Uztura kakao flavanoli uzlabo mitohondriju darbību skeleta muskuļos un izmaina visa ķermeņa vielmaiņu veselām pelēm

lai iegūtu vairāk informācijas, sazinieties ar:tina.xiang@wecistanche.com

Abstrakts: Mitohondriju disfunkcija tiek plaši ziņots dažādās slimībās un veicina to patoģenēzi. Mēs novērtējām ietekmikakao flavanolipapildinājums par mitohondriju funkciju un visu metabolismu, un mēs izpētījām, vai mitohondriju dezacetilāze sirtuīns -3 (Sirt3) ir vai nav iesaistīts. Mēs izpētījām 15 dienu CF papildināšanas ietekmi savvaļas tipa un Sirt3-/pelēm. Visa ķermeņa metabolisms tika novērtēts ar netiešo kalorimetriju, un tika veikts perorālais glikozes tolerances tests, lai novērtētu.glikozes metabolisms. Mitohondriju elpošanas funkcija tika novērtēta permeabilizētās šķiedrās, un piridīna nukleotīdu saturs (NAD plus un NADH) tika kvantificēts. Savvaļas tipa gadījumā CF papildināšana būtiski mainīja visa ķermeņa metabolismu, veicinot ogļhidrātu lietošanu un uzlabojot glikozes toleranci. CF papildināšana izraisīja ievērojamu mitohondriju masas pieaugumu, savukārt nozīmīga kvalitatīva adaptācija notika, lai saglabātu H2O2 ražošanu un šūnu oksidatīvo stresu. CF papildināšana izraisīja ievērojamu NAD plus un NADH satura pieaugumu. Visas iepriekš minētās sekas Sirt3-7pelēm tika vājinātas. Kopumā CF papildināšana veicināja NAD metabolismu, kas stimulē sirtuīnu metabolismu un uzlaboja mitohondriju darbību, kas, iespējams, veicināja novēroto visa ķermeņa metabolisma pielāgošanos ar lielāku spēju izmantot ogļhidrātus, vismaz daļēji caur Sirt3.

Atslēgvārdi: kakao flavanoli; NAD metabolisms; mitohondriju masa; glikozes metabolisms; skeleta muskulis

noklikšķiniet, lai iegūtu vairāk informācijas

1. Ievads

Mitohondriji ir subcelulāri organoīdi, kas ir iesaistīti vairākās šūnu funkcijās, piemēram, enerģijas pārvadē, izmantojot mitohondriju oksidatīvo fosforilāciju, un mitohondriju ūdeņraža peroksīda ražošanā vai mitohondriju izraisītā šūnu nāves aktivācijā [1-3]. Jaunie pierādījumi liecina, ka mitohondriju disfunkcija ir saistīta ar daudzām patoloģijām un tai ir galvenā loma to patoģenēzē [4]. Mūsu grupa ziņoja par mitohondriju traucējumiem pacientiem ar 1. tipa cukura diabētu ilgi pirms klīniskām komplikācijām [5]. Turklāt mitohondriju oksidatīvās spējas samazinās līdz ar novecošanu pat veseliem cilvēkiem [6]. Tāpēc šo disfunkciju mazināšanas vai mitohondriju masas palielināšanas stratēģiju noteikšana ir iespējas novērst vai vismaz samazināt daudzu traucējumu biežumu vai palielināt veselu cilvēku aerobo spēju.

Šajā kontekstā ir svarīgi identificēt drošus un dabiskus savienojumus, kas uzlabo mitohondriju funkciju un visa ķermeņa metabolismu ar vai bez ierobežotām blakusparādībām. Starp dabiskajiem savienojumiem,kakao flavanoli(CF) tiek uzskatītas par daudzsološām molekulām, jo ​​tika pierādīts, ka to patēriņš pozitīvi ietekmē sirds un asinsvadu veselību, insulīna rezistenci vai imūno funkciju [7]. Patiešām, tika pierādīts, ka CF uzlabo glikozes metabolismu, un īstermiņa CF ievadīšanai seko paaugstināta jutība pret insulīnu pat pacientiem ar hipertensiju, kas nepanes glikozi [8, 9].

Starp flavanoliem (-)-epikatehīns (EPI) ir visbiežāk sastopamais CF monomērs, un EPI tiek uzskatīts par galveno bioloģiski pieejamo un bioaktīvo CF molekulu [10]. Pastāvīgs pierādījumu kopums liecina, ka EPI papildināšana uzlabo mitohondriju funkciju un/vai saturu skeleta muskuļos [11]. EPI papildināšana stimulē vairākus ceļus, kas saplūst ar peroksisomu proliferatora aktivētu receptoru gamma koaktivatoru 1-alfa(PGCl) un galvenajiem kodola transkripcijas kompleksiem. EPI tieši uzlabo slāpekļa oksīda veidošanos, kas stimulē mitohondriju bioģenēzi [11]. Vienlaikus sirtuīnus 1 un 3 stimulē arī EPI papildinājums [11]. Oligomēru proantocianidīnu izmantošanaflavonoīdiKas satur EPI, tika pierādīts, ka tas palielina intracelulāro nikotīnamīda adenīna dinukleotīdu (NAD plus) līmeni, palielinot vairākus NADbiosintēzes prekursorus un pārregulējot sirtuīna{0}} mRNS līmeni žurku aknās [12]. Sirtuīnu ģimene (Sirt), no NAD atkarīga dezacetilāze, sastāv no septiņiem locekļiem, kas atšķiras ar subcelulāro sadalījumu, substrāta specifiku un šūnu funkcijām [13]. Sirt1, plaši pētīts šīs ģimenes loceklis, stimulē mitohondriju bioģenēzi, veicinot PGCl deacetilēšanu, tādējādi uzlabojot tā transkripcijas aktivitāti [14]. Sirte, galvenais vielmaiņas sensors, tika stimulēta pēc EPI ievadīšanas [12, 15-17]. Tomēr EPI ietekme uz citiem sirtuīniem nav izpētīta. EPI efekta novērtējums būs īpaši interesants sirtuīniem, kas atrodas mitohondrijās (Sirt3, Sirt 4 un Sirt5), kas, kā zināms, modulē Krebsa cikla un elpošanas ķēdes enzīmu aktivitāti [18]. Sirt3, kas ir ļoti izteikts audos ar augstu vielmaiņas apriti un mitohondriju saturu, ir īpaši interesants saistībā ar tā kritisko lomu normālas mitohondriju funkcijas uzturēšanā, izmantojot atgriezenisku proteīna lizīna deacetilāciju [19-21]Turklāt Sirt3 ir svarīga loma visa ķermeņa metabolisma regulēšana [20. Tika pierādīts, ka Sirt3 ir izmainīts 1. un 2. tipa diabēta un sirds un asinsvadu slimību modeļu skeleta muskuļos [22, 23]. Turklāt tika ierosināts, ka Sirt3 aktivizēšana varētu būt daudzsološa terapeitiskā stratēģija mitohondriju funkcijas un metabolisma uzlabošanai [23, 24]. Tāpēc ir svarīgi noteikt, vai Sirt3 ir daļa no CF papildināšanas labvēlīgās ietekmes uz visa ķermeņa metabolismu un mitohondriju funkciju.

Šajā pētījumā mēs izmantojām integrējošu pieeju, lai pelēm izpētītu 15-dienas KF papildinājuma ietekmi. Mēs izvirzījām hipotēzi, ka CF papildinājums: (i) mainīs visa ķermeņa metabolismu unglikozes metabolisms, (ii) palielina mitohondriju funkciju oksidatīvajos un glikolītiskajos muskuļos caurlaidīgās šķiedrās un (ii) pastiprina NAD metabolismu. Mēs arī izpētījām Sirt3 iespējamo iesaistīšanos CF izraisītā mitohondriju bioģenēzē un visa ķermeņa metabolismā. Mūsu hipotēzes bija tādas, ka CF ietekme uz visa ķermeņa vielmaiņu un mitohondriju masu būtu vājāka Sirt{4}}pelēm.

2. Metodes

2.1. Dzīvnieki un diēta

Šim pētījumam 129S1/SvlmJ 10-nedēļas vecas peļu tēviņi tika iegādāti no Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, ASV). Lai noteiktu, vai sirtuīni ir iesaistīti CF ievadīšanas izraisītā mitohondriju masas un funkciju adaptācijā, mēs izmantojām arī 10-nedēļu vecas Sirt3 visa ķermeņa izsitumu tēviņu peles ar tādu pašu celmu kā savvaļas tipa [25]. Sirt3 / peles tika izmantotas, lai izpētītu Sirt3 iesaistīšanos CF izraisītā mitohondriju bioģenēzē un visa ķermeņa metabolisma adaptācijās. Peles tika turētas telpā ar regulētu temperatūru 23-25 grādi un kontrolētu apgaismojumu (12-h gaismas un tumsas cikli). Dzīvniekiem ad libitum bija pieejama grauzēju ēda un krāna ūdens.

Pēc vismaz nedēļu ilgas pieradināšanas dzīvnieku novietnē eksperimentālie dzīvnieki saņēma CF papildinājumu, izmantojot orālo zondi ar dabīgu ekstraktu (302,1 mg/kg ķermeņa svara divas reizes dienā 15 dienas), kas atkārtoti suspendēts karboksimetilcelulozē (Sigma-Aldrich, Sentluisa , Mo, ASV). Kakao pulvera sastāvs ir aprakstīts 1. tabulā, un tas ir iegūts no Naturex (Quart de Poblet, Spānija). Sastāvs noteikts ar augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas metodi, un 100 mg ekstrakta ir līdzvērtīgi vidēji 475 mg sauso kakao sēklu. Kontroles peles saņēma nesēju, kas sastāvēja no līdzīga satura teobromīna un kofeīna, kas izšķīdināts karboksimetilcelulozē ar orālo zondi. Dienas deva tika noteikta saskaņā ar nozares norādījumiem, kas pārvērš cilvēka devu dzīvnieka ekvivalentās devās, pamatojoties uz ķermeņa virsmas laukumu, un mēs reizinājām cilvēka devu ar 12,3 [26]. Mutes zondi veica pieredzējis tehniķis.

2.2. Audu kolekcija 1

Divdesmit četras stundas pēc pēdējās perorālās barošanas dzīvnieki tika anestēzēti, izmantojot ketamīnu un ksilazīnu (attiecīgi: 100 un 10 mg/kg). Audu savākšana tika veikta tūlīt pēc anestēzijas sasniegšanas. Gastrocnemius zole un baltā daļa tika izgriezta. Paraugus vai nu nekavējoties sasaldēja šķidrā slāpeklī un uzglabāja -80 grādos turpmākai analīzei vai izmantoja, lai sagatavotu nodīrātas muskuļu šķiedras.

2.3. Vielmaiņas un fizisko aktivitāšu novērtējumi

Netiešā kalorimetrija un spontānā fiziskā aktivitāte tika mērīta, izmantojot visaptverošo laboratorijas dzīvnieku uzraudzības sistēmu (CLAMS; Columbus Instruments, Columbus, OH, ASV). Peles tika izmitinātas atsevišķi kamerās 28 grādos ar gaismu no 07 h00 līdz 19 h00 un ad libitum piekļuvi grauzēju ēdienam un krāna ūdenim. Peles tika aklimatizētas pie vielmaiņas būriem trīs dienas pirms datu vākšanas pirmās dienas. Datu vākšana tika veikta piecpadsmitajā papildināšanas dienā. Skābekļa patēriņš (VO2), oglekļa dioksīda veidošanās (VCO2) un elpceļu apmaiņas koeficients (RER) tika mērīts ar gaisa plūsmu 0,5 L/min un gaisa paraugu 0,4 L/ min. RER procentuālā relatīvā kumulatīvā frekvence (PCRF) tika noteikta 24- stundu periodā, kā iepriekš aprakstīja Riachi et al. (2004). Īsumā, PCRF tika noteikts, pievienojot katra datu punkta biežumu iepriekšējai pieauguma secībai (no 0, 65 līdz 1, 20 ar pieaugumu 0, 01)[27]. Metabolisko elastību noteica pēc Hila slīpuma (H vērtība) un PRCF līknes 50. procentiles (EC50), kā arī mērot RER amplitūdu 24 stundu laikā (Riachi et al.2004). Vispārējās fiziskās aktivitātes tika uzraudzītas, izmantojot ar infrasarkano staru darbināmu sensoru sistēmu, kas noteica x un z ass aktivitāti. Tika novērtēti gan kopējie skaitījumi (katru reizi, kad tiek pārrauts stars), gan ambulatoro skaits (ikreiz, kad tiek pārrauts jauns stars). X-total (X-TOT) skaits tiek reģistrēts, kad dzīvnieks pārvietojas horizontāli vairāk nekā 0,5 collas un atspoguļo neliela mēroga, atkārtotas darbības, piemēram, skrāpēšanu un kopšanu. X-ambulatorais skaits (X-AMB) mēra faktisko pārvietošanos, reģistrējot skaitu tikai tad, kad dzīvnieks pārtrauc jaunu staru. Z-total (Z-TOT) skaits tiek reģistrēts, kad notiek 1,5 collu vertikāla kustība, ti, audzēšana (Abreu-Vieira 2016). Lai novērtētu ogļhidrātu un tauku saturuoksidēšanāsno VO2 un VCO2 mēs izmantojām bezproteīnu elpošanas koeficienta tabulu no Péronnet un Massicotte, ko iepriekš izmantoja pelēm [28, 29].

2.4. Kopējā ķermeņa un tauku masa

Kopējā tauku masa un kopējā liesā masa tika noteikta neanestezētām pelēm, izmantojot kvantitatīvu rezonanses traucējumu analīzi, izmantojot EchoMRI visa ķermeņa magnētiskās rezonanses analizatoru (Echo Medical System, Hjūstona, Teksasa, ASV). Kopējā tauku masa atspoguļoja visu ķermeņa tauku daudzumu. Kopējā liesā masa galvenokārt ietvēra muskuļus un iekšējos orgānus. Ir zināms, ka skeleta muskuļu masa veido lielāko daļu no kopējās liesās masas.

2.5. Perorālais glikozes tolerances tests (OGTT)

Glikēmija tika mērīta, izmantojot asins pilienu, kas savākts no astes ar glikometru (Accu-Chek Performa, Roche, Argentīna). OGTT tika veikta pelēm, kuras bija tukšā dūšā 5 līdz 6 stundas. Mērījums tika veikts pēdējā CF papildināšanas dienā. Pēc bazālās glikēmijas (laika O) mērīšanas pelēm per os injicēja 20% glikozes šķīdumu sterilā ūdenī devā 1,5 g glikozes · kg ķermeņa svara -1. Glikēmija tika mērīta 15, 30, 60, 90 un 120 minūtes pēc glikozes šķīduma injekcijas. Pēc tam glikozes līknes pieauguma laukums tika aprēķināts kā glikozes tolerances mērs.

2.6.qRT-PCR analīze

The forward (F) and reverse (R) primers of the selected genes used in this study are presented in Table 2. Total RNA was obtained from pulverized frozen white gastrocnemius muscle using Trizol reagent (Invitrogen Life Technologies, Rockville, MD, USA). The purity, integrity, and quantity of RNA were evaluated using a microplate reader (Synergy H1(Biotek Instruments, Winooski, Vermont). The sample was considered pure when the ratio OD260/OD280 was>1.8. cDNS tika sintezēta no kopējās RNS (2 μL), izmantojot iScript reversās transkripcijas supermix RT-qPCR (Biorad, Hercules, CA, ASV). Kopējie RT produkti tika analizēti ar kvantitatīvu polimerāzes ķēdes reakciju (PCR), izmantojot 2x Platinium SYBR Green qPCR SuperMix-UDG saskaņā ar ražotāja specifikācijām (Invitrogen Lige Technologies, Burlington, Kanāda). Riteņbraukšana tika panākta ar CFX96 velosipēdistu (Biorad, Hercules, California; apstākļi: 95 grādi C 10 minūtes un 40 cikli 95 grādi 30 s, 55 grādi 45 s un 72 grādi 45 s). Katras darbības beigās, izmantojot kušanas līkni, tika apstiprināts primer-dimēra veidošanās trūkums un unikāla amplikona klātbūtne. Cikla sliekšņa (Ct) vērtības tika izmantotas pēc 2-A△Ct metodes, lai analizētu qPCR datus, izmantojot ß-Actin vai HPRT1 kā mājturības gēnu【30】. Kvantitatīvās RT-PCR vērtības bija saistītas ar kontroles grupas vērtībām, kas tika iestatītas uz 1.

2.7. Enzīmu aktivitātes

Elektronu transporta ķēdes kompleksu un citrāta sintāzes īpatnējās aktivitātes mērījumi tika veikti spektrofotometriski, kā aprakstīts iepriekš [31]. Pulverizēti saldēti baltie gastrocnemius muskuļi (~30 mg) tika homogenizēti ar vibrējošu mikrolodīšu homogenizatoru 500 ul homogenizācijas buferšķīdumā (120 mM KCl, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA un 5 mg·mL-I BSA , pH 7,4), kam seko 500 μL hipotoniskas barotnes (25 mM kālija fosfāta un 5 mM MgCl, pH 7,2) pievienošana). Pēc tam paraugi tika pakļauti trīs sasaldēšanas-atkausēšanas ciklu kārtām šķidrā slāpeklī. Paraugus centrifugēja 10 minūtes ar ātrumu 600 × g 4 grādos, un supernatants tika turēts uz ledus līdz analīzei. Olbaltumvielu saturs tika noteikts supernatantā trīs eksemplāros, izmantojot Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, ASV).

Citrāta sintāzes (CS) aktivitāte tika noteikta spektrofotometriski pie 412 nm pēc 2 mM 5,5'-ditio-bis(2-nitrobenzoskābes) reducēšanas 0,1 mM acetilskābes klātbūtnē. -CoA un 12 mM oksaloetiķskābes 200 mM Tris buferšķīdumā (pH 7,4). Rotenonu jutīgais NADH-decilubihinona oksidoreduktāzes (I kompleksa) tests tika veikts pie 340 nm, izmantojot akceptoru 2,3-dimetoksi-5-metil-6-n-decil-14-benzohinonu. 80 μM) un NADH kā elektronu donors (200 μM) 10 mM Tris buferšķīdumā (pH 8,0). Lai kvantitatīvi noteiktu rotenonu jutīgo aktivitāti, tika pievienots 4 μM rotenona. Citohroma oksidāzes (komplekss IV) aktivitāte tika veikta pie 550 nm, izmantojot 10 μM reducētu citohromu c kā donoru un 2,5 mM n-dodecil-ß-maltozīda, lai caurlaidītu abas mitohondriju membrānas 100 mM kālija buferā (0pH).

Visi fermentu testi tika noteikti trīs eksemplāros, un rezultāti bija saistīti ar kontroles grupas rezultātiem, kas tika iestatīti uz 100.

2.8. Mitohondriju novērtējums

Mitohondriju elpošana un mitohondriju H2O2 ražošana tika pētīta in situ saponīnu caurlaidīgās šķiedrās, izmantojot baltos gastrocnemius un zoles muskuļus|1]. Īsumā, šķiedras tika atdalītas zem binokulārā mikroskopa šķīdumā A 4 grādu temperatūrā (mM: 2,77 CaK2 EGTA, 7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl2, 20 taurīni, 0,5 DTT,5{ {50}} K-metāna sulfonāti, 20 imidazoli, 5,7 Na2 ATP un 15 kreatīna fosfāts, pH 7,1) un permeabilizēti A šķīdumā ar 50 ug·mL-Iof saponīna 30 minūtes 4 grādu temperatūrā. Mitohondriju elpošanas funkcija tika noteikta oksimetrā, kas aprīkots ar Clark tipa elektrodu (Oxygraph, Hansatech Instruments, Glāzgova). Kamera tika piepildīta ar 1 ml šķīduma B (mM: 2,77 CaK, EGTA, 7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl, 20 taurīns, 0,5 DTT, 50 K-metāna sulfonāti un 20 imidazoli, pH 7,1) un pēc ierakstīšanas. Sākotnējais skābekļa saturs kamerā, kamerā tika ievietots viens saišķis ar 1-2 mg sausā svara permeabilizētu miošķiedru, kas pēc tam tika noslēgts. Pēc sākotnējiem nolasījumiem secīgi tika pievienoti šādi papildinājumi: palmitoilkarnitīns un malāts (160 μM∶5 mM), glutamāts (10 mM), sukcināts (25 mM), rotenons (anti (0,5 μCP μM), unikāls -A (8 uM) un N, N', N'-tetrametil-p-fenilēndiamīna dihidrohlorīds un askorbāts (0,9:9 mM). Elpošana tika mērīta 23 grādos, nepārtraukti maisot. Katra testa beigās šķiedras tika rūpīgi izņemtas no ksilogrāfiskās šūnas, nosusinātas un žāvētas vismaz 24 stundas pie ~ 80 C, lai noteiktu šķiedras svaru. O2 patēriņa rādītāji (JO2) tika izteikti nmol O2 min-1.(mg sausā svara)-I. Visi mērījumi tika veikti vismaz divos eksemplāros.

Neto H2O2 izdalīšanās no elpojošiem mitohondrijiem tika mērīta caurlaidīgos šķiedru saišķos ar fluorescējošu zondi Amplex Red (20 μM∶ ierosme-emisija∶563-587 nm), kā aprakstīts iepriekš [32]. Pēc caurlaidīgo šķiedru, paraugu sagatavošanas

paredzēti H2O2 mērījumiem, tika trīs reizes izskaloti buferšķīdumā Z (mM:110 K-Mes, 35 KCl,1 EGTA,5 K2HPO4, 3MgCl,6H2O un 0.5 mg:mL{ {14}} BSA, pH 7,3 pie 4 grādiem). Šķiedru kūļi ({{20}}.3-1,0 mg sausā svara) tika inkubēti 37 grādos kvarca mikrokivetē ar nepārtrauktu magnētisku maisīšanu 600 ul buferšķīduma Z (pH 7,3 pie 37 °C). papildināts ar 1,2 U·mL-I mārrutku peroksidāzi. Sākotnējie fluorescences rādījumi tika veikti, ja nebija nekādu eksogēnu elpošanas substrātu. Pēc tam secīgi tika pievienoti šādi: glutamāts (5 mM), sukcināts (5 mM), rotenons (0,5 uM), ADP (10 mM) un antimicīns-A (8 μM). Katra testa beigās šķiedras tika uzmanīgi izņem no kivetes, nosusina un žāvē, lai noteiktu šķiedru svaru. H2O2 ražošanas ātrums tika izteikts AU·min-1.(mg sausā svara)-I un uz vienu oksfosa kapacitāti, kas atbilda maksimālajai mitohondriju elpošanai fosforilācijas stāvoklī. Visi mērījumi tika veikti vismaz divos eksemplāros.

Mitohondriju kalcija aiztures spēja (CRC) tika novērtēta balto gastrocnemius muskuļu spoku šķiedrās, kā aprakstīts iepriekš [33]. Īsumā, šķiedras tika inkubētas kvarca mikrokivetē, nepārtraukti maisot 600 μL CRC buferšķīduma (mM∶250 saharozes, 10 MOPS, 0,005 EGTA un 10P;-Tris, pH 7,3). Pēc tam šķiedras tika pakļautas vienam 20 nM Ca2 plus impulsam. Ekstramitohondriju kalcija koncentrācijas izmaiņas tika novērotas fluorometriski, izmantojot kalcija zaļo 5N (1 mM: ierosmes-emisija: 505-535 nm). Caurlaidības pārejas poru jutība (PTP) tika novērtēta, mērot laiku, kas nepieciešams PTP atvēršanai, un CRC tika uzskatīts par kopējo Ca daudzumu, ko mitohondriji uzkrājuši pirms tā atbrīvošanas. Katra testa beigās šķiedras tika rūpīgi izņemtas no kivetes, nosusinātas un žāvētas, lai noteiktu šķiedru svaru. CRC vērtības tika izteiktas nM Ca2 plus uz mg sausnas svara.

2.9. Western Blot analīze

Balto gastrocnemius un zoles muskuļu olbaltumvielas tika atšķaidītas Laemmli buferšķīdumā un atdalītas uz Mini-PROTEAN TGX Stain-Free 10 procentiem saliekamiem poliakrilamīda gēliem (Biorad); katram gēlam tika uzlikts iekšējais standarts. Elektroforētiskā atdalīšana tika veikta pie 200 V sprieguma 35 minūtes migrācijas buferšķīdumā (25 mM TrisBase, 0.2 M glicīns un 1 procents SDS (p/v)). Stain-Free(SF) tehnoloģija satur patentētu tri halo savienojumu, kas reaģē ar proteīniem, padarot tos nosakāmus, iedarbojoties ar UV stariem. SF attēlveidošana tika veikta, izmantojot ChemiDoc MP Imager un Image Lab4.{45}}.1 programmatūru (Biorad, Hercules, Kalifornija, ASV) ar 5-min traipu aktivācijas laiku, un tāpēc tika vizualizēti kopējie proteīnu modeļi. Pēc tam olbaltumvielas tika pārnestas uz 0,2 um nitrocelulozes loksnes, izmantojot Trans-Blot Turbo Transfer System (Biorad). Pārsūtīšanas kvalitāti kontrolēja attēlveidošanas membrānas, izmantojot SF tehnoloģiju. Pēc pārvietošanas posma karbonilolbaltumvielas tika atvasinātas ar dinitrofenilhidrazīnu, atšķaidot 2N HCL, un beidzot tika plaši mazgātas ar metanolu. Membrānas tika bloķētas ar 5% beztauku sausu pienu Tris buferšķīdumā, kas satur Tween-20 (TBST: 15 mM Tris/HCl, pH 7,6, 140 mM NaCl un 0,05% Tween{28}}). 1 h istabas temperatūrā. Pēc tam membrānas inkubēja 4 grādu temperatūrā nakti vai 2 stundas istabas temperatūrā ar šādām primārajām antivielām: proteīna karbonila primāro antivielu (Anti-DNP; #STA-308, Cell Biolabs) un SOD2 (#Ab13533, Abcam). Pēc trīs 10 minūšu mazgāšanas TBST, membrānas tika pārbaudītas ar sekundārajām antivielām pret proteīna karbonilgrupu (HRP-konjugāts; #STA-308, Cell Biolabs) un SOD2 (saistīts ar anti-trušu IgG-HRP; #7074, šūnu signalizācija). bloķējošā šķīdumā 2 stundas istabas temperatūrā un beidzot tika plaši mazgāti ar TBST. Primāro un sekundāro antivielu atšķaidīšana tika optimizēta katrai antivielai. Ķīmiluminiscences noteikšana tika veikta, izmantojot ECL Clarity (Biorad), un attēlu uzņemšana tika veikta ar ChemiDocMP. Visi attēli tika analizēti, izmantojot Image Lab 4.0.1 programmatūru. Olbaltumvielu signālu intensitātes normalizēšana tika veikta pēc attiecīgo kopējo olbaltumvielu līmeņu kvantitatīvas noteikšanas SF attēlos, paraugu kontrolē un iekšējos standartos.

2.10. NAD mērīšana

Kopējais NAD un NADH līmenis tika mērīts homogenizētā baltajā gastrocnemius, izmantojot komerciālu komplektu (#K337-100, Biovision, ASV) un ievērojot ražotāja norādījumus. Īsumā, tika iegūts kopējais NAD kopums (NADt= NADt un NADH). Katram ekstrahētajam paraugam puse parauga tika uzkarsēta līdz 60 grādiem 30 minūtes, lai sadalītos NADt, vienlaikus saglabājot NADH neskartu. Gan NADt, gan NADH paraugi tika sajaukti ar NAD cikla fermentu, un absorbcija tika mērīta pie 450 nm. NADt un NADH kvantitatīvi noteica, salīdzinot ar NADH standarta līkni un normalizējot līdz mg proteīna. Visbeidzot, tika aprēķināta NAD plus (NADt-NADH) attiecība pret NADH. Visas pārbaudes tika veiktas trīs eksemplāros.

2.11. Statistika

Dati tiek ziņoti kā vidējā ± standarta novirze (SD). Datu normalitāte tika novērtēta, izmantojot D'Agostino-Pearson normalitātes testu. Datu analīze tika veikta, izmantojot Studenta t-testu un divvirzienu ANOVA (grupa un laiks) atkārtotiem mērījumiem, kam sekoja Bonferroni post hoc tests, izmantojot Prism8.4.1 (GraphPad Software, Sandjego, CA, ASV). I tipa kļūdai tika piemērots divpusējs 5 procentu līmenis.

3. Rezultāti

3.1. Ķermeņa sastāvs un visa ķermeņa vielmaiņa

Piecpadsmit dienas pēc CF papildināšanas savvaļas tipa (WT) pelēm nemainīja ķermeņa svaru (p=0.091), liesās masas (p=0).{24} }73) un tauku masa, kas noteikta ar EchoMRI (p=0.89; 1.A attēls). O2 patēriņa rādītāji, kas izteikti uz liesu masu, bija ievērojami augstāki tumšajā ciklā (8±8 procenti , p=0.042), savukārt gaismas ciklā tas palika līdzīgs (p =0 .392; 1.B attēls). Lokomotorās aktivitātes izmaiņu nebija (dati nav parādīti). CF pelēm bija ievērojams visa ķermeņa enerģijas patēriņa pieaugums par 15±15 procentiem (p =0.042; 1. C attēls) un pārtikas patēriņš (0,08±0,01 pret 0,11±0,01 g uz liesās ķermeņa masas, attiecīgi CF grupa un WT, p=0.013, 1.D attēls).

KF papildināšana būtiski mainīja visa ķermeņa metabolismu: galvenā augstāka RER ietekme CF grupā tika novērota 24 stundu laikā (p=0.023, 2.A attēls), un vidējais RER 12 stundu laikā bija augstāks. CF grupā gaismas un tumsas ciklos (plus 5±3 procenti ,p=0.0attiecīgi 35 un plus 9±4 procenti, p=0.026). Turklāt CF papildināšana veicināja ogļhidrātu (CHO) lietošanu (51±13 procenti enerģijas patēriņa bija atkarīgi no CHO oksidācijas CF grupā pret 37 ±12 procentiem kontroles grupā gaismas cikla laikā, p=0.108 un 71±21 procents CF grupā pret 47±24 procentiem kontroles grupā tumšā cikla laikā, p=0.004; 2.B attēls). Tomēr, izsakot kJ, nebija atšķirību ne CHO oksidācijā, ne taukskābju oksidācijā (CHO oksidācija: 3,7±1,4 kcal·d-1 kontroles grupā pret 4,4±1,7 kcal.liesā ķermeņa masa-1. d-1 CF,p=0.33 un taukskābju oksidācija: 2,3±1,0 kcal·d-Iin kontrole pret 2,6±0,87 kcal.liesā ķermeņa masa-1.d{{ 50}}CF,p=0.608). RER PRCF analīze atklāja EC50 vērtību pieaugumu CF grupā (p=0,009; 2.D attēls), kas nozīmē, ka CF izraisa nobīdi. uz lielāku ogļhidrātu lietošanu. Hila slīpuma samazināšanās tika novērota CF grupā (H vērtības: 25,16±4,44 kontroles grupā pret 12,79±3,96 CF grupā, p<0.001). moreover,="" the="" rer="" amplitude="" over="" 24h="" was="" increased="" by="" 31±="" 31%="" in="" the="" cf="" group="" (p="0.035)." cf="" supplementation="" improved="" glucose="" tolerance="" following="" oral="" glucose="" administration="" from="" unchanged="" baseline="" blood="" glucose="" levels="" after="" an="" overnight="" fast="" (figure="" 2e,p="0.003)." the="" area="" under="" the="" capillary="" blood="" glucose="" curve="" was="" lower="" in="" the="" cf="" group(1018±135="" vs.="" 1181±="" 170="" mm·120="" min,="" p="0.005;" figure="">

3.2. Mitohondriju bioenerģētika

Mēs pārbaudījām CF papildināšanas ietekmi uz mitohondriju enerģētiku baltajā gastrocnemius un zoles muskuļos WT pelēm. Tika novērota augstāka mitohondriju elpošana, izmantojot kompleksos IV substrātus baltajā gastrocnemius un zoles muskuļos (attiecīgi p=0.004 un p=0.028; 3.A, B attēls). CII/CI un CIV/CI elpošanas attiecību izmaiņas netika novērotas (p =0.899 un p =0.701 baltajam gastrocnemiusam un p=0.693 un p{{). 11}}.912 zoles muskuļiem, dati nav parādīti). Turklāt baltajā gastrocnemius muskulī ievērojami palielinājās kompleksās, I, IV un citrāta sintāzes aktivitātes (attiecīgi: plus 31 ± 27 procenti ,p=0.004; plus 28 ± 38 procenti ,p=0 .027; plus 35±38 procenti ,p= 0.009; plus 14±13 procenti ,p=0.040; 3.C attēls. Mitohondriju spējai oksidēt palmitoilkarnitīnu ir tendence palielināties baltais gastrocnemius (plus 24±12 procenti ,p =0.096; 3D attēls), turpretim zolē atšķirība netika novērota (p =0.363). Palmitoilkarnitīna stimulētās elpošanas relatīvais ātrums nemainījās, izsakot I kompleksa elpošanas funkciju (62±11 kontroles grupā pret 64±20 CF grupā balto gastrocnemius un 70±18 pret 72±16). zolē). Pēc tam mēs izpētījām jutību pret Ca plus izraisītu PTP atvēršanu baltajā gastrocnemius. Kā parādīts 3. E attēlā, ne laiks līdz PTP atvēršanai, ne Ca² aiztures spēja netika mainīta pēc CF papildināšanas (attiecīgi p=0.608 un p=0.943).

Mitohondriju bioģenēzē iesaistīto gēnu mRNS novērtējums uzrādīja NRF1 mRNS augšupregulāciju par 70 procentiem, savukārt PGCl , Tfam, CS, ND1, ND2, SDHa un Cox2 atšķirības netika ziņots (3. tabula). Dažos paraugos mēs izpētījām CF papildināšanas ietekmi uz mitohondriju superkompleksiem (S1 attēls, Papildu materiāli). Densitometriskā analīze liecina, ka CF papildināšana palielināja kopējo superkompleksu saturu bez kvalitatīvas adaptācijas vai pārkārtojumiem. Patiešām, elpošanas blīvums tika uzlabots par 58 procentiem, izmantojot kompleksās I un kompleksāsⅡ zondes, un par 93 procentiem, izmantojot komplekso I zondi. Līdzīgi, kompleksa I un kompleksa III saturs, kas iegults superkompleksos, bija augstāks CF grupā.

CF papildinājums samazina mitohondriju ROS emisiju. Kamēr H2O2 emisija nemainījās gan baltajā gastrocnemius, gan soleus, ja to izsaka uz sausnas masas (attiecīgi 4A un B attēls), rādītāji tika samazināti, izsakot uz mitohondriju saturu (4.C attēls). Galvenā CF papildināšanas pozitīvā ietekme tika novērota dažādos apstākļos baltajā gastrocnemiusā (6. lpp.).<0.048; figure="" 4c).="" the="" mitochondrial="" h2o2="" emission="" was="" also="" significantly="" reduced="" when="" expressed="" peroxidative="" phosphorylation="" capacity="" assessed="" by="" state="" 4="" respiration="" using="" complex="" i+ii="" substrates="" by="" 26±13%="" in="" the="" white="" gastrocnemius="" (p="0.044)and" by="" 29±12%="" in="" the="" soleus(p="0.024;" figure="">

3.3. Oksidatīvā stresa marķieri skeleta muskuļos

Šūnu proteīna oksidatīvā stresa līmeni WT pelēm neietekmēja CF papildinājums, jo SOD2 šūnu saturs bija līdzīgs eksperimentālajās un kontroles grupās baltajā gastrocnemius un soleus (attēls 4E). Turklāt netika novērotas atšķirības olbaltumvielu karbonilācijā baltajā gastrocnemius un soleus (attēls 4F). Turklāt pēc CF papildināšanas netika novērotas atšķirības katalāzes un MnSod mRNS ekspresijā (3. tabula).

3.4.NAD Metabolisms

Kopējais piridīna nukleotīdu kopums pēc CF papildināšanas palielinājās par 36±33 procentiem (p=0.012). Konkrēti, NAD un NADH saturs palielinājās baltajā gastrocnemius (attiecīgi par 69±60 procentiem, p{{6). }}.026 un 29± 42 procenti ,p=0.017;Attēls 5A,B)un NAD plus/NADH attiecībai bija tendence palielināties CF grupā (p =0.084).Nē. nozīmīga ietekme tika novērota Sirt3 mRNS (p=0.096), NMNAT mRNS (p=0.094) un Sirt1 mRNS (p =0.869); 3. tabula. ).

3.5. Visa ķermeņa un šūnu vielmaiņas reakcija pēc CF papildināšanas Sirt3-/pelēm

Mēs pārbaudījām CF papildināšanas ietekmi uz Sirt{{0}}pelēm. Ķermeņa sastāvs kā svars, liesā masa un tauku masa neatšķīrās starp CF un kontroles grupām (attiecīgi p= 0,52, p=0,66, p=0,45; 6.A attēls. Tāpat ikdienas enerģijas patēriņu neietekmēja KF papildināšana ({{10}},38±0.{{40}}1 Kcal.liess ķermenis). masa-1.diena-1 kontroles grupās pret 0,39 ± 0,01 Kcal·liesā ķermeņa masa-1.diena-1 CF, p=0.502; 6.B attēls). RER bija līdzīgs abām grupām gaišajā un tumšajā ciklā (p=0.301; 6.C attēls), un substrāta oksidāciju neietekmēja CF papildināšana (44 ± 17 procenti enerģijas patēriņa bija atkarīgi no CHO oksidācijas kontroles grupā pret 50 ± 11 procentiem CF grupā gaišajā fāzē, p=0.209 un 65±19 procentiem kontroles grupā pret 77±21 procentu CF grupā tumšās fāzes laikā, p=0.395; 6. D attēls). Metabolisma elastība, kas novērtēta pēc RER amplitūdas 24 stundu laikā, abās grupās saglabājās līdzīga (0,19±0,05 kontroles grupā pret 0,20±0,03 CF,p{48}}.604), bet PRCF slīpums bija samazināts CF grupā. (H vērtības: 17,77±4,38 kontroles grupā pret 12,79±3,93 CF, p=0,039).

Tālāk mēs salīdzinājām CF papildināšanas ietekmi uz mitohondriju enzīmu aktivitātēm. CF papildināšana nepalielināja I, I, IV un CS kompleksa enzīmu aktivitāti Sirt3-/pelēm, kā tas tika novērots iepriekš WT (attiecīgi: p=0.623,p=0 0,629,p=0.283 un p=0.791, 6E. attēls. Lielāka kompleksa un IV enzīmu aktivitāte tika novērota WT, salīdzinot ar Sirt3-7pelēm pēc CF papildināšanas ( attiecīgi: p=0.027 un P=0.045)

4. Diskusija

Šajā pētījumā mēs sniedzam integratīvu analīzi par CF uzņemšanas ietekmi. Mēs novērojām, ka hroniska CF uzņemšana uzlaboja mitohondriju elpošanu un samazināja H2O2 veidošanos, vērtējot to miošķiedru vidē, bet PTP atvēršanās jutība nemainījās. CF uzņemšana uzlaboja NAD vielmaiņu, atbalstot sirtuīna ceļu iesaistīšanos novērotajās mitohondriju adaptācijās. Mēs arī novērojām visa ķermeņa metabolisma izmaiņas, lai palielinātu spēju izmantot ogļhidrātus kā galveno substrātu, kas liecina, ka mitohondriju adaptācijas, iespējams, veicināja novēroto visa ķermeņa metabolisma adaptāciju.

4.1.Vielmaiņa

Kakao flavanolu lietošana ar uzturu ir atzīta par efektīvu stratēģiju glikozes nepanesības mazināšanai, kas dod iespējas uzlabot vielmaiņas slimības [34]. Mūsu rezultāti ir saskaņā ar iepriekšējiem pētījumiem, kas ziņoja par paaugstinātu glikozes toleranci pēc flavanolu uzņemšanas [35, 36]. Šim efektam ierosinātie mehānismi ietver GLUT4 translokācijas palielināšanos uz šūnu membrānu, AMPK fosforilēšanās palielināšanos un UCP-2 gēna ekspresijas regulēšanu skeleta muskuļos [8,37] . Turklāt CF uzņemšana bija saistīta ar insulīna jutības uzlabošanos cilvēkiem[8]. Pēc 15 tumšās šokolādes lietošanas dienām veseliem indivīdiem tika novērota insulīna rezistences indeksa homeostāzes modeļa novērtējuma samazināšanās, vienlaikus palielinoties kvantitatīvā insulīna jutības pārbaudes indeksam un insulīna jutības indeksam [8]. Mēs arī novērojām vienlaicīgu glikozes tolerances un vielmaiņas elastības palielināšanos WT pelēm, kas attiecas uz organisma spēju pielāgot degvielas oksidāciju degvielas pieejamībai [38]. Interesanti, ka, lai gan traucēta mitohondriju oksidatīvā spēja un ar to saistītā substrāta oksidēšanās bija saistīta ar insulīna rezistenci 39, izturības vingrinājumi palielināja mitohondriju saturu, jutību pret insulīnu un vielmaiņas elastību [38]. Tāpēc pašreizējie rezultāti ir raksturīgi CF papildināšanai, un tos neietekmē spontāna darbība.

CF pozitīvā ietekme uz vielmaiņas elastību, kā arī mitohondriju kompleksu aktivitātes palielināšanās Sirt{0}}pelēm tika vājināta, norādot, ka CF pozitīvā ietekme vismaz daļēji izpaužas caur Sirt3. Šie rezultāti apstiprina iepriekšējos atklājumus un Sirt3 galveno lomu vielmaiņas elastības regulēšanā [24]. Mūsu rezultāti liecina, ka mitohondriju funkcijas palielināšanās var uzlabot vielmaiņas elastību. Tomēr papildus mitohondriju funkcijai kā metabolisma elastības noteicošie faktori tika identificēti arī pamata elpošanas koeficients, glikozes izvadīšanas ātrums, taukaudu lipīdu uzglabāšanas spēja un brīvo taukskābju koncentrācija plazmā, un tie ir jāņem vērā [40]. Turpmākajos pētījumos būtu dziļāk jānovērtē vielmaiņas elastības šūnu noteicošie faktori, lai padziļinātu mūsu izpratni par metabolisma elastības uzlabošanās cēloņiem pēc CF papildināšanas.

Visa ķermeņa metabolisma novērtējums atklāja relatīvās CHO oksidācijas palielināšanos pēc CF papildināšanas. Šis rezultāts ir pretstatā iepriekšējam pētījumam, kurā ziņots par lipolīzes palielināšanos pēc akūtas flavanolu uzņemšanas vai divu nedēļu ilgas papildināšanas ar flavan{2}oliem pelēm [36]. Papildus ekstrakta sastāva atšķirībām šos pretrunīgos atklājumus var izraisīt NO pleiotropā iedarbība. Ir vispāratzīts, ka CF uzņemšana stimulē NO metabolisma veidošanos vai biopieejamību [7]. No vienas puses, NO stimulē glikozes transportēšanu un uzņemšanu skeleta muskuļos. NO ražošanas stimulēšana šūnu līnijas atvasinātos miotubos ar insulīnu vai ūdeņraža peroksīdu izraisīja GLUT4 translokācijas palielināšanos, kas tika samazināta ar nNOS inhibīciju [41]. Turklāt NO var palielināt glikozes transportēšanu no insulīna neatkarīgā ceļā, izraisot cikliskā GMP un AMPK līmeņa paaugstināšanos [42], kas veicina glikozes oksidāciju žurku skeleta muskuļos neatkarīgi no taukskābju pieejamības un oksidācijas [43]. No otras puses, NO veicina taukskābju oksidāciju, samazinot malonil-CoA līmeni, inhibējot acetil-CoA karboksilāzi un aktivizējot malonil-CoA dekarboksilāzi skeleta muskuļos[44]. Lai gan mēs novērojām pāreju uz zemāku relatīvo proporciju, lai izmantotu taukskābes kā substrātu ar CF, nebija atšķirības attiecībā uz absolūtajām vērtībām, kas izteiktas kJ. Tas liecina, ka enerģijas patēriņa pieaugums, kas novērots ar CF papildināšanu, ir atkarīgs no glikozes oksidācijas palielināšanās. Tāpēc šie rezultāti apstiprina domu, ka CF patēriņš palielina jutību pret insulīnu un veicina glikozes oksidāciju, vienlaikus neietekmējot taukskābju oksidācijas spēju. Šie rezultāti liek uzdot jautājumu par kakao flavanolu izmantošanas nozīmi augsta tauku satura diētas kontekstā. Turpmākajos pētījumos jānovērtē iespējamā kaitīgā ietekme, ko rada CF papildināšanas un augsta tauku satura diēta.

4.2.Mitohondriju funkcija

Ir pierādīts, ka kakao flavanolu lietošana uzturā uzlabo mitohondriju darbību, tostarp (i) mitohondriju elpošanu un elektronu transportēšanas ķēdes enzīmu aktivitātes; (i) mitohondriju H2O2 izdalīšanos, kas atspoguļo mitohondriju reaktīvo skābekļa sugu (ROS) veidošanos; un (i) mitohondriju kalcija aiztures spēja, kas atspoguļo uzņēmību pret mitohondriju caurlaidības pārejas poru (mPTP) atvēršanu (pārskatu skatiet [11]). Mūsu rezultāti atbilst iepriekšējiem pētījumiem; tomēr mūsu pētījums bija pirmais, kas novērtēja CF papildināšana par mitohondriju funkciju, kas novērtēta in situ caurlaidīgās šķiedrās un dažādos muskuļu tipos. Atšķirībā no iepriekšējiem pētījumiem par izolētiem mitohondrijiem, mitohondriju funkcijas novērtējums caurlaidīgās šķiedrās saglabā mitohondriju morfoloģiju, funkcionālo mijiedarbību ar citiem intracelulāriem komponentiem [1] un novērš mitohondriju struktūru traucējumi mitohondriju izolācijas procesa laikā [32].Tāpēc ir svarīgi pētīt mitohondriju funkciju audu preparātos, kuros ir saglabāta mitohondriju struktūra un ir pārstāvēts viss mitohondriju kopums, lai labāk novērtētu atbildes reakciju uz ārstēšanu.

Iepriekšējie pētījumi, kas veikti šūnu kultūrā vai in vivo ar pelēm, ir parādījuši, ka EPI papildināšana, kas tiek uzskatīta par galveno CF bioaktīvo molekulu, palielina maksimālo ADP stimulēto elpošanu (piemēram, 3. stāvokļa elpošanu), kad mitohondriji tiek baroti ar enerģijas kombināciju. substrāti, kas baro dažādas vietas gar elpošanas ķēdi [45-49]. Saskaņā ar šiem rezultātiem mēs novērojām galveno CF papildināšanas ietekmi uz mitohondriju elpošanu oksidatīvajos un glikolītiskos muskuļos. Lai noteiktu, vai šis pieaugums ir saistīts ar mitohondriju masas pieaugumu vai mitohondriju elpošanas kompleksu pārveidošanu, mēs novērtējām mitohondriju superkompleksus no četrgalvu muskuļa. Tiek uzskatīts, ka šīs supramolekulārās struktūras samazina ROS veidošanos, stabilizē vai palīdz izveidot atsevišķus kompleksus, regulē elpošanas ķēdes aktivitāti un novērš proteīnu agregāciju olbaltumvielām bagātajā iekšējā mitohondriju membrānā [50-52]. Neskatoties uz ierobežotu skaitu pasākumu, rezultātu vizuālā analīze (papildu materiāli) liecina, ka CF papildināšana izraisa mitohondriju masas palielināšanos, ko atspoguļo visu superkomplekso sugu pieaugums, nevis specifiskas elpošanas ķēdes kompleksu reorganizācijas. Kopumā šie rezultāti liecina, ka CF veicina mitohondriju masas pieaugumu bez elpošanas ķēdes kompleksu izkārtojumu kvalitatīvas pielāgošanas.

Mitohondriju elpošanas laikā veidojas mainīgs daudzums superoksīda, un to var metabolizēt, veidojot cita veida ROS [53]. Lai gan pārmērīga ROS ražošana no mitohondrijiem ir saistīta ar plašu patoloģiju spektru, zemām ROS fizioloģiskajām koncentrācijām var būt labvēlīga ietekme, piemēram, aizsardzība pret infekcijas izraisītājiem un dalība šūnu signalizācijā [2,54]. Iepriekšējie pētījumi, kas veikti in vivo ar grauzējiem un cilvēkiem, un šūnu kultūras modeļi ziņoja par labvēlīgu CF papildināšanas ietekmi uz ROS ražošanu un dažādām antioksidantu sistēmām [11]. Piemēram, orālā zonde ar EPI 15 dienu laikā palielina SOD2 un katalāzes aktivitāti peļu četrgalvu muskuļos [17]. Lai gan mitohondriju ROS ražošana nav plaši novērtēta, mēs novērojām, ka ROS ražošanas līmeņi bija līdzīgi, ja vērtības tika izteiktas uz muskuļu svaru, turpretim produkcija tika samazināta, ja to izsaka uz mitohondriju masu, kas liecina, ka notiek kvalitatīvi pielāgojumi, lai saglabātu ROS fizioloģiskās koncentrācijas. Turklāt mēs nenovērojām nekādu CF ietekmi uz SOD2 vai ROS izraisītiem bojājumiem, kas novērtēti ar olbaltumvielu karbonilēšanu. Lai gan CF uzlabo antioksidantu proteīnu kopumus, tostarp plaši ziņots par SOD2 un katalāzes līmeni [16, 17, 55], šī adaptācija ne vienmēr bija saistīta ar ROS izraisītu bojājumu samazināšanos [56-59]. Šie dati apstiprina teoriju, ka normālai šūnu homeostāzei ir nepieciešams zems ROS ražošanas līmenis [2]. Kopumā šie rezultāti liecina, ka vienlaikus ar mitohondriju masas palielināšanos CF veicina kvalitatīvu mitohondriju adaptāciju, lai uzlabotu tās antioksidantu spēju un uzturētu zemu ROS ražošanas līmeni.

4.3.Mitohondriju bioģenēze

Mitohondriju masa ir mitohondriju bioģenēzes un mitofagijas mijiedarbības rezultāts. Mūsu pētījums koncentrējās uz mitohondriju bioģenēzi, ko aktivizē polifenolu patēriņš [60]. Mitohondriju bioģenēze ir šūnu process, kas uzlabo mitohondriju masu. Šis sarežģītais un ļoti regulētais process ietver vairākus transkripcijas faktorus, kodolhormonu receptorus un transkripcijas koaktivatorus, kas darbojas kolektīvi, lai koordinētu izmaiņas kodola un mitohondriju DNS kodēto gēnu ekspresijā [61]. Iepriekšējie pētījumi ir mēģinājuši noteikt, kurš(-i) ceļš(-i) var būt CF papildināšanas izraisītas mitohondriju bioģenēzes pamatā. NO atkarīgās signalizācijas stimulēšana ir kļuvusi par centrālo ceļu, kas iesaistīts mitohondriju bioģenēzē. CF papildināšana uzlabo NO veidošanos, inhibējot arginīnu noārdošo enzīmu argināzi, kas palielina L-arginīna pieejamību NO biosintēzei [62,63]. Turklāt, izmantojot eNOS inhibitoru, epikatehīna stimulējošā iedarbība uz mitohondriju bioģenēzi tika daļēji vājināta [17]. Šie rezultāti liecina par citu signalizācijas ceļu iesaistīšanos, lai stimulētu mitohondriju bioģenēzi.

Nesen Aragones et al. (2016) ziņoja, ka uztura proantocianidīni, polifenolu ģimenes locekļi, pastiprina aknu NAD plus metabolismu, uzlabojot de now o NAD plus biosintēzes ceļu un Sirtas aktivitāti atkarībā no devas žurkām[12]. Turklāt aknas eksportē NADt prekursorus uz citiem orgāniem, piemēram, skeleta muskuļiem, kuriem ir mazāka spēja sintezēt NAD, tādējādi palielinot iespēju paplašināt aknās novēroto ietekmi uz visu organismu [64]. Lai gan daži pētījumi ziņoja par CF papildināšanas ietekmi uz Sirt1 proteīna saturu, aktivitāti vai mRNS [12, 15-17, 65, 66], NAD metabolisma iesaistīšanās mitohondriju bioģenēzē pēc CF papildināšanas, izmantojot zudumu vai pieaugumu. funkcija nekad nav pārbaudīta. Lai gan muskuļos specifisks izsitums būtu bijis vēlams, salīdzinot ar mūsu pētījumā izmantotajām Sirt3 KO pelēm ar visu ķermeni, mūsu rezultāti liecina, ka CF uzlabo NAD metabolismu, un Sirt3 ir iesaistīts šajā papildināšanas izraisītajā mitohondriju elektronu transportēšanas ķēdes aktivitātes uzlabošanā. Pozitīvā ietekme uz mitohondriju kompleksu aktivitāti pēc CF papildināšanas netika novērota, izmantojot Sirt3-7peles, un lielāka kompleksa I un IV aktivitāšu aktivitāte tika novērota pēc CF papildināšanas tikai WT gadījumā. Šie novērojumi paplašina iepriekšējos darbus, parādot, ka Sirt3 ir galvenā loma mitohondriju funkcijā ]67. Kopumā šie atklājumi liecina, ka sirtuīni, modulējot NAD metabolismu, ir iesaistīti mitohondriju masas uzlabošanā, kas novērota pēc CF papildināšanas. 4.4.Ierobežojumi

Kakao pupiņas sastāv no monomēru, oligomēru un polimēru flavanolu maisījuma. Starp flavanoliem EPI, šķiet, ir visizplatītākais polifenola monomērs, kas atrodams kakao produktos, veidojot līdz 35 procentiem no polifenolu satura [68]. EPI tika noteikta kā galvenā bioaktīvā molekula, kas ir pamatā ieguvumiem, kas saistīti ar kakao un šokolādes papildināšanu [47, 69]. Tomēr EPI metabolīti (EPIm) var būt iesaistīti EPI izraisītajos bioloģiskajos efektos, kas novēroti in vivo pētījumos. EPIm var sasniegt augstāku koncentrāciju plazmā nekā EPI[70]. Turklāt starp sugām tika novērotas būtiskas EPIm atšķirības. Patiešām, 80 procenti no EPIm, kas atrodas cilvēkiem, žurkām netika atklāti, savukārt līdzība starp pelēm un cilvēkiem tika konstatēta nedaudz labvēlīgāka, jo tika atklāti divi galvenie cilvēka metabolīti [70]. Mēs izmantojām bagātinātu CF ekstraktu, kas satur līdz pat piecām reizēm vairāk EPI nekā neraudzētās kakao pupiņas[71]. Turklāt EPI saturs tika samazināts par 10-20 procentiem fermentācijas rezultātā un samazinājās atkarībā no temperatūras grauzdēšanas laikā [71,72]. Kopumā šie dati liecina, ka, novērtējot EPI papildināšanas priekšrocības cilvēku veselībai, uzmanība jāpievērš tikai EPI saturam, un pašreizējie rezultāti ir jāapsver piesardzīgi, pirms tiek ekstrapolēti novērotie pamatā esošie mehānismi cilvēkiem.

5. Secinājumi

Ikdienas CF papildināšana 15 dienas noved pie mitohondriju funkcijas uzlabošanās oksidatīvajos un glikolītiskajos muskuļos. Šie rezultāti liecina, ka palielināta mitohondriju elpošana izraisa mitohondriju masas palielināšanos, vienlaikus saglabājot ROS ražošanas līmeni šūnās, kas liecina par kvalitatīvām adaptācijām mitohondrijās. Vienlaikus ar iepriekš aprakstīto šūnu ietekmi uz NO metabolismu [73], CF modulē NAD metabolismu, kas stimulē sirtuīnu aktivitāti. Sirt3 ir galvenā loma mitohondriju adaptācijā un vielmaiņas elastībā pēc CF papildināšanas. Tā kā sirtuīni ir nesenie mērķi dažādu slimību patoģenēzē, piemēram, diabēts vai astma [74,75 l, turpmākajos pētījumos tiks pētīta iespējamā interese izmantot CF kā dabisku sirtuīnu aktivatoru.

Atsauces

1. Kuzņecovs, AV; Vekslers, V.; Gelerihs, FN; Saks, V.; Margreiters, R.; Kunz, WS Mitohondriju funkcijas in situ analīze permeabilizētās muskuļu šķiedrās, audos un šūnās. Nat. Protok. 2008, 3, 965–976. [CrossRef]

2. Sena, LA; Chandel, NS Mitohondriju reaktīvo skābekļa sugu fizioloģiskās lomas. Mol. Šūna 2012, 48, 158–167. [CrossRef]

3. Vakjē, B.; Combettes, L.; Van Nhieu, GT; Dupont, G. Mijiedarbība starp intracelulāro Ca2 plus svārstībām un Ca2 plus stimulētu mitohondriju metabolismu. Sci. Rep. 2016, 6, srep19316. [CrossRef]

4. Suomalainens-Vartiovaara, A.; Battersby, BJ Mitohondriju slimības: organellu stresa reakciju ietekme uz patoloģiju. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2018, 19, 77–92. [CrossRef]

5. Heimans, E.; Daussin, F.; Wieczorek, V.; Kajaco, R.; Matrans, R.; Bertons, P.; Aucouturier, J.; Bertoins, S.; Descatoire, A.; LeKlērs, E.; un citi. Muskuļu skābekļa piegāde un lietošana 1. tipa diabēta gadījumā, no apkārtējā gaisa līdz mitohondriju elpošanas ķēdei: vai ir kāds ierobežojošs solis? Diabēta aprūpe 2020, 43, 209–218. [CrossRef]

6. Daussin, FN; Bulanžs, E.; Lancel, S. No mitohondrijiem līdz sarkopēnijai: iekaisuma un RAGE ligandu ass ietekmes loma. Exp. Gerontols. 2021, 146, 111247. [CrossRef] [PubMed]

7. Katz, DL; Doughty, K.; Ali, A. Kakao un šokolāde cilvēku veselībā un slimībās. Antioksīds. Redoksa signāls. 2011, 15, 2779–2811. [CrossRef] 8. Grasi, D.; Lipi, C.; Nekozione, S.; Desideri, G.; Ferri, C. Pēc īslaicīgas tumšās šokolādes ievadīšanas veseliem cilvēkiem ievērojami palielinās jutība pret insulīnu un pazeminās asinsspiediens. Am. Dž.Klins. Nutr. 2005, 81, 611–614. [CrossRef] [PubMed]

9. Grasi, D.; Desideri, G.; Nekozione, S.; Lipi, C.; Casale, R.; Properzi, G.; Blumbergs, JB; Ferri, C. Pacientiem, kuri nepanes glikozi un hipertensiju, samazinās asinsspiediens un palielinās jutība pret insulīnu pēc 15 dienu ilgas tumšās šokolādes ar augstu polifenola satura patēriņa. J. Nutr. 2008, 138, 1671–1676. [CrossRef]

10. Ottaviani, JI; Mamma, TY; Heiss, C.; Kvik-Uribe, C.; Šroters, H.; Keen, CL Flavanolu stereoķīmiskā konfigurācija ietekmē flavanolu līmeni un metabolismu cilvēkiem un to bioloģisko aktivitāti in vivo. Brīvais radiks. Biol. Med. 2011, 50, 237–244. [CrossRef] [PubMed]