Dīzeļdegvielas izplūdes gāzu iedarbība maina tīklu izpausmi, kas saistīti ar zebrafish smadzeņu neirodeģenerāciju 2. daļa

Olbaltumvielu parauga sagatavošana

Lai sagatavotu proteīna paraugus, galviņas no 8{4}} līdz 100 anestēzētu kāpuru (5 pdf) tika rūpīgi izolētas un mazgātas ar PBS, pirms tika pārnestas uz līzes buferšķīdumu, kas sastāvēja no 15% iepriekš atdzesēta TCA/acetona, kas satur 0,07% beta-merkaptoetanola (ME). )un proteāzes inhibitoru kokteilis (nepieciešams ražotājs) ar kopējo tilpumu 500 ul.

Pēdējos gados ir bijusi ievērojama interese par olbaltumvielu paraugu ietekmi uz atmiņu. Arvien vairāk cilvēku sāk apzināties uztura nozīmi veselībai, jo īpaši olbaltumvielu svarīgo lomu cilvēka organismā.

Olbaltumvielas ir cilvēka ķermeņa pamatmateriāli, un tiem ir svarīga loma cilvēka organismā. Šī iemesla dēļ proteīnu paraugi ir kļuvuši par svarīgu kanālu daudziem cilvēkiem, tiecoties pēc veselības un skaistuma. Papildus muskuļu veidošanai un ķermeņa veidošanai olbaltumvielu paraugi var arī uzlabot cilvēka atmiņu.

Daži zinātnieki ir pētījuši saistību starp olbaltumvielām un atmiņu. Viņi atklāja, ka ilgstoša pietiekama proteīna uzņemšana ir labvēlīga visiem fiziskās veselības aspektiem, īpaši atmiņai. Arvien vairāk pierādījumu liecina, ka olbaltumvielu uzņemšana ar uzturu būtiski ietekmē smadzeņu darbību un atmiņu.

Olbaltumvielas ir svarīga neironu sastāvdaļa cilvēka smadzenēs, tāpēc ikdienas olbaltumvielu uzņemšana būtiski ietekmē cilvēku atmiņu un domāšanas spējas. Ilgstoša olbaltumvielu uzņemšana ne tikai apmierina ķermeņa vajadzības pēc proteīna, bet arī palīdz smadzenēm palikt aktīvām un veselām.

Turklāt olbaltumvielas var arī palīdzēt organismam uzturēt cukura līmeni asinīs un uzturēt stabilu garastāvokli. Tas ir ļoti svarīgi, lai saglabātu atmiņu un domāšanas prasmes. Tāpēc mērena olbaltumvielu uzņemšana var palīdzēt uzlabot dažādas cilvēka ķermeņa kognitīvās funkcijas un emocionālo stāvokli.

Kopumā pastāv cieša saikne starp olbaltumvielu paraugiem un atmiņu. Proteīna uzņemšanas palielināšana palīdz uzturēt jūsu smadzenes un ķermeni veselīgu, uzlabo domāšanas prasmes un atmiņu. Cilvēkiem, kuriem jāuzlabo atmiņa, ļoti nepieciešams uzņemt atbilstošu daudzumu olbaltumvielu. Mums vajadzētu pareizi ēst olbaltumvielu pārtiku un pievērst uzmanību saprātīgām ēdienreizēm, lai saglabātu veselīgu ķermeni un asu prātu. Var redzēt, ka mums ir jāuzlabo atmiņa, un Cistanche deserticola var ievērojami uzlabot atmiņu, jo Cistanche deserticola piemīt antioksidanta, pretiekaisuma un pretnovecošanās iedarbība, kas var palīdzēt samazināt oksidācijas un iekaisuma reakcijas smadzenēs, tādējādi aizsargājot nervu sistēmas veselība. Turklāt Cistanche deserticola var arī veicināt nervu šūnu augšanu un atjaunošanos, tādējādi uzlabojot neironu tīklu savienojamību un darbību. Šie efekti var palīdzēt uzlabot atmiņu, mācīšanos un domāšanas ātrumu, kā arī var novērst kognitīvo disfunkciju un neirodeģeneratīvo slimību attīstību.

Noklikšķiniet uz zināt papildinājumus, lai uzlabotu atmiņu

Pēc īsas homogenizācijas olbaltumvielas tika nogulsnētas 12 stundas pie 20 grādiem, kam sekoja centrifugēšana ar ātrumu 12, 000 apgr./min 5 minūtes pie 4 grādiem. Supernatants tika noņemts un proteīna granulas divas reizes nomazgātas ar aukstu acetonu (satur 0.07% ME un proteāzes inhibitoru kokteiļus). Galīgā proteīna granula tika izšķīdināta līzes buferšķīdumā, kas satur 7,0 M urīnvielu, un 2,0 M tiourīnvielu, apstrādājot ar ultraskaņu uz ledus.

Izšķīdinātos proteīna paraugus centrifugēja ar ātrumu 15, 000 apgr./min 10 minūtes 4 grādu temperatūrā, lai izgulsnētu nešķīstošās daļiņas, un galīgo proteīna paraugu koncentrācija tika mērīta, izmantojot Bredforda metodi.

Uz TMT balstīta augstas caurlaidspējas proteomikas analīze

Paraugi tika reducēti, alkilēti un sagremoti, secīgi pievienojot tripsīnu un liz-C proteāzes. Pēc tam peptīdi tika marķēti, izmantojot 10-plexTMT izobariskos tagus saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Marķētie paraugi tika sajaukti un pēc tam smalki frakcionēti, izmantojot augsta pH apgrieztās fāzes hromatogrāfiju.

Pēc tam atsevišķas frakcijas tika analizētas ar LC–MS/MS, izmantojot tiešsaistes apgrieztās fāzes hromatogrāfiju un tandēma masas spektrometriju uz Thermofsher Fusion Lumos masas spektrometra. Dati tika iegūti, izmantojot sinhrono prekursoru atlasi balstīto MS3 metodi, kā aprakstīts iepriekš (McAlister et al. 2014). Meklēšana datu bāzē un TMT reportiera jonu informācijas ieguve tika veikta, izmantojot MaxQuant programmatūras platformu (Cox un Mann 2008).

TMT datu salīdzināšana starp paraugiem tika veikta, izmantojot MSStats (Choiet al. 2014). Transkriptomiskā analīze Aptuveni 80–100 galvas tika izolētas no anestēzijas embrijiem (120 stundas), nomazgātas ar PBS un pakļautas pilnīgai RNS ekstrakcijai, izmantojot Trizol (Sigma Aldrich, Saint Louis). , ASV) reaģentu, ievērojot ražotāja norādījumus.

RNS kvalitāte un daudzums tika novērtēts, izmantojot spektrofotometru NanoDrop2000 (Thermo Scientific, MA) un tālāk ar Agilent 2100 Bioanalyzer, lai nodrošinātu minimālo koncentrāciju 50 ng/ul un RNS integritātes numuru (RIN) 8. Pēc tam bibliotēkas sagatavošana tika veikta, izmantojot Illumina HiSeq4000according4000according4000. protokols: "TruSeqStranded Total RNA Library Sagatavošanas darbplūsma ar Ribo-Zero Gold", un paraugi tika secīgi ar šādiem nosacījumiem: "Paired End run, R1=75 cycles (antisense virkne), Index=8 ciklus, R2=75 cikli (sajūtu virkne)."

Datu analīze

Abas proteomikas un transkriptomikas pētījumu datu kopas tika vienlaikus augšupielādētas un analizētas, izmantojot tiešsaistes rīku Metascape, kas ļauj veikt gēnu anotācijas dažādām sugām, tostarp Danio rerio (Zhou et al. 2019). Lai novērtētu proteomu vai transkripta profila izmaiņu ietekmi uz nespecifiskiem ceļiem, tika iegūti dati. analizēts, izmantojot Ingenuity Pathways Analysis (IPA) programmatūru (Krämer et al. 2014).

Lietojumprogrammā tika augšupielādētas datu kopas, kas satur gēnu vai olbaltumvielu identifikatorus un atbilstošās izteiksmes vērtības. Katrs identifikators tika kartēts ar atbilstošo objektu Ingenuity zināšanu bāzē.

Izteiksmes izmaiņu robežvērtība 1.{1}}tika iestatīta, lai identificētu molekulas, kuru ekspresija tika diferencēti regulēta. Funkcionālā analīze identificēja bioloģiskās funkcijas un/vai slimības, kas bija visnozīmīgākās datu kopā. Analīzei tika ņemtas vērā molekulas no datu kopas, kas atbilst robežvērtībai un bija saistītas ar bioloģiskām funkcijām. Labās malas Fišera precīzais tests tika izmantots, lai aprēķinātu p-vērtību, kas nosaka varbūtību, ka katra šai datu kopai piešķirtā bioloģiskā funkcija un/vai slimība ir tikai nejaušības dēļ.

Ceļu analīze

Lai novērtētu proteomu vai transkripta profila izmaiņu ieguldījumu konkrētos ceļos, abas datu kopas tika augšupielādētas IPA programmatūrā (Krämer et al. 2014). Pēc tam nozīmīgākie mainītie kanoniskie ceļi tika tālāk novērtēti un interpretēti, izmantojot PCR un Western blotēšanu, kā aprakstīts tālāk.

Western blotēšana

Pavisam 25 µg proteīnu tika ielādēti 12% NuPAGE (Novex, CA) un pārnesti uz PVDF membrānām (Novex, CA), kā aprakstīts (MahmoudianSani et al. 2017; Rafee et al. 2019). Membrānas tika bloķētas ar 5% vājpiena Tris buferšķīdumā un 0,01% Tween 20 (TBST buferšķīdums) 30 min istabas temperatūrā un pēc tam inkubētas nakti 4 grādu temperatūrā ar trušu poliklonālo anti-Cyp1A1 (Abcam, CA) vai peles monoklonālo anti-GA PDH. Abcam, CA), atšķaidīts TBST buferšķīdumā, kas satur 1% vājpiena.

Pēc mazgāšanas TBST blotus 2 stundas inkubēja ar sekundārajām ēzeļa anti-truša-HRP (Abcam, CA) vai kazas anti-peles-HRP (Santa Cruz, CA) antivielām, kam sekoja izstrāde ar Pierce™ ECL Plus Western blotēšanas substrātu ( Thermo Fisher Scientific, ASV). Joslas tika vizualizētas, attēlveidojot, izmantojot LI-COR skeneri, un analizētas, izmantojot densitometriju (LI_COR Biosciences, NE).

Reāllaika PCR

Kopējā RNS tika izolēta no galvām, izmantojot TRIzol reaģentu (Sigma Aldrich, Saint Louis, ASV), ievērojot ražotāja norādījumus, un pēc tam izmērīja, izmantojot NanoDrop 2000 spektrofotometru (Thermo Scientific, MA). 1 ug katra RNS parauga tika reversi transkribēts, izmantojot iScript™ reversās transkripcijas supermix (Bio-Rad, CA), un reāllaika PCR tika veikta, izmantojot SsoAdvancedUniversal SYBR Green supermix (Bio-Rad, CA), un ir norādīti primeri. 1. papildu tabulā. Relatīvie ekspresijas līmeņi tika aprēķināti, izmantojot 2-ΔΔCT metodi, un statistiskais T-tests tika izmantots, lai novērtētu būtiskās atšķirības.

rezultāti un diskusija

Proteomiskā un transkriptomiskā analīze ir divi galvenie rīki, lai izprastu molekulāros mehānismus, kas ir slimības procesu pamatā, un reakciju uz vides stimuliem (Duan et al. 2017; García-Estrada et al. 2013; Jami et al. 2014a, b, 2015; Kosalková et al. 2012). . Šeit mēs veicām dziļas ekspresijas analīzi gan transkriptomiskajā, gan proteomiskajā līmenī zebrafish embriju galvās, kas pakļauti DEPe.

Galvas, kas sastāv galvenokārt no smadzeņu audiem, tika izolētas, lai novērstu citu audu ekspresijas profilus, jo mēs esam ieinteresēti noteikt CNS raksturīgos patoloģiskos ceļus.

Zebrazivju galviņu izteiksmes profils

Profila analīze sniedza 11 172 atklātus proteīnus un 14 748 mRNS mērķus no vairāk nekā 26, 000 kodējošajiem gēniem (Howe et al. 2013). No 11 172 proteīniem, kas identificēti no TMT marķētajiem paraugiem (2. papildu tabula), 141 proteīns tika ievērojami paaugstināts un 607 tika samazināts (3. papildu tabula un 1.a attēls). Līdzīgi 367 transkripti tika regulēti un 149 tika pazemināti starp 14 748 transkriptiem (4. papildu tabula), kas tika atklāti RNS-seq analīzē (1.b attēls un 5. papildu tabula).
Vairumā gadījumu augšregulētās proteomiskās un transkriptomiskās analīzes rezultāti bija konsekventi. Piemēram, visaugstāk regulētās olbaltumvielas ietver citohromu P450 Cyp1a, Cyp1c1, guaninennukleotīdus saistošo proteīna apakšvienību gamma, aneksīnu, Plexin B2b īso izoformu, dehidrogenāzes/reduktāzes (SDR saimes) loceklis 13-, piemēram, 1, S-antigēns tīklenes/pineāls. (arrestīns) b un sulfotransferāze6B1.

Tāpat gēni ar visaugstāko transkriptomisko regulējumu ietver citohroma P450 (Cyp1a), ķemokīna (C–C motīvs) ligandu 27a, aril-ogļūdeņraža receptoru represoru A, citohromu P450 (Cyp1b), unRh ģimenes C glikoproteīnu. ne vienmēr bija cieši saistīti.

Piemēram, komplekss 2, spektrīns alfa, sirds miozīna vieglā ķēde-1, SEC23 mijiedarbojošais proteīns, ATP-sintāzes membrānas apakšvienība EA, citohroms b un NAD atkarīgā proteīna dezacetilāze ir vieni no labākajiem proteīniem, kam ir ļoti zems regulējums, savukārt tīklenes ārējā segmenta membrānas proteīns 1a. , izšķīdušo vielu nesēju saime 5 (jodīda transportētājs), FBJ peles osteosarkomas vīrusa onkogēna homologs B, kompleksīns 4c, FOS līdzīgais antigēns 1a, opsīns 1 un v-fos uzrāda visaugstāko transkripcijas pazemināšanos (1. un 2. tabula).

Antivielas, kas atpazīst zebrafish proteīnus, ir ierobežotas, taču mēs apstiprinājām šo izmaiņu paraugu, izmantojot Western blot analīzi. Cyp1A proteīna augšupregulācija un Complexin 2 (CPLX2) pazemināšanās tika apstiprināta, izmantojot GAPDH kā slodzes kontroli (2.a attēls). Augstākus TAT ​​un UGT1B1 transkripcijas līmeņus un zemākus CHNRB un TH2 līmeņus apstiprināja arī qPCR, izmantojot Elf-alpha kā iekšējo kontroli (2.b attēls).

Gēnu anotācija

Ir vairāki tiešsaistes bioinformātiskie rīki un programmatūra, kas var sniegt noderīgu informāciju ģenētiskajā anotācijā. Tostarp šajā darbā tika izmantota Metascape ar Danio rerio gēnu anotācijas iespēju (Zhouet al. 2019).

Abas proteomisko un transkriptomisko pētījumu datu kopas tika vienlaikus augšupielādētas un analizētas, izmantojot šo tiešsaistes rīku. Pēc gan proteomisko, gan transkriptomisko izmaiņu izvades apvienošanas programmatūrā tika veikti vairāki procesi, piemēram, reakcija uz ksenobiotisko stimulu, ksenobiotiku metabolisms ar citohroma P450 palīdzību un ģenēzes ekspresijas regulēšana. tika konstatēti pēc DEPe apstrādes (3.a attēls).

Šī analīze arī liecināja par nomāktiem bioloģisko procesu līmeņiem, piemēram, "vizuālā uztvere", "fototransdukcija" un "ar G proteīnu saistītu receptoru internalizācija". Izmaiņas ar redzi saistītajos izteiksmes profilos nebija negaidītas, jo DEPe terapija agrīnās attīstības laikā izraisīja mazākas acis (dati nav parādīti).

Ksenobiotiskā metabolisma signalizācija

Ksenobiotikas, kas ir sveši dabiski vai sintētiski ķīmiski savienojumi, var izraisīt šūnu stresa reakciju, izraisot diferenciāciju, proliferāciju, apoptozi vai nekrozi. Patiešām, ķermenim ir aktīvi jāaizsargājas pret ksenobiotikām, kā arī toksiskiem endogēniem savienojumiem un to metabolītiem, ekspresējot fermentus un transportētājus, kas iesaistīti to izvadīšanā un detoksikācijā.

Šie fermenti ir iedalīti trīs grupās: I fāzes enzīmi (CYP, ALDH, FMO), kas ievieš polaritāti ksenobiotikā; II fāzes enzīmi (UGT, GST, SULT), kas ievieš hidrofilitāti, konjugējot hidrofilās molekulas, piemēram, sulfātu, glikuronskābi un glutationu ar ksenobiotikām; un III fāzes enzīmi (MDR1, OATP2, MRP), kas transportē II fāzes laikā izveidotās ksenobiotikas vai konjugātus. uz ārpusšūnu zonu.

Šos enzīmus inducē signalizācijas kaskādes, kas ietver specifiskus receptorus (CAR, PXR, AHR) un MAPK mediētu transkripcijas faktoru aktivāciju (NRF2, MAF) (Omiecinski et al. 2011).

Ja nav aktivatoru, konstitutīvi aktīvais receptors (CAR) atrodas citoplazmas asa kompleksā ar CCRP un HSP90. Bet, ja ir aktivators, CAR pārvietojas kodolā un saistās ar RXR, veidojot heterodimēru, un tālāk saistās ar vairākiem atkārtojuma motīva variantiem, piemēram, DR3, DR4, ER6 un ER8, un veicina gēnu ekspresijas regulēšanu (2. papildu tabula).

Mūsu proteomikas analīze atklāja ksenobiotiskā metabolisma aktivāciju. Patiešām, skaidra CYP1A1, CYP3A7, HMOX1 (hēma oksigenāzes 1), CAT (katalāzes) un CES1 (karboksilesterāzes 1) regulēšana parāda I fāzes metabolisma indukciju, vienlaikus palielinot UGT1A1 (UDP glikuronoziltransferāzes saimes 1 loceklis A1) un GSTP1 (GSTP1) ekspresiju. glutationaS-transferāze pi 1) norāda uz fāzes II metabolisma aktivāciju.

Interesanti, ka sulfātu transferāžu, piemēram, SULT1A1 (sulfotransferāžu saimes 1A loceklis 1), SULT1C2 (sulfotransferāžu saimes 1C loceklis 2) un SULT2B1 (sulfotransferāžu saimes 2B loceklis 1), pazemināta regulēšana liecina, ka hidrofilitātes palielināšanās fāzē, vēlams, ar glutakonskābes metabolismu un, vēlams, notiek ar glutakuronskābes metabolismu. , bet ne sulfāta konjugāciju (4. att.).

Transkriptomiskā pētījuma rezultāti ir diezgan konsekventi, jo CYP1A, CYP1B, CYP3A7, GSTO1, GSTP1 un UGT1A1 tiek regulēti RNS līmenī. Tomēr SULT2B1 uzrāda augšupregulāciju RNS līmenī (kamēr tas ir nepietiekami pārstāvēts olbaltumvielu līmenī).

Tas var būt saistīts ar citu mehānismu iesaistīšanos, kas izraisa sulfāta transferāzes enzīmu noārdīšanos vai inaktivāciju pēc apstrādes ar DEPe. Īpaši pārsteidzoši ir tas, ka šīs izmaiņas ksenobiotiskajā metabolismā notika zivju galvās (iespējams, smadzenēs). Ksenobiotisko gēnu ekspresija ir aprakstīta zīdītāju nervu sistēmā, bet šis ir pirmais ziņojums par tiem zebrafish smadzenēs (McMillan un Tyndale 2018).

Šie atklājumi saskan ar līdzīgu pētījumu, ko veica Šankars un kolēģi, kuri pārbaudīja dažādu vides policiklisko aromātisko ogļūdeņražu (PAH) grupu ietekmi uz embriju attīstību un tālāk novērtēja katra ārstēšanas režīma ietekmi uz transkripta profilu.

Visā 48 pēcapaugļošanas (hpf) embriju ķermenī tie parādīja, ka Cyp1a regulēšana gan transkripcijas, gan olbaltumvielu līmenī ir agrīns uzticams ksenobiotiskā AHR aktivācijas un pakārtoto transkriptomisko izmaiņu biomarķieris (Shankar et al. 2019).

NRF{0}}mediētā oksidatīvā stresa reakcija

Oksidatīvais stress var izraisīt apoptozi un nekrozi, un tiek uzskatīts, ka tas ir saistīts ar neirodeģenerāciju (Ahmadinejad et al. 2017; Jami et al. 2014b, 2015). Galvenā šūnu aizsardzības reakcija uz oksidatīvo stresu ir antioksidantu un detoksikācijas enzīmu indukcija.

Ar kodolfaktoru-eritroīdu 2-saistītais faktors 2 (Nrf2) saistās ar promotora antioksidantu atbildes elementiem (ARE) un aktivizē to transkripciju. Neaktīvais Nrf2 ir saistīts ar aktīnu saistošu proteīnuKeap1 un tiek saglabāts citoplazmā.

Oksidatīvā stresa izraisīts Nrf2 tiek fosforilēts, reaģējot uz proteīna kināzes C, fosfatidilinozitola 3- kināzes un MAP kināzes ceļiem. Fosforilētais Nrf2 pēc tam var pārvietoties uz kodolu un saistīt ARE, lai transaktivētu detoksikācijas un antioksidantu enzīmus (3. papildu tabula) (Ma 2013).

For more information:1950477648nn@gmail.com