Dihotomiskas reakcijas uz hronisku augļa hipoksiju izraisa iepriekš noteiktu novecošanas fenotipu Ⅰ

Īsumā

Izmantojot augšupēju proteomiku un nieres kā paradigmu, mēs ziņojam par integrējošu perspektīvu šūnu reakcijai uz hronisku augļa hipoksiju, atklājot pieaugušo slimību teorijas augļa programmēšanas pamatmehānismus, kas galvenokārt ir piemērojami visiem citiem ķermeņa orgāniem. Raksturīgais audu un seruma biomarķieris profiveicinās jaunu terapeitisku pieeju izstrādi, lai novērstu priekšlaicīgas novecošanas fenotipu, kas, šķiet, ir saistīts ar augļa programmēšanu.hroniskas slimības. 

IEGŪT DABĪGU ORGANISKO CISTANŠES EKSTRAKTU AR 25% EHINAKOZĪDU UN 9% AKTEOZĪDU NIERU INFEKTĀCIJAI

Izceļ

• Hroniska augļa hipoksija izraisa plašas izmaiņas olbaltumvielu ekspresijā.

• Apspiestā replikācija un tulkošana ierobežo jaunu nefronu veidošanos.

• Vairāki ceļiiepriekš nosaka novecošanas fenotipujau izstrādes laikā.

• Sinerģija iekšāFliekaisuma bojājumi, neefektīvs remonts un izmainīta vielmaiņa.

• Samazināts pretnovecošanās proteīnu daudzumsklots un sirtuīns 6 pelēm un cilvēkiem.

Hipoksijas izraisīts intrauterīnās augšanas ierobežojums palielina riskusirds un asinsvadu, nieru, un citshroniskas slimības pieaugušajiem, tādējādi veidojot nopietnu sabiedrības veselības problēmu. Tomēr nav daudz zināms par augļa mehānismiem, kas šos cilvēkus predisponē slimībām. Izmantojot iepriekš apstiprinātu augļa hipoksijas un augšupējas proteomikas modeli, mēs raksturojam augļa nieres reakciju uz hronisku hipoksisku stresu. Augļa nierēm ir divējāda reakcija uz hronisku hipoksiju, kas, no vienas puses, ietver šūnu adaptācijas, kas veicina izdzīvošanu (glikolīze, autofagija un samazināta DNS un olbaltumvielu sintēze), bet, no otras puses, procesi, kas izraisa novecošanai līdzīgu fenotipu (iekaisuma šūnu infiltrācija). , DNS bojājumi un samazināta proliferācija). Svarīgi ir tas, ka hroniska hipoksija samazina arī pretnovecošanās proteīnu klotho un Sirt6 ekspresiju, kas ir mehānisms, kas evolucionāri ir saglabājies starp pelēm un cilvēkiem. Kopumā mēs atklājam, ka iepriekš noteikta novecošanās augļa attīstības laikā ir galvenais notikumshroniska hipoksija, izveidojot stabilu pamatu Bārkera hipotēzei par pieaugušo slimību augļa programmēšanu. Šis fenotips ir saistīts ar raksturīgu biomarķieru profilu audu un seruma paraugos, ko var izmantot, lai noteiktu un mērķētu paātrinātu novecošanoshroniskas hipoksiskas cilvēku slimības.

Bārkera teorija par pieaugušo slimību augļa programmēšanu (1, 2) apgalvo, ka nevēlami notikumi attīstības laikā palielina vairāku hronisku slimību risku pieaugušā vecumā, t.sk.hipertensija,cukura diabēts,obstruktīva plaušu slimība, vaihroniska nieru slimība(CKD). Mūsu sabiedrībā, kas pastāvīgi noveco, šie traucējumi uzliek milzīgu ekonomisko slogu, kas pakāpeniski pieaug, jo pieaug to pacientu skaits, kuri cieš no viena vai vairākiem no šiem traucējumiem. Starp tiem,HNSunbeigu stadijas nieru slimība(ESRD) ir ne tikai neatkarīgi kardiovaskulārās saslimstības un mirstības riska faktori, bet arī rada arvien lielākas izmaksas par nieru aizstājterapiju, padarot tās par nopietnu sabiedrības veselības problēmu. Starp stratēģijām, kā saskarties ar šo tendenci, izšķiroša nozīme ir to mehānismu noskaidrošanai, kas savieno Bārkera teoriju un CKD attīstību. Ticams izskaidrojums pakāpeniskai nieru funkcijas zudumam pēcnācējiem ar zemu dzimšanas svaru izvirza hipotēzi par apburtā loka izveidošanos starp samazinātu nieru filtrācijas virsmu, palielinātu darba slodzi uz atlikušajiem nefroniem un turpmākiem bojājumiem.samazina filtrēšanas jaudu(Brenner's hypothesis) (3). A common finding in intrauterine growth restriction (IUGR) babies is the reduced number of nephrons formed at the end of kidney development (4). Thus, a low nephron number at birth increases the risk for accelerated functional decline and irreversible renal tissue damage (5, 6). Among all possible intrauterine stress factors, chronic hypoxia due to placental insufficiency or pregnancy at high altitude (>2500 m virs jūras līmeņa, kas ietekmē vairāk nekā 2% pasaules iedzīvotāju (7, 8)) ir viens no vissvarīgākajiem un klīniski nozīmīgākajiem faktoriem, kas traucē embrija attīstības programmu (9). Tomēr molekulārie mehānismi, ar kuriem hipoksija izraisa IUGR un traucēta nieru attīstība, joprojām ir nepilnīgi saprotami un prasa turpmāku izmeklēšanu. Šajā pētījumā mēs proteomu līmenī novērtējām molekulārās izmaiņas augļa nierēs, pakļaujot jaunattīstības peles embriju hroniskam hipoksiskam stresam, un apstiprinājām dažus galvenos atklājumus cilvēka hipoksiskā seruma paraugos. Mēs sniedzam būtiskus pierādījumus par virkni mijiedarbīgu mehānismu, kas, no vienas puses, nodrošina šūnu izdzīvošanu nelabvēlīgos apstākļos, bet, no otras puses, veicina samazinātu nefronu skaitu un priekšlaicīgu novecošanos līdzīgu fenotipu. Mēs to parādām tālākgēnu specifiskā DNShipermetilācija, bet arī DNS hipometilācija veicina šo dihotomisko reakciju uz hronisku hipoksiju. Tādējādi mūsu atklājumi veido stabilu pamatu Bārkera hipotēzei, atklājot virkni ceļu, kas iepriekš nosakanovecošanās fenotipsjau izstrādes laikā.

EKSPERIMENTĀLĀS PROCEDŪRAS

Eksperimentālais plānojums un statistiskais pamatojums Šī pētnieciskā pētījuma mērķis bija atklāt izmaiņas veselu augļa nieru proteomās, kas iegūtas no IUGR augļiem, lai padziļinātu zināšanas par augļa mehānismiem, kas maziem gestācijas vecuma indivīdiem rada noslieci uz hroniskām slimībām pieaugušā vecumā. Pētījums tika balstīts uz augšupēju proteomisko profilēšanu, izmantojot nano-LC sistēmu, kas savienota ar augstas izšķirtspējas orbītas masas spektrometru. Šim nolūkam tika izmantotas sešas E18.5 hipoksiskas nieres un sešas E18.5 normoksiskas nieres no vīriešiem un tika analizētas divos eksemplāros kontrolētā eksperimentā aklā veidā. Visas replikācijas bija veiksmīgas, nevienu eksperimentālu atradumu nevarēja atkārtot. Proteomikas dati tika analizēti, izmantojot MaxQuant 1.5.2.8 programmatūru (tostarp Andromeda meklētājprogrammu un Perseus statistiskās analīzes pakotni) un funkcionālo anotāciju klasterizāciju. Lai noteiktu hroniskas augļa hipoksijas ilgtermiņa sekas uz nieru darbību, nejauši tika izvēlēti pieci hipoksiski un pieci normoksiski vīriešu kārtas pēcnācēji un analizēti pēc 8 mēnešiem (pieci dzīvnieki ir nepieciešami, lai noteiktu GFR samazināšanos par 30% augļa hipoksijas dzīvniekiem, pamatojoties uz dispersiju no 15%, alfa=0.05, jauda=0.9). In vivo eksperiments tika noslēgts ar nieru fibrozes un seruma marķieru novērtējumu pēc 15 mēnešiem. Lai apstiprinātu dažus galvenos atklājumus eksperimentos ar dzīvniekiem, tika analizēti cilvēka seruma paraugi, kas tika savākti iepriekšējos kontrolētos pētījumos ar veseliem brīvprātīgajiem (10). Visi in vitro eksperimenti tika pārbaudīti un akli ar atbilstošām kontrolēm. Statistikas pārbaude un eksperimentālā informācija ir sniegta katra attēla leģendā. Visi dati ir uzrādīti un ietver visas novirzes.

Dzīvnieki

C57BL/6N peles tika iegādātas no Janvier laboratorijām, Francijā, un tika izmitinātas 23 ◦C un 50 līdz 60% mitruma IVC būros ar brīvu piekļuvi ēdam un ūdenim un 12 stundu dienas/nakts ciklu. Visi eksperimenti ar dzīvniekiem tika veikti saskaņā ar Šveices tiesību aktiem par dzīvnieku labturību, un tos apstiprināja vietējās varas iestādes (Bernes kantons BE96/11, BE105/14 un BE105/17). Lai veiktu pārošanos ar laiku, vaislas mātītēm katru rītu tika pārbaudīti maksts aizbāžņi, un, ja tādi bija, laika punkts tika iestatīts uz gestācijas dienu (E) 0,5. Gravid aizsprosti tika nejauši iedalīti vai nu normoksiskajai kontroles grupai (N=11), vai arī pakļauti pastāvīgai hipoksijai (N=11) 7 dienas. Lai izraisītu hipoksiju, mātītes gestācijas dienā E11.5 tika pārvietotas uz hipoksisku cimdu nodalījumu (Coy Laboratory Products), un skābekļa saturs tika pakāpeniski samazināts līdz 10% 3 līdz 4 stundu laikā. Elektriskais ventilators kameras iekšpusē uzturēja atbilstošu gaisa cirkulāciju. CO2 līmenis tika uzturēts zemā līmenī, veidojot helātus lieko CO2 nātrija kaļķa (Sigma, 72073) piepildītajās kasetnēs, kas savienotas ar gaisa cirkulācijas sistēmu. Lieko mitrumu absorbēja silikagela apelsīnu granulāts (Sigma, 1.01969), kas tika mainīts katru dienu. Deviņas mātītes no katras grupas tika eitanāzētas E18.5, un augļi un placentas tika savākti, nosvērti un sagatavoti turpmākai analīzei. Augļa asinis tika savāktas no atdalītu E18.5 augļu stumbra. Augļa nieres tika sadalītas PBS, izmantojot Leica M80 stereoskopu. Ilgtermiņa analīzēm divas mātītes tika izņemtas no hipoksijas dažas stundas pirms dzimšanas, un vīriešu dzimuma pēcnācēji tika izmantoti nieru darbības novērtēšanai (glomerulārās filtrācijas ātrums — GFR) pēc 8 mēnešiem, kā aprakstīts (11) un novērtēšanai. nieru fibroze un kloto un sirtuīna līmenis serumā 6 pēc 15 mēnešiem.

Glomerulāru skaits

E18.5 nieru pilnīgai imūnfluorescences krāsošanai tika izmantots iDisco krāsošanas protokols (12) (https://idisco.info/idisco-protocol/) ar pirmapstrādi ar metanolu, izmantojot antinefrīna antivielu (R&D AF3159). Attiecīgajām darbībām tika izmantots inkubācijas laiks n=1 diena un šķīduma tilpums 1,6 ml. Nieres tika ievietotas 8-iedobes stikla kameras priekšmetstikliņos (Thermo Fisher, 154534) un nekavējoties tika attēlotas, izmantojot IMIC digitālo mikroskopu (FEI, 4. tips001) ar polihroma V gaismu. avots, Orca-R2 kameras kontrolieris no Hamamatsu (C10600) un Live Acquisition programmatūra (FEI, versija 2.6.0.14). Simtmikrometru Z veida skursteņa attēli no iekrāsotām veselām E18.5 nierēm tika analizēti, izmantojot atvērtā koda attēlu apstrādes programmatūru Fidži (ImageJ, versija 2.0.{26}}rc69/1.52i, https://imagej.net/ Fidži). Spraudnī TrackMate v3.8.0 Downsample Log detektors tika iestatīts uz 80,0 pikseļiem aprēķinātajam lāses diametram ar 16-pikseļu slieksni un pazemināšanas koeficientu 2. Lai aprēķinātu glomerulu skaitu, tika pievienots plankumu skaits vienā kadrā. uz nieri. Tika izvēlēts 100 μm attālums starp kadriem, lai izvairītos no identisku glomerulu dubultas skaitīšanas secīgos attēlos, ņemot vērā vidējo glomerulāro diametru 80 μm.

Glomerulārās filtrācijas transkutānais novērtējums GFR tika noteikts pie samaņas esošiem dzīvniekiem, kā aprakstīts iepriekš (11). Īsumā, FITC-sinistrīna (Fresenius-Kabi, LI9830076) plazmas klīrenss tiek mērīts pāri ādai, izmantojot gaismas diodes ar FITC emisijas maksimumu pie 470 nm un fotodiodi, kas nosaka fluorescējošu gaismu ar maksimālo jutību pie 525 nm. Fluorescences intensitātes samazināšanās laika gaitā tiek pārveidota par GFR.

RT-qPCR Kopējā RNS tika izolēta, izmantojot TRIzol reaģentu (Invitrogen 15596026) saskaņā ar ražotāja protokolu. RNS koncentrācija un kvalitāte tika noteikta ar Nanodrop 1000 spektrofotometru (Thermo Fisher Scientific), un 1000 ng tika transkribēti cDNS, izmantojot PrimeScript RT reaģentu komplektu (Takara, RR037A). cDNS tika atšķaidīts līdz 2 ng/ul, un qPCR tika veikta ar FAM iezīmētu UPL zondi (Roche) un atbilstošiem gēnu specifiskiem primeriem un TaqMan Fast Universal PCR Master maisījumu (Applied Biosystems, 4352042) 7500 Fast Real-Time PCR sistēmā. (Lietišķās biosistēmas). Datu analīze tika veikta ar Microsoft Excel. RT-qPCR relatīvo ekspresijas līmeņu aprēķināšanai tika izmantota 2 (-ΔCt) metode. Zondes un primeru sekvences ir uzskaitītas S1 papildu tabulā.

Parauga sagatavošana LC-MS/MS analīzei Izolētas vīriešu augļa nieres (n=3 katrai grupai) tika homogenizētas parauga buferšķīdumā (7,5 M urīnviela, 1,5 M tiourīnviela, 4% CHAPS, 0). 18}}5% SDS, 100 mM ditiotreitola (DTT)), izmantojot ultraskaņas nūju. Olbaltumvielu koncentrācijas tika noteiktas, izmantojot Bredforda testu (Bio Rad-Laboratories). Tika piemērots gēla gremošanas protokols, kā aprakstīts iepriekš (13, 14). Īsumā, 80 ug katra parauga tika ielādēti SDS-PAGE, kas ļāva mums iepriekš frakcionēt paraugu, lai samazinātu tā sarežģītību. Pēc fiksācijas ar 50% metanolu/10% etiķskābi želejas tika mazgātas un sensibilizētas ar 0,02% Na2S2O3. Pēc tam želejas 10 minūtes iekrāsoja ar 0, 1% AgNO3, noskaloja un attīstīja ar 3% Na2CO3 / 0, 05% formaldehīdu. Pēc tam katra proteīna josla tika sagriezta četrās šķēlēs un noņemta. Pēc reducēšanas ar DTT un alkilēšanas ar jodacetamīdu (IAA), proteīni tika fermentēti sagremoti, izmantojot Trypsin / Lys-C (MS pakāpe; Promega Corporation). Pēc sagremošanas peptīdi tika eluēti, žāvēti un uzglabāti –20 ◦C līdz LC-MS/MS analīzei.

LC-MS/MS analīze

Kā aprakstīts iepriekš (13), peptīdu paraugi tika atjaunoti 5 ul 30% skudrskābes (FA), kas satur 10 fmol katrs no četriem sintētiskiem standarta peptīdiem, un atšķaidīti ar 40 ul. kustīgā fāze A (97,9% H2O, 2% ACN, 0,1% FA). Sintētiskie peptīdi [Glu1-Fribrinopeptide B – EGVNDNEEGFFSAR; M28 – TTPAVLDSDGSYFLYSK; HK0 – VLETKSLYVR; HK1 – VLETK(ε-AC)SLYVR] tika pievienoti katrā paraugā kā iekšējā kvalitātes kontrole LC-MS sistēmas stabilitātes uzraudzībai. Pēc tam desmit mikrolitri šī šķīduma tika ievadīti Dionex Ultimate 3000 nano LC sistēmā, kas savienota ar QExactive orbitrap masas spektrometru, kas aprīkots ar nanoizsmidzināšanas jonu avotu (Thermo Fisher Scientific). Veicot iepriekšēju koncentrāciju, peptīdus ievietoja 2 cm × 75 μm C18 Pepmap100 priekškolonnā (Thermo Fisher Scientific) ar plūsmas ātrumu 10 ul/min, izmantojot mobilo fāzi A. Peptīdu eluēšana no priekškolonnas līdz 50 cm × 75 μm p10 Pepmap10 Pepma. analītiskā kolonna (Thermo Fisher Scientific) un sekojoša atdalīšana tika panākta ar plūsmas ātrumu 300 nl/min, izmantojot gradientu no 8% līdz 40% kustīgās fāzes B (80% ACN, 19,9% H2O, 0,1% FA) 235 minūšu laikā. Tika veikta masas spektrometriskā noteikšana, veicot MS skenēšanu diapazonā no m/z 400 līdz 1400 ar izšķirtspēju 70 000 (pie m/z =200). 12 visbiežāk sastopamo jonu MS/MS skenēšana tika panākta ar HCD sadrumstalotību pie 30% normalizētas sadursmes enerģijas un tika analizēta orbitālajā slazdā ar izšķirtspēju 17 500 (pie m/z =200). Visi paraugi tika analizēti divos eksemplāros. Masu spektrometrijas proteomikas dati ir deponēti ProteomeXchange konsorcijā (//proteomecentral.proteomexchange.org), izmantojot PRIDE partneru repozitoriju (15) ar datu kopas identifikatoru PXD018999 un 10.6019/PXD018999.

Proteīna identifikācija un bez etiķetēm

Kvantifikācija (LFQ) Olbaltumvielu identificēšana, kvantifikācija bez etiķetēm (LFQ), kā arī statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot programmatūru MaxQuant 1.5.2.8, tostarp meklētājprogrammu Andromeda un Perseus statistiskās analīzes pakotni (16, 17), kas ir plaši izmantota darbplūsma. bises proteomikas datu apstrādei un statistiskai novērtēšanai. Olbaltumvielas tika identificētas, izmantojot UniProt datubāzi muskulatūras proteīniem (versija 170428 ar 16 854 ierakstiem, tikai pārskatītajiem ierakstiem), peptīdu masas pielaide 25 ppm, MS/MS atbilstības tolerance 2{{21 }} ppm, un ne vairāk kā divas izlaistas šķelšanās ar tripsīnu kā proteāzi. Meklēšanas kritēriji arī ietvēra cisteīnu karbamidometilēšanu kā fiksētu modifikāciju, metionīna oksidēšanu, kā arī N-gala proteīna acetilēšanu kā mainīgas modifikācijas un vismaz divas peptīdu identifikācijas katrai olbaltumvielai, vismaz viena no tām ir unikāla. Turklāt atbilstība starp piegājieniem tika veikta, izmantojot 5 minūšu spēles laika logu un 15-minūšu izlīdzināšanas laika logu. Gan peptīdiem, gan proteīniem tika piemērots viltus atklāšanas līmenis (FDR), kas bija mazāks par 0,01. Statistiskai analīzei tika veikti savstarpēji salīdzinājumi starp normoksiskiem un hipoksiskiem nieru paraugiem, lai noteiktu proteīnu grupas, kuras hipoksijas gadījumā tika ievērojami paaugstinātas vai samazinātas. Šim nolūkam, izmantojot Perseus statistiskās analīzes paketi, tika aprēķinātas LFQ vērtību atšķirības. Izmaiņas proteīnu pārpilnības vērtībās starp normoksiskiem un hipoksiskiem nieru paraugiem tika noteiktas ar divpusēju t-testu ar p < 0, 05 un vismaz divkāršu daudzuma starpību. Šajā pētījumā tika ņemtas vērā visas olbaltumvielas, kas atbilst šiem kritērijiem. Turklāt, lai uzsvērtu visspēcīgāko regulējošo ietekmi uz hipoksiju, ievērojami regulēja proteīnus ar globālu FDR<0.05 as determined by a permutation-based method were analyzed.

Funkcionālā anotācija un klasterizācija

Funkcionālo anotāciju klasterizācija tika veikta, izmantojot gēnu ontoloģijas resursu datubāzi (18–20) un DAVID platformu (21) (//david.ncifcrf.gov). Olbaltumvielu tīkli tika ģenerēti, izmantojot datu bāzi STRING (22). Atšķirīgās ekspresijas vērtības starp normoksiskās un hipoksiskās kontroles grupas E18.5 nierēm tika kartētas ar Heatmapper (23) (//www.heatmapper.ca).

Imūnhistoķīmija

PFA fiksētas, parafīnā iestrādātas audu sekcijas tika rehidratētas, un endogēnā peroksidāze tika bloķēta, priekšmetstikliņus inkubējot 1,5% H2O2 šķīdumā (0.02 M citronskābe, 0). {40}}6 M Na2HPO4) istabas temperatūrā 15 minūtes tumsā. Antigēna iegūšana tika veikta, vārot Tris-EDTA (pH 9) vai citronskābes buferšķīdumā 20 minūtes, pēc tam lēni atdzesējot līdz RT. Pēc 1 stundu bloķēšanas 2% BSA PBS pie RT, sekcijas tika inkubētas ar primārajām antivielām bloķējošā šķīdumā o/n 4 ◦C temperatūrā (MPO, ab208670; CAV1, ab32577; abas Abam). Pēc trim mazgāšanas posmiem PBS, sekcijas tika inkubētas ar HRP konjugētu sekundāro anti-trušu antivielu (K4003, Dako EnVision+ System no Agilent) 1 stundu RT. Pēc trim mazgāšanas posmiem PBS signāls tika izstrādāts ar DAB (Agilent, K3468). Sekcijas tika iekrāsotas, dehidrētas un uzstādītas, izmantojot Eukitt barotni (Sigma, 03989). Saskaņā ar ražotāja sniegto informāciju 8-OHdG (MOG-100P, JaICA) noteikšanai tika izmantots Vector MOM imūndetekcijas komplekts (BMK-2202). Spilgta lauka attēli tika iegūti ar Nikon E600 mikroskopu (Plan Fluor ELWD 20×/0.45 objektīvs) ar Digital Sight DS-UE kameras kontrolieri un DS-Ri1 kameru (abi Nikon), izmantojot Nikon programmatūru NIS Elements 4.0.

Enzīmu

Laktāta kvantitatīvā noteikšana Laktāta līmeņa noteikšana E18.5 nierēs tika noteikta pēc parauga deproteinēšanas ar centrifūgas kolonnām, izmantojot enzīmu komplektu MAK064- 1KT (Sigma), saskaņā ar ražotāja sniegto informāciju.

Cilvēka studijas

Cilvēku izpēti apstiprināja Šveices Federālā Tehnoloģiju institūta (EK 2011-N-51) Ētikas komiteja, un tā tika veikta saskaņā ar Helsinku deklarāciju. Īsumā, informēta piekrišana tika iegūta no deviņiem veseliem, nesmēķējošiem zemienēm (astoņi vīrieši un viena sieviete). Kā ziņots iepriekš, šiem brīvprātīgajiem tika secīgi novērtēti vairāki fizioloģiskie parametri pirms 4-nedēļas nepārtrauktas uzturēšanās lielā augstumā, tās laikā un pēc tās (10).

Šūnu kultūra

Primārās proksimālās tubulārās šūnas (pPTC) tika izolētas no {{0}} līdz 4- nedēļu vecām C57BL/6N vīriešu nierēm, kā aprakstīts iepriekš (24). Īsumā, proksimālie cauruļveida fragmenti tika iegūti, sagremot kortikālo nieru audus ar kolagenāzi un pēc tam filtrējot caur 250 μm un 80 μm poru izmēra membrānu. PTC tika kultivēti DMEM/F12 (Gibco, 21041-025), kas papildināts ar 15 mM HEPES, 0,55 mM NaPiruvate, 1% NEAA un nieru epitēlija šūnu augšanas barotnes (REGM) piedevām (Lonza, CC-4127). . Pēc saplūšanas pPTC tika vienreiz sadalīti, izmantojot Accutase šķīdumu (Sigma, A6964), un atkārtoti pārklāti. Hipoksijas gadījumā šūnu kultivēšana tika veikta pie 1% skābekļa 48 stundas; normoksiskās kontroles tika kultivētas pie 19% skābekļa.

ELISA

Klotho vai Sirt6 līmenis serumā tika noteikts, izmantojot šādus komplektus peļu paraugiem (CSB-E14362m, Cusabio tehnoloģija un OKCD02892, Aviva Systems Biology) un cilvēka paraugiem (CSB E17018h un CSB-E13235h; abi Cusabio tehnoloģija), ievērojot sniegtos protokolus. Peles augļa asinis tika savāktas no atdalītu E18.5 augļu stumbra. Peles asinis no pieaugušajiem dzīvniekiem tika ņemtas no vena saphena. Cilvēka seruma paraugi tika iegūti no iepriekšējā pētījuma (10).

Bisulfīta PCR

DNS no dzīvniekiem, kas ārstēti ar E18.5 hipoksiju vai normoksiju, tika ekstrahēta ar Qiagen asins un audu komplektu un pārveidota par bisulfītu, izmantojot EpiTect Bisulfite Kit no Qiagen saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Divdesmit nanogrami pārveidotas DNS tika izmantoti kā veidne PCR reakcijā ar AmpliTaq Gold (Invitrogen). Izmantojot MethPrimer 2, tika izstrādāti šādi primeri.0: Klotho, 248 bp fragments (-234/+14 no TSS), Kl_BS_F (TAG TTT TAG GAA GGT AAA GGG AGT G) un Kl_BS_R (AAC AAT AAT TAT CCA AAA CAA AC) (25); Mki67, 497 bp fragments (~1 kb augšpus TSS), Mki67_BS_F (TTG GAA GAA TAT TGA TTT AGG AA) un Mki67_BS{{20} }R (ACC TAT AAA CTC CCT CTC CAA AAA T). PCR produkti tika ligēti pCR{21}}TOPO-Vector, izmantojot TOPO TA klonēšanas komplektu sekvencēšanai (Invitrogen), un pārveidoti DH10 baktērijās. Kloni tika nosūtīti sekvencēšanai (Microsyth Seqlab GmbH). Pārbaude, izlīdzināšana, vizualizācija un statistika tika veikta ar QUMA kvantitatīvās noteikšanas rīku metilēšanas analīzei (26).

Statistika

Tika veikta statistiskā analīze un grafiki izveidoti ar GraphPad Prism 8. versiju (https://www.graphpad.com). Divu grupu nozīmīgums tika pārbaudīts ar nesapārotiem divpusējiem t-testiem ar Velča korekciju vai bez tās (Velča korekcija tika veikta neparasti sadalītiem datiem, F dispersiju tests bija statistiski nozīmīgs, p < 0.05). Vairākas grupas tika pārbaudītas, izmantojot RM vienvirziena ANOVA ar Geisser-Greenhouse korekciju un Dunnett vairāku salīdzinājumu testu. p vērtības<0.05 were assumed significant. Means with standard deviation (SD) are shown.

Avota dati

Visu eksperimentu neapstrādātos datus, kas nav iegūti masas spektrometrijas analīzes rezultātā, var atrast izklājlapas avota datu failā S1 papildu datu kopā. Tas ietver datus, kas ir pamatā 1. A un D–H, 3. E un F, 5. B, 7. D–I, 8. att. un papildu S1 un S6.

REZULTĀTI

Hronisks

Augļa hipoksijas rezultāti embrijiem ar ierobežotu augšanu un pavājinātu nieru darbību pieaugušiem pēcnācējiem Lai 7 dienas pakļautu pārojušās mātītes pastāvīgai hipoksijai (10% skābekļa) (1.A attēls), tika izmantota hipoksijas kamera. Līdzīgi kā mūsu iepriekšējā darbā (27), māti ātri pielāgojās hipoksiskajai videi, un pēc dzimšanas metiena lielums un placentas masa bija līdzīgi normoksiskajām kontroles grūtniecēm (papildu att. S1, A-C). Neskatoties uz to, hipoksiskajiem E18.5 augļiem bija samazināts ķermeņa svars, salīdzinot ar normoksisko kontroli, kas atbilst IUGR kritērijiem (28) (1. att. joslas papildu attēls S1D) un par 40% samazināts nefronu skaits (1. attēls, C un D). Šis samazinājums nebija saistīts ar nefronu deģenerāciju (nekrozi vai apoptozi) intrauterīnās attīstības laikā hipoksijas apstākļos, kā ziņots iepriekš (27). Turklāt, neskatoties uz ievērojamo augšanas periodu 3 nedēļas pēc dzimšanas, par ko mēs ziņojām iepriekš (27), pieaugušiem pēcnācējiem hipoksiskiem pēcnācējiem 8 mēnešos bija ievērojami samazināta nieru darbība (1. att.) un palielināta fibrotisko marķieru ekspresija 15 mēnešos (att. 1, F–H), tādējādi apstiprinot mūsu pieejas kā stabila IUGR modeļa derīgumu un ilustrējot Bārkera teoriju par pieaugušo slimību augļa programmēšanu.

Wecistanche atbalsta dienests - lielākā cistanche eksportētāja Ķīnā:

E-pasts:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel.:+86 15292862950

Iegādājieties sīkāku informāciju par specifikācijām:

Skatīt šeit: https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

IEGŪT DABĪGU ORGANISKO CISTANŠES EKSTRAKTU AR 25% EHINAKOZĪDU UN 9% AKTEOZĪDU NIERU INFEKTĀCIJAI