Dendrimera-tesaglitazara konjugāts izraisa mikroglijas fenotipa maiņu un uzlabo amiloido fagocitozi† 3. daļa

D-Tesa palielināja to enzīmu ekspresiju, kas ir atbildīgi par patogēno proteīnu noņemšanu

Insulīnu noārdošais enzīms (Ide) un matricas metaloproteāze 9 (MMP9) ir enzīmi, ko izdala mikroglijas, kas noārda ārpusšūnu amiloīdu un -sinukleīnu.71,72 Ārstēšana ar D-Tesa ievērojami palielināja Ide 3 ekspresiju.{8}} reizes (p < 0.001) ar tendenci palielināties MMP9 izteiksmei (1.8-reizes pieaugums, p=0.057), salīdzinot ar tikai LPS apstrādātām kontrolēm (6.A un B att.).

Pēdējos gados arvien vairāk pētījumu liecina, ka pastāv cieša saikne starp insulīnu noārdošiem enzīmiem un atmiņu. Šis atklājums sniedz mums vērtīgas norādes, lai turpinātu pētīt atmiņas veidošanās un uzturēšanas mehānismu.

Insulīnu noārdošais enzīms ir svarīgs enzīms, kura galvenā funkcija ir insulīna sadalīšana, lai uzturētu cukura līmeni asinīs. Tomēr jaunākie pētījumi liecina, ka insulīnu noārdošais enzīms ne tikai spēlē vielmaiņas lomu, bet arī tieši ietekmē neironu augšanu un atjaunošanos smadzenēs, un tam ir svarīga loma atmiņas uzturēšanā.

Daudzi pētījumi ir parādījuši, ka jo augstāks ir insulīnu noārdošā enzīma līmenis, jo labāka ir atmiņa. Tas ir tāpēc, ka insulīnu noārdošie enzīmi var veicināt neironu augšanu un atjaunošanos, tādējādi uzlabojot smadzeņu mācīšanās un atmiņas spējas. Turklāt insulīnu noārdošie enzīmi var arī veicināt savienojumu starp neironiem, tādējādi uzlabojot asociāciju un atmiņas saglabāšanu.

Insulīnu noārdošo enzīmu svarīgā loma atmiņā ir plaši izmantota klīniskās medicīnas jomā. Pētnieki atklājuši, ka, ieelpojot insulīnu noārdošos enzīmus, var uzlabot ne tikai atmiņu, bet arī kognitīvās spējas un depresijas simptomus.

Īsāk sakot, saikne starp insulīnu noārdošajiem enzīmiem un atmiņu ir ļoti svarīga joma, kas sniedz mums vērtīgas norādes, lai pētītu atmiņas bioloģisko mehānismu. Turpmākie pētījumi turpinās pētīt insulīnu noārdošo enzīmu funkcijas un lomu, palīdzēs mums labāk izprast atmiņas veidošanās un uzglabāšanas mehānismu un nodrošinās labāku pamatu cilvēka smadzeņu mācīšanās un atmiņas spēju uzlabošanai. Var redzēt, ka mums ir jāuzlabo atmiņa, un Cistanche var ievērojami uzlabot atmiņu, jo Cistanche var arī regulēt neirotransmiteru līdzsvaru, piemēram, palielināt acetilholīna un augšanas faktoru līmeni, kas ir ļoti svarīgi atmiņai un mācībām. Turklāt Cistanche var arī uzlabot asins plūsmu un veicināt skābekļa piegādi, kas var nodrošināt, ka smadzenes saņem pietiekamu uzturu un enerģiju, tādējādi uzlabojot smadzeņu vitalitāti un izturību.

Noklikšķiniet uz Zināt veidus, kā uzlabot atmiņu

Free Tesa ievērojami palielināja Ide izteiksmi 2-kārtīgi (p=0.011) un nenozīmīgi palielināja MMP92- reizes (p=0.35) (6.A att. un B). M2 mikroglija neirodeģeneratīvās slimībās var noņemt -amiloīdu, -sinukleīnu un citus patogēnos proteīnus, izmantojot enzīmu sadalīšanos vai fagocitozi, un D-Tesa pārregulē šajos procesos iesaistītos proteīnus (ti, Ide un MMP9).71–73

Ideekspresija tiek samazināta AD un PD patoloģijā, un ir zināms, ka to regulē PPAR agonisti, kas atbilst mūsu rezultātiem.

71,72 Funkcionāli ir pierādīts, ka tikai 2-kārtīgs Ide līmeņa pieaugums samazina amiloīdu uzkrāšanos un neironu nāvi in ​​vivo.74,75 Tāpēc 3-kārtīgs Ide pieaugums, ko novēroja D-Tesa, un 2-FreeTesa radītais Ide palielinājums varētu būt terapeitiski iedarbīgs in vivo.

D-Tesa palielina -amiloīda fagocitozi

CD36 ir mikroglia uztvērēja receptors, kas veicina fagocitozi un -amiloīda noārdīšanos.73 Tā pazeminātā AD regulēšana samazina -amiloīda izvadīšanu, bet to regulē PPAR aktivācija.

Gan D-Tesa, gan brīvā Tesa ievērojami palielināja CD36 ekspresijas līmeni, salīdzinot ar tikai LPS pakļautajām šūnām (p < 0.0001 pret p < 0,005 D-Tesa un brīvajai Tesa , attiecīgi), bet D-Tesa bija daudz efektīvāka par brīvu Tesa (6-reizes palielinājums salīdzinājumā ar 28-kārtējo pieaugumu D-Tesa un brīvā Tesa, attiecīgi, p < 0,0005) (6. C attēls. ).

Mūsu rezultāti atbilst iepriekšējiem pētījumiem ar pioglitazonu (citu PPAR agonistu), kas parādīja, ka palielināta -amiloīda mikroglia fagocitoze notiek ar PPAR un CD{1}}atkarīgu mehānismu.73

Lai noskaidrotu, vai CD36 regulēšana no D-Tesatterapijas korelē ar šo šūnu palielināto fagocītisko spēju, mēs veicām amiloīda funkcionālo fagocitozes testu. 73

Īsumā, pēc šūnu apstrādes, kā mēs to darījām iepriekšējos in vitro testos, mēs divas stundas šūnām uzklājām fluorescējoši marķētu -amiloīdu1–42, mazgājām šūnas un pēc tam veicām plūsmas citometriju, lai izpētītu -amiloīda uzņemšanas pakāpi šūnās. D-Tesa palielināja gan šūnu procentuālo daudzumu, kas fagocitēja -amiloīdu, gan vidējo internalizēto -amiloīda daudzumu vienā šūnā (7.A un B att.).

Pretstatā, brīvā Tesa neuzlaboja amiloīda fagocitozi. D-Tesa labākie efekti salīdzinājumā ar Tesa, iespējams, ir saistīti ar uzlabotu šūnu internalizāciju, ko nodrošina dendrimera konjugācija.

Tas atbilst iepriekšējiem darbiem, kas parādīja, ka vairāk nekā 95% BV2 šūnu, kas apstrādātas ar fluorescējoši iezīmētu G4-PAMAM-OH, bija internalizējuši dendrimēru trīsdesmit minūšu laikā un turpinājuši internalizēt dendrimeru vismaz 24 stundas.76

Tāpat mazās molekulas minociklīna konjugācija ar fluorescējoši iezīmētu G4-PAMAM-OH parādīja, ka 99% BV2 šūnu 3 stundu laikā bija internalizējuši fluorescējoši iezīmēto dendrimēra-zāļu konjugātu.26 Tie arī parādīja, ka konjugāta līmenis pazemināja slāpekļa oksīda pārākumu. uz bezmaksas zālēm pēc BV2 šūnu apstrādes ar LPS, saskaņā ar mūsu rezultātiem.

Šūnas, kas apstrādātas ar D-Tesafagocitēja 1.9-reizi vairāk amiloīda nekā ar LPS apstrādātās kontroles šūnas (p < 0.001), kas ir salīdzināms ar 2.{8}} -amiloido fagocitoze, ko izraisījušas žurku primārās mikroglia šūnas, kas apstrādātas ar pioglitazonu, par ko ziņoja Yamanaka et al.73 Iepriekšējā pētījumā konstatētais nedaudz augstāks amiloido fagocitozes līmenis varētu būt tāpēc, ka viņi neapstrādāja savas šūnas ar LPS, kā mēs to darījām, vai arī tāpēc, ka primārā mikroglia ekspresē PPAR plkst. augstāks līmenis nekā šajā pētījumā izmantotajām BV2 šūnām.77

Tādējādi D-Tesa deva, kas ir mazāka par in vitro eksperimentiem mūsu pētījumā aprēķināto, var būt efektīva in vivo pētījumos un cilvēkiem, jo ​​ir zināms, ka BV2 šūnas ekspresē PPAR zemākā līmenī nekā primārā mikroglija.77

Mikroglijas ir saistītas ar daudzām neirodeģeneratīvām slimībām, un BBB ir novērsusi, ka daudzas zāles, kas var pārveidot mikroglijas fenotipu no pro-iekaisuma, neirotoksiskā M1 fenotipa uz pretiekaisuma, neiroprotektīvu M2 fenotipu, sasniedz terapeitisko līmeni smadzenēs.5,6, 14,15

Piemēram, divi PPAR agonisti, pioglitazons un rosiglitazons, tika pētīti, izmantojot Alcheimera slimības III fāzes klīniskos pētījumus, jo tie spēja mainīt mikroglia fenotipu, taču tie, visticamāk, neizdevās sliktas transportēšanas dēļ pa BBB.13,14 Tādējādi pastāv klīniskā interese, kas nemaina. mikroglia fenotips neirodeģeneratīvās slimībās.

Šādai pieejai nepieciešama zāļu ievadīšana mikroglijā pietiekamā līmenī, lai izraisītu reakciju. Lai to panāktu, ir pierādīts, ka G4-OH-PAMAM dendrimeri daudzos dzīvnieku modeļos pēc sistēmiskas injekcijas nodrošina zāles mikroglijām, un tādēļ pašlaik tiek novērtēti klīniskajos pētījumos, lai ārstētu ccTLD (NCT03500627) un smagu COVID. -19 saistīts iekaisums (NCT04458298).18.–28

Lai apvienotu mikroglia fenotipa maiņas labvēlīgo ietekmi ar spēju nogādāt zāles mikroglijām, mēs konjugējām tesaglitazāru (PPAR/dubultais agonists) ar G4-OH-PAMAMdendrimeru (1.–3. att.). Mēs pierādījām, ka D-Tesa spēj mainīt M1 mikroglia fenotipu pret M2 fenotipu (4. un 5. att.), kā rezultātā samazinās kaitīgo reaktīvo skābekļa sugu sekrēcija.

Turklāt mēs parādījām, ka ar D-Tesa apstrādātās mikroglijas palielina to enzīmu ekspresiju, kas noārda patoloģiskos proteīnus, piemēram, -sinukleīnu un -amiloīdu, kā arī paaugstina -amiloīda fagocitozes regulēšanu funkcionālajā pārbaudē (6. un 7. attēls).

Lai gan mēs neiesniedzam datus, kas pierādītu D-Tesa spēju apiet BBB un uzkrāties mikroglijā, mēs iepriekš esam parādījuši, ka G4-OH-PAMAM zāļu konjugāti ar līdzīgu zāļu slodzi, izmēru un zeta potenciālu spēj iziet cauri traucēta BBB un akumulējošas mikroglijas pēc intravenozas ievadīšanas.26,36,52

Šie rezultāti atbalsta D-Tesa turpmāku attīstību vairāku neiroloģisko slimību ārstēšanai. Lai gan šajā rakstā mēs koncentrējamies uz Alcheimera un Parkinsona slimībām, D-Tesa ir potenciāls vairāku neiroloģisku traucējumu klīniskai tulkošanai. Sakarā ar mikrogliju līdzīgo lomu vairāku neirodeģeneratīvu slimību patoloģijā, PPAR agonists pioglitazons tika pētīts vai pašlaik tiek pētīts II fāzes klīniskajos pētījumos attiecībā uz Parkinsona slimību,78 ALS,79 adrenomieloneiropātijas (NCT03864523), multiplo sklerozi (NCT) un hematomu (NCT). izzušana intracerebrālās asiņošanas gadījumā (NCT00827892).

Ja arī šie klīniskie pētījumi neizdodas sliktas pioglitazona piegādes dēļ BBB, D-Tesa varētu pārvarēt šo piegādes šķērsli un ārstēt pacientus ar šīm slimībām.

Citas grupas ir izmantojušas nanodaļiņas, lai uzlabotu PPAR agonistu piegādi makrofāgiem, taču tās nav mēģinājušas piegādāt šos agonistus mikroglijām. Osinski et al. pierādīja, ka ar Tesa ielādētās liposomas pārsvarā uztvēra makrofāgi viscerālajos baltajos taukos vīriešu leptīna deficīta aptaukošanās modelī.80

Viņi papildus pierādīja, ka ar Tesa ielādētās liposomas nemainīja M1 marķiera Mcp-1 ekspresiju, bet gan palielināja M2 marķiera Arg1 ekspresiju, savukārt ārstēšana ar brīvo Tesa samazināja kopējo M1 makrofāgu skaitu un Mcp{{6 ekspresiju. }}, un nepalielināja Arg1 izteiksmi.

Nakaširo et al. izmantoja poli(pien-ko-glikolskābes) (PLGA) nanodaļiņas, lai piegādātu pioglitazonu (PPAR agonistu) makrofāgos aterosklerozes kontekstā.81

In vivo viņi pierādīja, ka PLGA-pioglitazons samazina imūno šūnu līmeni asinīs. Sākotnējie no kaulu smadzenēm iegūtie makrofāgi, kas tika ārstēti ar LPS un interferonu, atklāja, ka PLGA-pioglitazons palielina IL-4 un IL-10 (M2 marķierus) un nesamazina IL-6 vai TNF līmeni.

Viņu atklājumi ir līdzīgi mūsējiem; M2 marķieri tika palielināti, ārstējot ar nanodaļiņu-PPAR agonistu, bet IL-6 un TNF līmenis nesamazinājās. Di Mascolo et al. izmantoja PLGA-polivinilspirta nanodaļiņas, lai nodrošinātu rosiglitazonu (citu PPAR agonistu).82

In vitro viņi parādīja, ka to nanodaļiņu-zāļu kompleksi samazina iNOS, TNF- un IL-1 ekspresiju kaulu smadzenēs iegūtajos makrofāgos. Viņi apstrādāja savas šūnas ar nanodaļiņu zālēm pirms stimulēšanas ar LPS, savukārt mēs pirms apstrādes ar D-Tesa apstrādājām šūnas ar LPS, kas varētu būt iemesls, kāpēc mēs nenovērojām TNF- un IL-1 samazināšanos, lai gan mēs arī novērojām. iNOS izteiksmes samazināšanās.

Secinājums

Pašlaik daudzām neirodeģeneratīvām slimībām nav patoloģiju mainošas terapijas, un, iedzīvotājiem turpinot augt, šo slimību izplatība un ārstēšanas izmaksas turpinās pieaugt, uzsverot steidzamu vajadzību izstrādāt risinājumu. Nesen pro-iekaisuma M1 mikroglija ir kritiska vairāku neirodeģeneratīvu slimību patoloģijā.

Pēc tam spēja nogādāt zāles caur hematoencefālisko barjeru, kas var izraisīt "M1 uz M2" fenotipa maiņu mikroglijā, var terapeitiski potenciāli mainīt dažādas slimības, īpaši Alcheimera un Parkinsona slimību.

D-Tesa tika izstrādāta tā, lai pēc sistēmiskas ievadīšanas mikroglijā nogādātu M1 līdz M2 inducējošas zāles, lai samazinātu neirotoksisko vielu mikrogliālo sekrēciju, vienlaikus izraisot arī pretiekaisuma stāvokli, kas palielina patogēno proteīnu noārdīšanos un fagocitozi smadzenēs. Mēs veiksmīgi sintezējām D-Tesa, izmantojot ļoti efektīvu klikšķu ķīmijas pieeju.

Zāles ir pievienotas dendrimeram, izmantojot estersaiti, kas ir intracelulāri šķeļama lizosomu apstākļos, un aptuveni 60% Tesa tiek atbrīvoti pirmajās 48 stundās lizosomu apstākļos.

Tika pierādīts, ka D-Tesa ir pārāka par Tesa in vitro, ierosinot M1 uz M2a/M2b/M2c fenotipa maiņu, kā rezultātā samazinājās slāpekļa oksekrēcija, pastiprināja -sinukleīnu un amiloīdus noārdošo enzīmu ekspresiju un pastiprināja -amiloīda fagocitozi.

Tādējādi D-Tesa apvieno dendrimera labvēlīgās piegādes īpašības ar Tesa M1 uz M2 pārslēgšanās īpašībām. Ņemot vērā mikroglia kopīgo lomu un kopējo terapeitisko ieguvumu, ierosinot M1 uz M2 fenotipa maiņu, D-Tesa var ārstēt daudzus neiroloģiskus traucējumus, ja to ievada pareizajā slimības progresēšanas stadijā.

Autoru ieguldījums

LD, AS, KL, RS, SK un RMK konceptualizēja eksperimentus. LD, AS un RS veica dendrimera un zāļu konjugāta sintēzi un raksturojumu. LD, KL un JJ veica šūnu eksperimentus. LD un K. L. veica statistiku. LD un AS uzrakstīja manuskriptu, un visi autori rediģēja manuskriptu.

Interešu konflikti

RMK un SK ir līdzizgudrotāji, kas izmanto hidroksilterminētu dendrimeru mērķtiecīgai piegādei mikroglijām neiroloģisku slimību gadījumā, kā arī patentus, kas saistīti ar šajā rakstā aprakstīto dendrimertehnoloģiju.

Viņi ir Ashvattha Therapeutics, Orpheris Inc. un RiniSight Inc. līdzdibinātāji, kas ir uzņēmumi, kas vada platformas klīnisko izstrādi. SK un RMK ir AshvatthaTherapeutics Inc valdes locekļi. RS šobrīd strādā AshvatthaTherapeutics un tai pieder uzņēmuma akcijas; darbs R. S. uzstājās šim dokumentam, pirms viņš pievienojās Ashvattha. Interešu konfliktu pārvalda DžonsHopkinsa universitāte.

Pateicības

Mēs vēlētos pateikties Elizabetei Smitai Khoury par noderīgām diskusijām par in vitro eksperimentiem. Šo projektu finansēja Patz Distinguished Professorship Endowment no JohnsHopkins un NICHD (granta numurs HD076901) (RMK). Pateicamies Wilmer Core Grant for Vision Research, Microscope un Core Module (dotācijas numurs EY001865) par piekļuvi Sony plūsmas citometram.

Mēs pateicamies uzņēmumam Servier Medical Arts par tās attēlu kolekcijas (http://smart.servier.com/) izmantošanu, kas ir licencēta saskaņā ar Creative Common Attribution 3.0 GenericLicense, kas tika pārveidota, lai padarītu grafisko abstraktu.

Atsauces

1 CL Gooch, E. Pracht un AR Borenstein, The burden ofneurological disease in the United States: A summaryreport and call to action, Ann. Neurol., 2017, 81, 479–484.

2 JL Cummings, T. Morstorf un K. Zhong, Alcheimera slimības zāļu izstrādes cauruļvads: maz kandidātu, biežas neveiksmes, Alcheimera Res. Tur., 2014, 6., 37.

3 P.-P. Liu, Y. Xie, X.-Y. Mengs un J.-S. Kangs, Alcheimera slimības hipotēžu un klīnisko pētījumu vēsture un gaita, Signal Transduction Targeted Ther., 2019, 4, 1–22.

4 C. Soto un S. Pritzkow, Olbaltumvielu nepareiza salocīšana, agregācija un konformācijas celmi neirodeģeneratīvās slimībās, Nat. Neurosci., 2018, 21, 1332–1340.

5 VH Perry un C. Holmes, Microglial priming in neurodegenerative disease, Nat. Rev. Neurol., 2014, 10, 217–224.

6 Y. Tang un W. Le, Differential Roles of M1 and M2 Microglia in Neurodegenerative Diseases, Mol. Neurobiol., 2016, 53, 1181–1194.

7 MW Salter un B. Stevens, Microglia kļūst par galvenajiem spēlētājiem smadzeņu slimību ārstēšanā, Nat. Med., 2017, 23, 1018–1027.

8 S. Krasemann, et al., The TREM2-APOE Pathway Drives theTranscriptional Phenotype of Disfunctional Microglia inNeurodegenerative Diseases, Immunity, 2017, 47, 566–581.e9.

9 Q. Zhao et al., Pioglitazona antidepresantiem līdzīgā iedarbība hroniska viegla stresa peles modelī ir saistīta ar PPAR izraisītu mikroglia aktivācijas fenotipu izmaiņām, J. Neuroinflammation, 2016, 13, 259.

10 L. Wen, et al., Microglia polarization to the M2phenotype in a Peroksisome Proliferator-Activated ReceptorGamma-Dependent Manner Attenuates Axonal Induced by Traumatic Brain Injury in Mice, J. Neurotrauma, 2018, 35, 2330.

11 W. Cai et al., Peroksisomu proliferatora aktivētais receptors (PPAR): galvenais vārtsargs CNS traumu un labošanas jomā, Prog. Neurobiol., 2018, 163–164, 27–58.12 B. Brakedal, et al., Glitazone use related with down riskof Parkinson's disease, Mov. Disord., 2017, 32, 1594–1599.

For more information:1950477648nn@gmail.com