlais antioksidants askorbāts (6. attēls). Šie rezultāti apstiprina vienu vai vairākus reaktīvus, alkilējošus 3,5-DCPHA metabolītus kā citotoksisku sugu.

Hlorētie nitrobenzoli ir nefrotoksiski in vivo un in vitro [34,52,53]. Rikerts un Helds [3] atklāja, ka Fischer 344 žurku tēviņu aknu mikrosomas metabolizēja 3-hlornitrobenzolu, reducējot nitrogrupu, veidojot 3-hloranilīnu, kas liecina, ka metabolisms starp 3,5-DCA un 3,5-DCNB ir atgriezenisks. Tādējādi 3,5-DCNB reducēšana radīs 3,5-dihlornitrozobenzolu un 3,5-DCPHA, tāpat kā 3,5-DCA oksidēšana rada šos divus metabolītus. Tomēr 3,5-DCNB iespējamā ietekme uz 3,5-DCA nefrotoksicitāti nebija skaidra. Ja 35-DCNB bija nefrotoksisks metabolīts, nebija arī skaidrs, vai toksisko ķīmisko vielu iegūšanai ir nepieciešama biotransformācija. Pašreizējie rezultāti atbalsta 3,5-DCNB kā toksisku3,5-DCA metabolītu, kas, iespējams, veicina 3,5-DCA nefrotoksicitāti pēc biotransformācijas.

Pašreizējais pētījums parāda, ka 3,5-DCNB ir spēcīgāks nefrotoksisks līdzeklis nekā 3,5-DCA IKC [25]. Turklāt antioksidantu un oksidatīvās biotransformācijas inhibitoru spēja vājināt 3,5-DCNB citotoksicitāti atspoguļo šo pirmapstrādes ietekmi, samazinot 3,5-DCA citotoksicitāti IKC [25]. Šie rezultāti liecina, ka jebkurš 3,5-DCNB, kas veidojas 3,5-DCA biotransformācijas laikā, var veicināt 3,5-DCA nefrotoksicitāti, izmantojot 3,5- metabolismu. DCNB tiek pārveidots atpakaļ par 3,5-dihloronitrsobenzolu un 3,5-DCPHA. Tomēr CYPinhibitoru vājā aktivitāte pret 3,5-DCNB citotoksicitāti liecina, ka citas enzīmu sistēmas (piemēram, ne-CYP nitroreduktāze) var būt atbildīgas par nitrogrupas samazināšanos šajā modeļa sistēmā vai veicināt to. . Turklāt antioksidantu spēja ievērojami vājināt 3.{26}}DCNB citotoksicitāte atbalsta nitrogrupu radīto brīvo radikāļu un/vai reaktīvo skābekļa/slāpekļa sugu lomu šī savienojuma nefrotoksiskajā mehānismā. Ņemot vērā to, ka daži oksidatīvā metabolisma inhibitori (piemēram, n-oktilamīns un merkaptosukcināts) ievērojami samazina 3,5-DCNB nefrotoksicitāti, ir maz ticams, ka 35-DCNB ir tieši toksisks nieru šūnām, bet rada tā citotoksicitāte ar metabolītu starpniecību. Turklāt in vitro 3,5-DCA metabolisma pētījumi liecina, ka nieru šūnas var nesaražot pietiekami daudz 3,5-DCNB, lai in vitro būtu atbildīgas par 3,5-DCA citotoksicitāti. Iespējams, ka 3,5-DCA ekstrarenālais metabolisms rada pietiekami daudz 3,5-DCNB, lai veicinātu 3,5-DCA izraisītu nefrotoksicitāti in vivo, taču kopējais devums ir 3,{{ 46}}DCNB līdz 3,5-DCA nefrotoksicitātei būs nepieciešama turpmāka izpēte.

Rezumējot, šo pētījumu rezultāti liecina, ka ārēji ģenerēti amīna-odihlorfenola metabolīti un metabolīti, kas rodas N-oksidācijas rezultātā, var veicināt 3.5-DCA nefrotoksicitāti in vivo, savukārt {{5} N-acetilāciju. }DCA ir detoksikācijas mehānisms. In vitro 3,5-DCA N-oksidācija ir galvenais 3,5-DCA bioaktivācijas mehānisms citotoksiskajiem metabolītiem, un toksicitāti, visticamāk, izraisa 3,5-dihloronitrsobenzols un /vai 3,5-DCPHA. Turklāt 3,5-DCNB izraisīta nefrotoksicitāte ir saistīta ar metabolītu veidošanos, un arī 3,5-DCNB nefrotoksicitāte, visticamāk, ir saistīta ar ar 3,5-dihlornitrsobenzolu un/vai 35-DCPHA.

4. Materiāli un metodes

4.1.Dzīvnieki

Fischer 344 žurku tēviņi (200-250 g) tika iegūti no Hilltop Lab Animals, Inc. (Scotts-dale, PA, ASV). Dzīvnieki ir izmitinājuši divas žurkas katrā būrī ar barību un ūdeni, kas pieejams ad libitum, kontrolējot temperatūru (21-23 grādi), mitrumu (40-55 procentus) un gaismu (12 h ieslēgts/12 h izslēgts). Pirms lietošanas visiem dzīvniekiem bija atļauts vismaz vienu nedēļu aklimatizēties Amerikas Laboratorijas dzīvnieku aprūpes akreditācijas asociācijas (AAALAC) akreditētajās dzīvnieku iestādēs. Visu izmantošanu ar dzīvniekiem apstiprināja Māršala Universitātes Institucionālā dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja (Protokols Nr. 447 (2010. gada 5. augusts) un 531. (2013. gada 1. februāris)), un eksperimenti ar dzīvniekiem tika veikti saskaņā ar Laboratorijas dzīvnieku kopšanas un lietošanas rokasgrāmatu. , ko pieņēmis Nacionālais veselības institūts.

4.2. Ķimikālijas

Visas ķīmiskās vielas tika iegādātas ar visaugstāko tīrības pakāpi, kas pieejama no Fischer Scientific (Pitsburga, PA, ASV) vai Sigma Aldrich (St. Louis, MO, ASV), izņemot 3,5-dihlorfenilhidroksilamīnu (3,{{3}). }DCPHA), 35-dihloracetanilīds (3.5-DCAA) un 2-amino-4, 6-dihlorfenols (2-A{{11) }},6-DCP), kas tika sintezēti mūsu laboratorijā. 3,5-DCPHA tika sintezēts, reducējot 3,5-DCNB, izmantojot hidrazīna-palādiju uz oglekļa, izmantojot iepriekš aprakstīto Rondestvedta un Džonsona [54] metodi, un attīrīts, kā aprakstījis Valentovic et al. [55]. 3,{21}}DCAA sintēze un attīrīšana tika veikta, izmantojot Newell et al. metodi. [56]reaģējot vienādos daudzumos 3,5-dihloranilīna un etiķskābes anhidrīda nātrija acetāta klātbūtnē. Lai pagatavotu 2-A-4,6-DCP, 2,4-dihlorfenols tika nitrēts, izmantojot McMillan et al metodi[29,57], kam sekoja nitro reducēšana. grupa līdz aminogrupai ar nātrija hidrosulfītu 10 procentu nātrija hidroksīda ūdens šķīdumā saskaņā ar Newell et al. [56].

4.3. Izolētu nieru šūnu sagatavošana un apstrāde

Izolētas nieru šūnas(IKC) tika iegūti no neapstrādātiem Fischer 344 žurku tēviņiem. Fischer 344 žurku tēviņi tika izvēlēti kā modelis izolētu nieru šūnu iegūšanai, jo lielākā daļa no mūsu iepriekšējiem toksicitātes datiem ar 3,5-DCA tika iegūti šajā modelī. Žurkas tika anestēzētas ar pentobarbitālu (75 mg/kg, ip), un IKC tika sagatavots, izmantojot Džounsa et al metodi.[58] izmantojot kolagenāzes perfūziju, kā aprakstījuši Racine et al. [25]. Nieru šūnas, kas izolētas ar šo metodi, ir bagātinātas ar nieru garozas šūnām, pamatojoties uz bioķīmisko raksturojumu, un tās bieži izmanto nieru toksikoloģijas novērtējumos [59-63]. Sākotnējā šūnu dzīvotspēja tika noteikta kā ~85-90 procenti pēc laktātdehidrogenāzes (LDH) izdalīšanās un tripānzilā (2% w/o) izslēgšanas. Pirms inkubācijas IKC tika skaitīts un atkārtoti suspendēts Krebs-Henseleit (pH 7,37; 25 mM Hepes; 2 procenti bez liellopu seruma albumīna) buferšķīdumā koncentrācijā ~ 4,2 miljoni šūnu/ml. IKC (3 ml) tika iepriekš inkubēti 25 ml polikarbonāta Erlenmeijera kolbās 5 minūtes 37 grādu temperatūrā 95% skābekļa/5% oglekļa dioksīda atmosfērā. Pēc iepriekšējas inkubācijas šūnas tika pakļautas dažādām koncentrācijām 3,5-DCNB (0.5-1.5 mM), 3.5-DCAA({{32}). }.5-1.5 mM),3.5-dihlorfenilhidroksilamīns (3,5-DCPHA;0.{{40}}.{{45 }} mM, 2-A-4,6-DCP （0.5-1.5 mM） vai transportlīdzeklis (30 μL DMSO）) līdz 90 min.Paredzētā inkubācijas perioda beigās tika paņemti paraugi (0,5 ml) LDH izdalīšanās testam, kā aprakstīts iepriekš [20,25].

Lai noteiktu lomunieru biotransformācija3,5-DCNB citotoksicitāte un brīvie radikāļi35-DCPHA nefrotoksicitātē, IKC tika iepriekš apstrādāti ar antioksidantu vai biotransformācijas enzīmu sistēmu inhibitoru (4. tabula) vai nesēju (30uL). DMSO). Visas koncentrācijas un pirmapstrādes laikiantioksidantiunnieru enzīmu inhibitoritika balstīti uz iepriekš publicētiem pētījumiem [20,25].

4.4.IKC 3,5-DCA metabolisms

4.4.1.IKC inkubācijas un metabolītu izolācija

IKC (~ 4,2 miljoni šūnu/ml; 3 ml) tika inkubēti ar 3, 5-DCA (0,5 vai 1.0 mM) Krebs-Henseleit (KH) buferšķīdumā ( pH 7,4) 90 minūtes kratītā ūdens vannā 95% skābekļa/5% oglekļa dioksīda atmosfērā, kā aprakstīts iepriekš. 0,5 mM koncentrācija 3,5-DCA ir necitotoksiska koncentrācija 90 minūtēs, savukārt 10 mM koncentrācija izraisa citotoksicitāti, par ko liecina palielināta LDH izdalīšanās. Inkubācijas perioda beigās tika savākti 10 ml paraugi, un barotne un šūnas tika atdalītas, centrifugējot. Granulētās šūnas tika mazgātas ar KH buferšķīdumu (bez liellopu seruma albumīna), un skalošana tika pievienota barotnei. Šūnas tika lizētas, apstrādājot ar ultraskaņu, un olbaltumvielas tika izgulsnētas, visiem paraugiem pievienojot metanolu (1, 0 ml). Paraugus centrifugēja (3000 g; 10 min 4 grādi) un supernatantu filtrēja caur 0,45 μ šļirces filtru un uzglabāja -20 grādos līdz analīzei ar HPLC, kā aprakstīts tālāk.

4.4.2. Sulfātu un glikuronīdu konjugātu noteikšana

Lai noteiktu, vai ir veidojušies sulfāta vai glikuronīda konjugāti, dažos eksperimentos barotnes un šūnu supernatanta frakcijas, kas iegūtas, kā aprakstīts iepriekš, tika apstrādātas ar ß-glikuronidāzi (6500 vienības/ml, galīgā koncentrācija) vai arilsulfatāzi. (200 vienības/ml, galīgā koncentrācija) plus sačaharolaktons (20 mM, galīgā koncentrācija) 18 stundas (37 grādi) 0,1 M acetāta buferšķīdumā (pH 5,0), lai attiecīgi hidrolizētu visus izveidotos glikuronīda vai sulfāta konjugātus 26] . Hidrolīzi pārtrauca, pievienojot aukstu metanolu (2,4 ml). Pēc tam frakcijas tika filtrētas un uzglabātas līdz analīzei, kā aprakstīts iepriekš.

4.4.3. DEDCTA inhibē CYP2C metabolismu

Atsevišķā eksperimentā šūnas tika iepriekš apstrādātas ar dietilditiokarbamātu (DEDTCA, 0,1 mM, 30 min pirmapstrāde), CYP2C inhibitoru, pirms 3,5-DCA pievienošanas, lai noteiktu, kuri metabolīti tika samazināti ar DEDTCA. pirmapstrāde. Pēc 90 minūšu inkubācijas perioda šūnas un barotnes tika apstrādātas un uzglabātas, kā aprakstīts iepriekš, lai noteiktu 3,5-DCA koncentrāciju un izveidoto 3,5-DCA metabolītu koncentrāciju.

4.4.4. Metabolītu noteikšana HPLC

Paraugi (75 μL) barotnes un lizēta IKC tika analizēti ar Waters Alliance e2695 HPLC sistēmu (Waters Co., Milford, MA, ASV), izmantojot Waters 2489 mainīgo UV/Vis detektoru pie 254 nM. Hromatogrammas tika savāktas un integrētas, izmantojot programmatūru Empower 3 (Waters Co., Milford, MA, ASV). A Waters X Select HSS T3 C18 kolonna (3,5 μm; 4,6 × 150 mm²), kas aprīkota ar Waters XSelect HSS T3 Savienojumu atdalīšanai tika izmantota VanGuard kasetne (3,5 um; 3,9 × 5 mm2). Kustīgā fāze sastāvēja no 50:50 metanola; ūdens ar plūsmas ātrumu 0,75 ml/min. Standarta līknes , noteikšanas robežas un ekstrakcijas koeficienti tika noteikti 3,5-DCA un iespējamajiem metabolītiem. Ekstrakcijas koeficienti tika noteikti, salīdzinot 1,0 mM3,5-DCA vai metabolīta parauga integrāciju, no kura tika ņemts paraugs. apstrāde (ti, metanola pievienošana un centrifugēšana) neapstrādātam 1,0 mM 35-DCA vai metabolīta paraugam.

4.5. Statistika

Dati ir parādīti kā vidējais ± SEM ar N no {{0}} atsevišķos eksperimentos ar dzīvniekiem, izņemot N=3 netoksiskā 0,5 mM 3,5-DCA metabolisma eksperimentā. Dati starp ārstēšanu tika analizēti ar vienvirziena dispersijas analīzi (ANOVA), kam sekoja Tukey tests. Nozīme tika noteikta p<0.05. a="" power="" analysis="" was="" performed="" with="" g*="" power="" software="" version="" 3.1.9.7="" for="" f="" tests,="" anova="" (repeated="" measures,="" within="" factors)="" with="" effect="" size="" f="0.85," α="" error="" probability="0.05," power(1-β="" error="" probability)="0.8" and="" actual="" power="0.832," which="" determined="" a="" sample="" size="" of="" n="4" was="" sufficient="" with="" a="" 95%="" confidence="">

Autoru ieguldījums: CRR: literatūras apskats, darba veikšana, datu analīze un interpretācija, veicināja darba rakstīšanu; MAV: eksperimentālais dizains un datu interpretācija, DKA: palīdzēja veikt darbu un sagatavot darbu; GOR: literatūras apskats, eksperimentālais dizains, datu interpretācija, raksta un rediģēja darbu. Visi autori ir izlasījuši un piekrituši publicētajai manuskripta versijai.

Finansējums: Šo pētījumu daļēji atbalstīja Nacionālais veselības institūtu Nacionālais vispārējo medicīnas zinātņu institūts ar piešķirto GOR piešķiršanas numuru P20GM103434. Par saturu atbild tikai autori, un tas ne vienmēr atspoguļo Nacionālo veselības institūtu oficiālos uzskatus. .

Institucionālās pārbaudes padomes paziņojums: visu izmantošanu ar dzīvniekiem apstiprināja Māršala Universitātes Institucionālā dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja (Protokols Nr. 447 (2010. gada 5. augusts) un 531 (2013. gada 1. februāris)), un eksperimenti ar dzīvniekiem tika veikti saskaņā ar rokasgrāmatu par dzīvnieku kopšanu un lietošanu. Laboratorijas dzīvnieki, ko pieņēmis Nacionālais veselības institūts.

Paziņojums par datu pieejamību: Šajā pētījumā sniegtie dati ir pieejami pēc attiecīgā autora pieprasījuma.

Interešu konflikti: autori paziņo, ka nav interešu konflikta.

Atsauces

1. Aizava, H. Pesticīdu metabolisma kartes; Academic Press, Inc.: Londona, Lielbritānija, 1989; 2. sējums.

2. Ehlhardt, WJ. Pretvēža līdzekļa sēra metabolisms un izvietojums pelēm, žurkām, pērtiķiem un cilvēkiem. Narkotiku Metab. Dispos. 1991, 19, 370–375. [PubMed]

3. Rikerts, DD; Held, SD Hlornitrobenzolu metabolisms ar izolētiem žurku hepatocītiem. Narkotiku Metab. Dispos. 1990, 18, 5–9. [PubMed]

4. Lī, JB; Sohn, HY; Shin, KS; Kims, JS; Jo, MS; Džeons, CP; Jang, JO; Kims, JE; Kwon, GS Vinklozolīna un tā toksiskā metabolīta 3, 5-dihloranilīna mikrobu biodegradācija un toksicitāte. J. Microbiol. Biotehnoloģija. 2008, 18, 343–349. [PubMed]

5. Santoss, TCR; Roča, JC; Aļonsa, RM; Martiness, E.; Ibanezs, C.; Barselo, D. Propanila strauja degradācija rīsu lauka kultūrās. Vide. Sci. Tehn. 1998, 32, 3479–3484. [CrossRef]

6. Mārleta, VL; Martyniuk, CJ Bioloģiskās atbildes reakcijas uz fenilurīnvielas herbicīdiem zivīs un abiniekiem; jauni virzieni toksicitātes mehānismu raksturošanai. Comp. Biochem. Fiziol. C Toksikolis. Pharmacol. 2017, 194, 9.–21. [CrossRef]

7. Lindh, CH; Litorins, M.; Amilons, A.; Jonsson, BA. 3,5-dihloranilīna kā vinklozolīna un iprodiona biomarķiera analīze cilvēka urīnā, izmantojot šķidruma hromatogrāfiju/trīskāršās kvadrupola masas spektrometriju. Rapid Commun. Masu spektrs. 2007, 21, 536–542. [CrossRef]

8. Kutings, B.; Goens, T.; Šveglers, U.; Fromme, H.; Uter, W.; Angerers, J.; Drexler, H. Monoarilamīni vispārējā populācijā — uz populāciju balstīts šķērsgriezuma pētījums, kurā piedalījās 1004 Bavārijas subjekti. Int. J. Hyg. Vide. Veselība 2009, 212, 298–309. [CrossRef]

9. Tūrči, R.; Barisano, A.; Balducci, C.; Colosio, C.; Minoia, C. Dihloranilīnu noteikšana cilvēka urīnā ar gāzu hromatogrāfiju/masas spektrometriju: Validācijas protokols un atsauces vērtību noteikšana iedzīvotāju grupā, kas dzīvo Itālijas centrālajā daļā. Rapid Commun. Masu spektrs. 2006, 20, 2621–2625. [CrossRef]

10. Vitelli, N.; Chiodini, A.; Colosio, C.; De Paschale, G.; Somaruga, C.; Tūrči, R.; Minoia, C.; Brambilla, G.; Colombi, A. Anilīdu un dikarboksimīdu pesticīdu iedarbība uz darbu un vidi. G. Ital. Med. Lav. Ergon. 2007, 29 (3. pielikums), 276.–277.

11. Čabra, RS; Tompsons, M.; Elvels, MR; Gerken, DK P-hloranilīna toksicitāte žurkām un pelēm. Food Chem. Toksikols. 1990, 28, 717–722. [CrossRef]

12. Gilhermino, L.; Soares, AM; Karvalju, AP; Lopes, MC 3,4-dihloranilīna akūtā ietekme uz Wistar žurku tēviņu asinīm. Chemosphere 1998, 37, 619–632. [CrossRef]

13. Pizon, AF; Švarcs, AR; Šums, LM; Ritenbergers, JC; Apakšējais, DR; Džianoutsoss, S.; Virji, MA; Krasovskis, MD Toksikoloģijas laboratorijas analīze un p-hloranilīna iedarbība uz cilvēkiem. Clin. Toksikols. 2009, 47, 132–136. [CrossRef] [PubMed]

14. Kēnigs, CM; Bevers, C.; Pants, K.; Young, RR Para-hloranilīna un anilīna mutagēnā potenciāla novērtējums Big Blue® žurku aknās, liesā un kaulu smadzenēs ar mikrokodolu analīzi perifērajās asinīs. Vide. Mol. Mutagēns. 2018, 59, 785–797. [CrossRef] [PubMed]

15. Valentovičs, MA; Bumba, JG; Anestis, DK; Alus, KW; Madans, E.; Habards, JL; Rankin, GO 2-haloanilīnu akūta nieru un aknu toksicitāte Fischer 344 žurkām. Toxicology 1992, 75, 121–131. [CrossRef]

16. Valentovičs, MA; Bumba, JG; Anestis, DK; Rankin, GO Dihloranilīna strukturālo izomēru in vitro toksicitātes salīdzinājums. Toksikols. In Vitro 1995, 9, 75–81. [CrossRef]

17. Valentovičs, MA; Lūk, HH; brūns, PI; Rankin, GO 3,5-Dihloranilīna toksicitāte Fischer 344 žurkām, kas iepriekš apstrādātas ar citohroma P450 inhibitoriem un induktoriem. Toksikols. Lett. 1995, 78, 207–214. [CrossRef]

18. Bhuijana, MNH; Kangs, H.; Kims, JH; Kims, S.; Kho, Y.; Choi, K. Endokrīnās sistēmas traucējumi, ko izraisa vairāki anilīna atvasinājumi un saistītie mehānismi cilvēka virsnieru H295R šūnu līnijā un pieaugušu zebrafish tēviņu. Ekotoksikols. Vide. Saf. 2019, 180., 326.–332. [CrossRef]

19. Hong, SK; Anestis, DK; Hendersons, TT; Rankin, GO Haloanilīna izraisīta in vitro nefrotoksicitāte: 4-haloanilīnu un 3,5-dihaloanilīnu ietekme. Toksikols. Lett. 2000, 14, 125–133. [CrossRef]

20. Rasīne, C.; Ward, D.; Anestis, DK; Fergusons, T.; Prestons, D.; Rankin, GO 3,4,5-Trihloranilīna nefrotoksicitāte in vitro: brīvo radikāļu iespējamā loma un nieru biotransformācija. Int. J. Mol. Sci. 2014, 15, 20900–20912. [CrossRef]

21. Boehncke, A.; Ķīlhorns, J.; Konnekers, G.; Polencs-Mišels, C.; Mangelsdorfer, I. Concise International Chemical Assessment Document 48—4-hloranilīns; Pasaules Veselības organizācija: Ženēva, Šveice, 2003.

22. Vangnai, AS; Kataoka, N.; Soonglerdsongpha, S.; Kslsmbaheti, C.; Tadžima, T.; Kato, J. Escherichia coli bioreportera uzbūve un pielietojums anilīna un hloranilīna noteikšanai. J. Ind. Microbiol. Biotehnoloģija. 2012, 39, 1801–1810. [CrossRef]

23. Lo, HH; brūns, PI; Rankin, GO Akūta nefrotoksicitāte, ko izraisa izomēri dihloranilīni Fischer 344 žurkām. Toxicology 1990, 63, 215–231. [CrossRef]

24. Rankins, GO; Yang, dīdžejs; Teets, VJ; Lūk, HH; Brown, PI 3,5-Dihloranilīna izraisīta nefrotoksicitāte Sprague-Dawley žurkām. Toksikols. Lett. 1986, 30, 173–179. [CrossRef]

25. Racine, CR; Fergusons, T.; Prestons, D.; Ward, D.; Bumba, J.; Anestis, D.; Valentovičs, M.; Rankin, GO Biotransformācijas un oksidatīvā stresa loma 3,5-dihloranilīna (3,5-DCA) izraisītā nefrotoksicitātē izolētās nieru garozas šūnās no Fischer 344 žurku tēviņiem. Toksikoloģija 2016, 341.–343., 47.–55. [CrossRef] [PubMed]

26. Hong, SK; Rankin, GO 2-hloranilīna biotransformācija Fischer 344 žurkām: urīna metabolītu identificēšana. Xenobiotica 1998, 28, 985–994. [CrossRef] [PubMed]

27. Rankins, GO; Racine, C.; Svīnijs, A.; Krainijs, A.; Anestis, DK; Barnett, JB In vitro nefrotoksicitāte, ko izraisa propanils. Vide. Toksikols. 2008, 23, 435–442. [CrossRef]