Dīzeļdegvielas izplūdes gāzu iedarbība maina tīklu izpausmi, kas saistīti ar zebrafish smadzeņu neirodeģenerāciju 1. daļa

Abstrakts

Neirodeģeneratīvās slimības ir galvenais invaliditātes cēlonis pasaulē, taču to etioloģija lielākoties joprojām ir nenotverama. Ģenētiskie faktori var radīt tikai nelielu risku lielākajai daļai šo traucējumu, kas liecina, ka vides faktoriem ir nozīmīga loma šo slimību attīstībā.

Neirodeģeneratīvās slimības attiecas uz slimības veidu, kas dažādu iemeslu dēļ izraisa smadzeņu šūnu deģenerāciju. Visbiežāk sastopamās slimības ir Alcheimera slimība, Parkinsona slimība, Hantingtona slimība utt. Šīs slimības ietekmē smadzeņu neironus, kā rezultātā tiek traucēta smadzeņu darbība un simptomi, piemēram, atmiņa, domāšana un uzvedības izmaiņas.

Tomēr mums nav jāzaudē pozitīvā attieksme šo slimību dēļ. Ir daudzi veidi, kā palīdzēt pacientiem uzlabot atmiņu un atvieglot simptomus. Apskatīsim dažas no šīm metodēm:

Pirmkārt, veiciet fiziskus vingrinājumus. Pētījumi liecina, ka fiziskās aktivitātes uzlabo asinsriti smadzenēs un palielina ķīmisko vielu, piemēram, dopamīna un endorfīnu, izdalīšanos, kas palīdz aizsargāt un uzlabot neironu darbību. Tajā pašā laikā vingrošana var arī palīdzēt samazināt tādas problēmas kā nemiers, depresija un bezmiegs, padarot pacientiem patīkamāku dzīvi.

Otrkārt, uzturiet sociālās attiecības. Ir arī ļoti svarīgi, lai mūsu sociālie tīkli būtu cieši saistīti ar radniecīgām smadzeņu zonām, un sociālā mijiedarbība var ne tikai samazināt stresu, bet arī uzlabot smadzeņu veselību, palielinot laimi, cīnoties ar depresiju un daudz ko citu.

Visbeidzot, ēdiet labi un pietiekami gulēt. Abi šie aspekti var būtiski ietekmēt smadzeņu veselību. Labam uzturam ir ne tikai jāiekļauj pietiekami daudz barības vielu, bet arī jāizvairās no atkārtotas pārmērīga cukura, piesātināto tauku un holesterīna patēriņa. Turklāt pietiekami daudz miega var palīdzēt cīnīties pret atmiņas problēmām dažādos posmos, īpaši ar tādām slimībām kā Alcheimera slimība.

Īsāk sakot, neirodeģeneratīvās slimības nenozīmē atteikšanos no dzīves cerībām. Saglabājot pozitīvu attieksmi, nepieciešams arī pieņemt zinātniskas un efektīvas metodes dzīves kvalitātes uzlabošanai. Vairāk smieklu un vairāk saules palīdzēs jums saglabāt veselību. Var redzēt, ka mums ir jāuzlabo atmiņa, un Cistanche deserticola var ievērojami uzlabot atmiņu, jo Cistanche deserticola ir tradicionāls ķīniešu ārstniecības materiāls, kam ir daudz unikālu efektu, no kuriem viens ir atmiņas uzlabošana. Cistanche deserticola iedarbīgumu nodrošina vairākas tajā esošās aktīvās sastāvdaļas, tostarp miecskābe, polisaharīdi, flavonoīdu glikozīdi utt. Šīs sastāvdaļas var veicināt smadzeņu veselību, izmantojot dažādus ceļus.

Noklikšķiniet uz zināt 10 veidus, kā uzlabot atmiņu

Nesen tika konstatēts, ka ilgstoša gaisa piesārņojuma iedarbība palielina Alcheimera un Parkinsona slimību risku, taču molekulārie mehānismi, ar kuriem tas darbojas, nav labi saprotami.

Zebrafishembrys, kas pakļauti dīzeļdegvielas izplūdes daļiņu ekstraktam (DEPe), izraisa disfunkcionālu autofagiju un neironu zudumu. Šeit mēs pakļāvām zebrafijas embrijus DEPe un veicām lielas caurlaidības proteomiskās un transkriptomiskās ekspresijas analīzes no viņu smadzenēm, lai identificētu gaisa piesārņojuma izraisītos patogēnos ceļus. Ārstēšana ar DEPe mainīja vairākus bioloģiskos procesus un signalizācijas ceļus, kas attiecas uz neirodeģeneratīviem procesiem, tostarp ksenobiotisko metabolismu, fagosomu nobriešanu un amiloīda apstrādi. Vislielākā gēnu ekspresijas smadzeņu indukcija bija Cyp1A (vairāk nekā 30- reizes).

Šo izteiksmes izmaiņu nozīmīgumu apstiprināja, bloķējot indukciju, izmantojot CRISPR / Cas9, kā rezultātā dramatiski palielinājās jutība pret DEPe toksicitāti, apstiprinot, ka Cyp1A indukcija bija kompensējošs aizsardzības mehānisms.

Šajos pētījumos tika identificēti traucēti molekulārie ceļi, kas var veicināt neirodeģeneratīvo traucējumu patoģenēzi. Galu galā gaisa piesārņojuma molekulārā pamata noteikšana palielina neirodeģenerācijas risku, palīdzēs izstrādāt slimību modificējošas terapijas.

Atslēgvārdi

Gaisa piesārņojums · Demence · Parkinsona slimība · Alcheimera slimība · Transkriptomika ·Proteomika.

Ievads

Gaisa piesārņojums ir galvenais mirstības veicinātājs, un tas ir saistīts ar elpceļu slimībām, sirds slimībām, insultu, plaušu vēzi un diabētu. Jaunie epidemioloģiskie pierādījumi apstiprina saikni starp gaisa piesārņojuma iedarbību un neirodeģeneratīvu slimību, tostarp Alcheimera un Parkinsona slimību (AD un PD) attīstību (Fu et al. 2019). Ir maz pētījumu, lai izpētītu mehānismus, ar kuriem gaisa piesārņojums var palielināt AD un PD risku, taču daži, kas pastāv, atbalsta cēloņsakarību (Fu et al. 2019).

Olbaltumvielu ieslēgumu uzkrāšanās smadzenēs ir universāla neirodeģeneratīvo traucējumu iezīme un, iespējams, ir izplatīts ceļš, kas izraisa neironu disfunkciju un nāvi. Piemēram, amiloid-beta (A-beta) un tau struktūru veidošanās ir AD un -sinukleīna (-syn) agregātu vai Lewy ķermeņu patoloģiskas pazīmes PD (Ross un Poirier 2004; Woulfe 2008).

Šķiet, ka proteostāzes izmaiņas vismaz daļēji ir šo agregātu veidošanās pamatā, taču precīzi mehānismi joprojām nav zināmi un var atšķirties atkarībā no ģenētiskajiem un vides riska faktoriem. Mēs zinām, ka A-betaor-syn pastiprināta ekspresija vai samazināta degradācija var izraisīt AD un PD (Bostancıklıoğlu2019; Johnson et al. 2019).

Citas kopīgas neirodeģeneratīvo traucējumu pazīmes ir iekaisums un oksidatīvais stress. Aktivētās mikroglijas, iekaisuma šūnas CNS, var viegli novērtēt AD un PD smadzeņu autopsijās, un tās, iespējams, veicina neirodeģenerācijas patoģenēzi (Kannarkat et al. 2013). Tiek uzskatīts, ka šis iekaisums un, iespējams, mitohondriju disfunkcija izraisa oksidatīvo stresu, ko novērtē arī smadzeņu autopsija (Picca et al. 2020).

Lielākā daļa mehānisko pētījumu par gaisa piesārņojumu un neirodeģenerāciju līdz šim ir vērsti uz iekaisumu (Jayaraj et al. 2017). Šķiet, ka gaisa piesārņojums palielina gan CNS iekaisumu, gan oksidatīvo stresu dzīvnieku un cilvēku smadzenēs (Calderón-Garcidueñas et al. 2004, 2007, 2008a, b un c; Levesque et al. 2011a, b, 2013; Moultonand Yang 2012; Mumaw et al. 2017; Yokota et al.2013a, b).

Īpaši interesanti ir atklājumi, ka gaisa piesārņojums palielina dažu iekaisuma gēnu ekspresiju peļu ožas spuldzē (OB) — smadzeņu reģionā, kur PD patoloģija tiek novērota slimības sākumā (Levesque et al. 2011a, b; Yokota et al. 2013a). . Iekaisums tika novērots arī pilsētās dzīvojošajiem suņiem, salīdzinot ar tiem, kas dzīvo lauku apvidos, un autori minēja, ka šīs izmaiņas izraisīja augsts gaisa piesārņojuma līmenis (Calderón-Garcidueñas et al. 2003).

Tie paši autori arī ierosināja, ka -syn uzkrājās pilsētās dzīvojošo cilvēku smadzenēs gaisa piesārņojuma dēļ (Calderón-Garcidueñas et al. 2004, 2008a, b). Nesenā pētījumā ar zebrafish modeli tika ziņots, ka DEPe iedarbība izraisa neirotoksicitāti un ievērojamu neironu skaita samazināšanos, izjaucot autofagiju (Barnhill et al. 2020).

DEPe satur daudzas gaisa piesārņojuma toksiskās sastāvdaļas, un to parasti izmanto, lai modelētu iedarbību šūnu kultūras sistēmās (Costa et al. 2014; Hesterberg et al. 2010; Levesque et al. 2011b). Autofagija ir būtisks intracelulārs mehānisms nepareizi salocītu proteīnu un bojātu organellu noņemšanai un izskaušanai.

Patiešām, precīza autofagiskā aktivitāte ir nepieciešama šūnu homeostāzei, un disfunkcionāla autofagija neironos izraisa izdzīvošanas izmaiņas un neirodeģenerāciju (Kesidou et al. 2013). Daudzos no šiem pētījumiem ir skaidri ierobežojumi, taču tie visi liecina, ka gaisa piesārņojuma iedarbība palielina AD risku. un PD. Mūsu izpratne par mehānismiem, ar kuriem piesārņojums palielina šo risku, ir ierobežota, taču īpaši smalkas daļiņas un vairākas gaisa piesārņojuma sastāvdaļas var iekļūt smadzenēs vai nu tieši caur ožas spuldzi caur plaušām caur asinsriti (Kilian un Kitazawa 2018).

Šīs daļiņas sastāv no oglekļa kodola un adsorbētiem savienojumiem, piemēram, policikliskiem aromātiskiem ogļūdeņražiem, metāliem, nitrātiem, sulfātiem un citiem elementiem, un tās veido ievērojamu daļu gaisa piesārņotāju, jo īpaši pilsētu teritorijās. Daudzi no šiem savienojumiem ir saistīti ar oksidatīvo stresu un šūnām. toksicitāte, kas palielina ticamību gaisa piesārņojuma un neirodeģenerācijas cēloņsakarībai.

Detalizēti daudznozaru pētījumi, tostarp šūnu un dzīvnieku modeļi, var sniegt ieskatu slimību cēloņos un virzīt turpmākās terapeitiskās pieejas (Cannon un Greenamyre 2011). Starp paraugorganismiem, ko izmanto in vivo pētījumos, Danio rerio (zebrafish) ir spēcīgs modelis toksikoloģijas, molekulārās ģenētikas, toksikogenomikas un zāļu atklāšanas pētīšanai.

Lielākā daļa bioloģisko ceļu ir ļoti konservēti mugurkaulniekiem, un lielākajai daļai funkcionālo cilvēka gēnu ir homologi zebrafish (Vaz et al.2018). Turklāt zebrafish embriji attīstās ātri un neatkarīgi, ļaujot veikt analīzi jebkurā vēlamajā attīstības stadijā. Šīs īpašības kopā ar ātru pavairošanu un zemajām audzēšanas izmaksām padara zebrazi par labvēlīgu modeli vides iedarbības toksiskās ietekmes pētīšanai.

Lai labāk izprastu slimības patoģenēzes molekulāros mehānismus, ir izstrādāts plašs augstas caurlaidības gēnu ekspresijas profilēšanas metožu klāsts. Uz masas spektrometriju balstīta proteomika un augstas caurlaidspējas RNS sekvencēšana ir īpaši daudzsološa, identificējot interesējošos bioloģiskos ceļus. Šīs metodes ir plaši izmantotas, lai izprastu šūnu un dzīvnieku modeļu reakciju uz vides stimuliem (Duan et al. 2017; García-Estrada et al. 2013; Jamiet al. 2014a, b, 2015; Kosalková et al. 2012).

Šajā pētījumā mēs esam veikuši ekspresijas analīzi par DEPe ārstēšanas ietekmi gan uz proteomu, gan transkripta profiliem zebrafishembryos galvās. Paraugu izolēšana no galvas, kas galvenokārt sastāv no smadzeņu audiem, ļāva iegūt audiem raksturīgākus profilus un samazināt ietekmi, kas rodas no citiem audiem. Šeit mēs aprakstām mainītās gēnu ekspresijas un olbaltumvielu profilus vairākos ceļos, kas saistīti ar neirodeģenerāciju DEPe pakļauto zebrazivju galvās. Šie rezultāti sniedz jaunu ieskatu iespējamajos mehānismos, ar kuriem gaisa piesārņojums palielina AD un PD risku.

Materiāls un metodes

Zivju ārstēšana un CRISPR/Cas{0}}starpnieks gēnu notriekšana

Visus pētījumus apstiprināja UCLA Dzīvnieku tiesību komiteja. Zebrafish (AB) tika audzētas ar gaismas stimulāciju 1 stundu, un kopējais 200 olu skaits tika inkubēts 24 stundas 28 grādu temperatūrā. Iegūtie embriji tika dehorionēti pronāzē (2 mg/ml) un apstrādāti vai nu ar DEPe (standarta atsauces materiāli, NIST, Gaithersburg, MD) ar galīgo koncentrāciju 20 ug/ml vai nesēju līdz 5 dienām pēc apaugļošanas (DPF).

Šī koncentrācija tika izvēlēta, jo tā izraisīja neironu zudumu, kā ziņots iepriekš, bet bez ievērojamas mirstības (Barnhillet al. 2020). Cyp1A notriektas zivis tika sagatavotas šādi. Izmantojot vietnē http://crispr.mit.edu pieejamos rīkus, CRISPR RNS (Cyp1A-crRNA) ) tika izstrādāts, pamatojoties uz piemērotu PAM vietu atrašanās vietu Cyp1A gēna pirmajā eksonā.

Labākais dizains tika iegādāts no IDT DNS (www.idtdna.com) kopā ar standarta CRISPR-Cas9 tracrRNS. Cyp1Agene un tracrRNS crRNS tika atsevišķi atkārtoti suspendētas 10 mM Tris-EDTA, lai iegūtu 100 μM galīgo koncentrāciju. Pēc tam tracrRNS tika apvienota ar crRNAin 1 × dupleksa buferšķīdumu (100 mM kālija acetāts; 30 mM HEPES, pH 7, 5; IDT DNS), lai iegūtu galīgo koncentrāciju 10 μM. Maisījums tika uzkarsēts līdz 95 grādiem 5 minūtes verdoša ūdens vannā un lēnām atdzesēts līdz istabas temperatūrai, lai nodrošinātu komplementāro nukleotīdu sekvenču incrRNS un tracrRNS atkausēšanu un funkcionālās virzošās RNS (gRNS) veidošanos.

Pēc tam 3 μL atkvēlinātās gRNS tilpums tika apvienots ar tādu pašu donora vienas virknes DNS (ssDNS; 200 μM) tilpumu kā Cyp1A mutanta veidnes secība. Maisījumam tika pievienots 3 ug Cas9 nukleāzes (IDT) 1x injekcijas buferšķīdumā (5 mM KCl; 0,1 M nātrija fosfāts, pH 6,8), lai izveidotu galīgos CRISPR/Cas9ribonukleoproteīna (Cyp1A-RNP) kompleksus.

Scramble RNP (SC-RNP) sagatavošanai specifiskā Cyp1A-crRNS tika aizstāta ar komerciālu Scramble-crRNS bez mērķa genomā. Šīs visu šajā darbā izmantoto oligonukleotīdu secības ir uzskaitītas 1. papildu tabulā. Olas tika injicētas stereomikroskopā ar aptuveni 3 nL RNP injekcijas maisījumu.

Tika veiktas piecas bioloģiskas atkārtotas injekcijas (katrs atkārtojums ietvēra 400–600 olas, kas injicētas ar Cyp1A-RNP, un 100–200 olas, kas injicētas ar SC-RNP), un visas mikroinjekcijas tika pabeigtas 60 minūšu laikā. Olas tika ievietotas 100 mm plastmasas Petri trauciņos un inkubētas 28 grādu temperatūrā olu ūdenī. Embriju izdzīvošanas līmenis tika novērots līdz 7 dienām.

Izdzīvojušo zivju attēli tika pārskatīti, lai novērtētu anomālijas. Katrs kāpurs tika akls, lai noteiktu 4 attīstības anomālijas, tostarp galvas malformācijas, astes anomālijas, sirds tūsku un dzeltenuma tūsku. Kāpuri ar visām 4 malformācijām tiks novērtēti ar 4, savukārt normāli attīstās kāpuri 0. Lai novērtētu būtiskās atšķirības, tika izmantots statistiskais T-tests.

For more information:1950477648nn@gmail.com