Cilvēka treg un efektoru T šūnu diferenciāla kontrole audzēja imunitātē ar Fc inženierijas anti-CTLA-4 antivielām

Anti-CTLA-4 mAb efektīvi uzlabo audzēju imunitāti cilvēkiem. CTLA-4 pēc aktivācijas ekspresē parastās T šūnas un dabiski sastopamās FOXP3 plus CD4 plus Treg šūnas konstitutīvi, radot jautājumu par to, kā anti-CTLA-4 mAb var atšķirīgi kontrolēt šīs funkcionāli pretējās T šūnu populācijas. audzēja imunitāte. Šeit mēs parādām, ka FOXP3 spēcīgi nomācošās efektora Treg šūnas bija daudz melanomas audos, ekspresējot CTLA-4 augstākā līmenī nekā audzējos infiltrējošās CD8 plus T šūnas. Pēc veselu indivīdu vai melanomas pacientu perifēro asiņu mononukleāro šūnu stimulēšanas in vitro ar audzēja antigēnu Fc reģionā modificēts anti-CTLA-4 mAb ar augstu antivielu atkarīgo šūnu mediēto citotoksicitāti (ADCC) un šūnu fagocitozi (ADCP) ) aktivitāte selektīvi samazināja CTLA-4 plus FOXP3 plus Treg šūnas un attiecīgi paplašināja audzēja antigēnam specifiskās CD8 plus T šūnas.

Svarīgi, ka paplašināšanās notika tikai tad, kad antigēna stimulācija tika aizkavēta vairākas dienas no antivielu apstrādes, lai atbrīvotu CTLA-4 plus aktivētās efektora CD8 plus T šūnas no mAb izraisītas nogalināšanas. Līdzīgi pelēm, kurām bija audzējs, ārstēšana ar augstu ADCC/ADCP anti-CTLA-4 mAb ar aizkavētu audzēja antigēna vakcināciju ievērojami pagarināja to dzīvildzi un ievērojami paaugstināja citokīnu veidošanos audzēju infiltrējošās CD8 plus T šūnās, turpretim antivielu ārstēšana. vienlaikus ar vakcināciju nav. Anti-CTLA4 mAb, kas modificēts, lai uzrādītu mazāku Fc saistīšanas aktivitāti vai tās neesamību, neuzrādīja šādu no laika atkarīgu imūnsistēmas uzlabošanos in vitro un in vivo. Tādējādi augsts ADCC anti-CTLA-4 mAb var selektīvi noārdīt efektoru Treg šūnas un izraisīt audzēja imunitāti atkarībā no CTLA-4, kas izsaka efektora CD8 plus T šūnu statusu. Šie atklājumi ir noderīgi, izstrādājot vēža imūnterapiju ar mAb, kas vērstas uz molekulām, kuras parasti ekspresē FOXP3 plus Treg šūnas un audzēju reaktīvās efektoru T šūnas.

Regulējošās T šūnas|CTLA-4|FOXP3|vēža imūnterapija|no antivielām atkarīgā šūnu mediētā citotoksicitāte.

Dabiski sastopamām CD25 plus CD4 plus Treg šūnām, kas ekspresē transkripcijas faktoru FOXP3, ir neaizstājama loma imunoloģiskās paštolerances un homeostāzes uzturēšanā (1). Tomēr tie arī kavē efektīvas imūnās atbildes pret audzēja šūnām, kas rodas no sevis, par ko liecina atklājumi, ka peļu audzējus var izskaust, vienkārši izsīkstot Treg šūnas (2–5).

Cilvēkiem uzkrājas pierādījumi par bagātīgu Treg šūnu infiltrāciju dažādos audzēja audos (6–8) un nozīmīgu korelāciju starp Treg infiltrāciju un sliktu prognozi dažāda veida vēža gadījumā (9). Tāpēc Treg šūnu kontrole audzēja audos, iespējams, ir viens daudzsološs veids, kā vēža slimniekiem izraisīt efektīvu audzēja imunitāti.

Attiecībā uz pretaudzēju mēs atklājām, ka Cistanche deserticola žurku pētījumos ir acīmredzama pretvēža iedarbība. 3 Cistanche deserticola sastāvā esošās polisaharīdu sastāvdaļas var uzlabot ķermeņa imūno funkciju, veicināt balto asins šūnu aktivāciju, uzlabot organisma imūno stāvokli un var arī tieši iedarboties uz audzēja šūnām. Novērš audzēja šūnu proliferāciju, metastāzes un invāziju. Arī kavē angiogenēzi. Audzēja augšanai un metastāzēm ir nepieciešams atbalsts jaunu asinsvadu augšanai, un Cistanche polisaharīdu komponenti var kavēt angiogenēzi, tādējādi samazinot audzēja augšanu un metastāzes.

Noklikšķiniet šeit, lai iegādātos cistanche

Cilvēka FOXP3-izpaužošās CD4 plus T šūnas ir neviendabīgas funkcijas, tostarp Treg šūnas un parastās T šūnas, kas nenomāc. Tos var sadalīt trīs apakšpopulācijās pēc to dažādajiem FOXP3 un CD45RA ekspresijas līmeņiem (10) (1.A att.): (i) CD45RA plus FOXP3lo naivas/atpūtas Treg šūnas [Frakcija (Fr). I];(ii) CD45RA− FOXP3hi efektora Treg (Treg) šūnas (Fr. II), kas ir galīgi diferencētas un ļoti nomācošas; un (iii) CD45RA−FOXP3lo ne-Treg šūnas (Fr. III), kurām nav nomācošas aktivitātes un kuras spēj izdalīt proinflammatoriskus citokīnus. Pēc antigēnas stimulācijas Fr. Es naivās Treg šūnas diferencējas par Fr. II Treg šūnas, kas ļoti ekspresē CTLA-4 (10).

1. attēls. Preferenciālā CTLA-4 ekspresija ar FOXP3hi Treg šūnām melanomas audos. (A un B) CD4 plus T šūnu krāsošanas reprezentatīvie diagrammi (A) un katras frakcijas biežums (B). Veselu donoru PBMC (HD, n=5) un melanomas pacientu PBMC un TIL (attiecīgi n=11 un 14) tika pakļauti tiešai CD4, CD45RA un FOXP3 krāsošanai. (C un D) CCR7 un CD45RA ekspresijas reprezentatīvie grafiki ar CD8 plus T šūnām (C) un katras CD8 un T šūnu apakškopas kopsavilkums (D). (E) CTLA-4 – izsaka kopas (punktēta līnija) PBMC un TIL no melanomas pacientiem, izmantojot CyTOF analīzi. Tiek parādīti CD4 plus un CD8 plus T šūnu viSNE diagrammas ar siltuma kartēm norādītajiem marķiera ekspresijas līmeņiem (n=2). (F) Tikai virsmas vai virsmas un intracelulāra CTLA-4 krāsošana HD PBMC. (G) Virsmas CTLA-4 izpausmes katrai šūnu frakcijai no melanomas pacientu TIL un PBMC. Līdzekļi ± SEM. *P mazāks vai vienāds ar {{20}}.05, **P mazāks vai vienāds ar 0.01, ***P mazāks vai vienāds ar to 0,001 un ****P Mazāks vai vienāds ar 0,0001 pēc vienvirziena ANOVA ar post hoc Tukey HSD testu.

Lai gan lielākā daļa šūnu Fr. III ir ne-Treg šūnas un nediferencējas Fr. II eTreg šūnas, cirkulējoša T-folikulu regulējošo šūnu apakškopa, kas ir CXCR5 plus CD45RA−, ir iekļautas Fr. III (11), kas norāda uz Fr neviendabīgumu. III populācija. Turpretim, ja asinīs ir šīs trīs FOXP3 plus populācijas, lielākajā daļā audzēju dominē Treg šūnu infiltrācija, kas, šķiet, nomāc efektīvas pretvēža imūnās atbildes vēža pacientiem (12). Šie atklājumi liecina, ka Treg šūnu samazināšanās/samazināšana audzējos un reģionālajos limfmezglos ir noderīga pretvēža imūnreakciju izraisīšanā un pastiprināšanā, kā nesen tika pierādīts ar dažām monoklonālām antivielām (mAb), kas ir specifiskas Treg šūnu īpaši ekspresētām molekulām (13).

CTLA-4 pēc aktivācijas ekspresē parastās T šūnas un konstitutīvi FOXP3 plus CD25 plus CD4 plus Treg šūnas. Tam ir galvenā loma Treg izraisītā nomākšanā, vismaz daļēji, kontrolējot CD80/CD 86 ekspresiju ar antigēnu prezentējošām šūnām (APC) (14–16). Sākotnēji tika uzskatīts, ka anti-cilvēka CTLA-4 mAb, kas ir klīniski efektīvs melanomas ārstēšanā (17, 18), bloķē CTLA-4-mediētu negatīvo signālu aktivētās efektora T šūnās, saglabājot to aktivēto stāvokli uzbrūk audzēja šūnām. Tomēr nesenie preklīniskie pētījumi liecina, ka anti-CTLA-4 mAb var noplicināt FOXP3 plus Treg šūnas, īpaši audzēja audos, tādējādi palielinot audzēja imunitāti (19–21). Tomēr cilvēkiem ir strīdīgs jautājums, vai CTLA-4 mAb ietekmē Treg šūnu vai efektoru T šūnu skaitu vai darbību, vai abus, uzlabojot pretvēža imūnās atbildes reakciju klīniskā kontekstā.

Šajā pētījumā mēs in vivo un in vitro pētījām cilvēkiem un pelēm Fc inženierijas radīto anti-CTLA-4 mAb ietekmi uz FOXP3 plus Treg šūnām un paš/audzēja antigēnu specifiskajām CD8 plus T šūnām. Mēs parādām, ka šūnu noārdošais anti-CTLA-4 mAb ar augstu antivielu atkarīgo šūnu mediētas citotoksicitātes (ADCC) aktivitāti var izraisīt pretvēža imūnās atbildes reakcijas atkarībā no CTLA-4 ekspresijas līmeņa un kinētikas divas populācijas. Rezultātus var attiecināt uz šūnu noārdošiem mAb, kas vērsti uz citām šūnu virsmas molekulām, kuras gan Treg, gan efektora T (Teff) šūnas parasti ekspresē dažādos līmeņos un ar atšķirīgu kinētiku.

Nozīme

Anti-CTLA-4 mAb var palielināt audzēja imunitāti, neskatoties uz CTLA-4 ekspresiju, funkcionāli iebilstot pret T šūnu populācijām: aktivētām efektora T (Teff) šūnām un FOXP3 plus CD4 plus Treg šūnām. Šeit mēs parādām, ka anti-CTLA-4 mAb ir izstrādāts tā, lai tie būtu citotoksiski noplicinātas Treg šūnas, kas efektīvi in ​​vitro cilvēkiem un in vivo pelēm. Tas paplašināja antigēnu specifiskās CD8 un Teff šūnas, kad audzēja antigēna stimulēšana tika aizkavēta vairākas dienas, lai pasargātu tās no mAb nogalināšanas. Anti-CTLA-4 mAb, kas modificēts tā, lai uzrādītu mazāku šūnu noārdīšanas aktivitāti vai tās vispār nav, šādu efektu neuzrādīja. Šī stratēģija, kas paredz diferencētu Treg un Teff šūnu kontroli, izmantojot citotoksisku anti-CTLA-4 mAb, lai izraisītu efektīvu audzēja imunitāti, palīdzēs izstrādāt vēža imūnterapiju, kuras mērķis ir citas molekulas, kuras parasti ekspresē Treg un Teff šūnas.

Autora ieguldījums: DH, A. Tanaka, HN un SS izstrādātie pētījumi; DH, A. Tanaka, TK, A. Tanemura, DS, JBW, ELL, KWWT, DA un IK veica pētījumus; A. Tanemura sniedza jaunus reaģentus/analītiskos rīkus; DH, A. Tanaka, TK, DS, DA, EWN, IK, HN un SS analizētie dati; un DH, A. Tanaka un SS rakstīja darbu.

Recenzenti: MA, Tokijas Medicīnas un zobārstniecības universitāte; un SAQ, Londonas Universitātes koledža.

Paziņojums par interešu konfliktu: HN saņēma pētniecības stipendiju no Bristol Myers Squibb. SS saņēma pētniecības stipendiju no Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. TK strādā Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., kas nodrošināja dažas no šajā pētījumā izmantotajām antivielām.

Publicēts saskaņā ar PNAS licenci.

1 Pašreizējā adrese: Imunoloģijas nodaļa, Medicīnas augstskola, Nagojas Universitāte, 466-8550 Nagoja, Japāna.

2 Pašreizējā adrese: Imunoloģijas nodaļa, Moffitt Cancer Center, Tampa, FL 33612.

3 Pašreizējā adrese: Vēža imunoloģijas nodaļa, Pētnieciskās onkoloģijas pētniecības un klīnisko pētījumu centrs, Nacionālais vēža centrs, 277-8577 Kašiva, Japāna.

4 Kam jāadresē korespondence. E-pasts: shimon@ifrec.osaka-u.ac.jp.

Publicēts tiešsaistē 2018. gada 26. decembrī.

Rezultāti

CTLA{0}} – ekspresējošas, galīgi diferencētas FOXP3hi Treg šūnas melanomas audos.

Vispirms mēs novērtējām dažādu T šūnu apakšpopulāciju biežumu starp audzēju infiltrējošiem limfocītiem (TIL) melanomas pacientiem. CD45RA− FOXP3hi eTreg šūnas (Fr. II) bija pārsvarā (∼10-} reizes) palielinātas attiecībās starp CD4 plus TIL, salīdzinot ar perifēro asiņu CD4 plus T šūnām veseliem donoriem vai melanomas pacientiem (1. A un B att. ). CD45RA− FOXP3lo Fr frekvence. III ne-Treg šūnas arī nedaudz palielinājās (∼ divas reizes) starp CD4 plus TIL. Turpretim CD45RA plus FOXP3lo naivās Treg šūnas (Fr. I) tika ievērojami samazinātas TIL līdz vidēji ceturtdaļai no atbilstošās frakcijas perifēro asiņu mononukleārajās šūnās (PBMC).

Starp FOXP3 - parastajām CD4 plus T šūnām TILs, CD45RA - FOXP3 - efektor/atmiņas CD4 plus T šūnas, kuras varētu tālāk sadalīt CD25 plus (Fr. IV) un CD25 - (Fr. V) populācijās (10). , nedaudz (∼1.{9}}) palielinājās, savukārt CD45RA plus FOXP3− naivās CD4 plus T šūnas (Fr. VI) ievērojami samazinājās līdz vienai desmitajai daļai no tām, kas atrodas PBMC. TIL CD8 plus T-šūnu frakcijā, salīdzinot ar pacientu vai veselu donoru PBMC, bija ievērojams CD45RA−CCR7− efektoratmiņas T (TEM) šūnu skaita pieaugums (∼1{17}}). ar ievērojamu CD45RA plus CCR7 plus naivo un CD45RA plus CCR7- termināli diferencētās efektora atmiņas (TEMRA) šūnu skaita samazināšanos attiecīgi līdz pusei un vienai piektdaļai no tām, kas atrodas PBMC, un nav būtisku izmaiņu CD45RA- CCR7 plus centrālajā atmiņā T (TCM) šūnas (1. C un D att.). Tika novērots arī melanomas pacientiem, ka naivu CD8 plus T šūnu skaits PBMC ievērojami (∼{29}} reizes) samazinājās, salīdzinot ar veseliem donoriem.

Pēc tam mēs novērtējām, kura T-šūnu populācija izteica CTLA-4 melanomas pacientu TIL vai PBMC, izmantojot citometriju, izmantojot lidojuma laika (CyTOF) masas spektrometrijas citometru (1. att. E un SI pielikums, S1. att.). CD4 plus CD45RA− Foxp3hi šūnu kopa, kas pārstāv Fr. II eTreg šūnas pārsvarā ekspresēja CTLA4 PBMC un TIL, savukārt CD8 plus T šūnas gandrīz neizteica CTLA-4 ne PBMC, ne TIL. Pelēm dominējošā CTLA4 ekspresija ar FOXP3 plus Treg šūnām tika līdzīgi novērota liesā un CMS5a audzēja audos (SI pielikums, S1B att.). CTLA4, ko ekspresē cilvēka Fr. II Treg šūnas galvenokārt atradās intracelulārajā nodalījumā, un šūnu virsmas CTLA-4 bija ierobežota (1. att. F). Tomēr TILs, Treg šūnās un mazākā mērā Fr. Tika konstatēts, ka III šūnas, kas nav Treg, ievērojami augstā līmenī ekspresē virsmas CTLA-4 (1. G. attēls un SI pielikums, S2. att.). TIL CD8 plus TCM un TEM šūnas arī izteica augstāku virsmas CTLA-4 līmeni, salīdzinot ar jebkuru no cirkulējošām T šūnu frakcijām, lai gan Treg šūnas uzrādīja daudz augstāku ekspresiju melanomas pacientiem (1. G attēls un SI pielikums, att.). S2).

Kopumā cilvēka melanomas audu galvenās iezīmes ir attiecīgi ievērojams Treg šūnu un naivo Treg šūnu skaita pieaugums un samazinājums, kā arī ievērojams efektora/atmiņas CD8 plus T šūnu skaita pieaugums, samazinoties naivu CD8 plus T šūnu skaitam. Šīs Treg šūnas un CD8 plus T šūnas TILs ekspresē CTLA-4 uz šūnu virsmas, pirmā ekspresija ir augstāka nekā otrā. Atšķirībā no TIL eTreg šūnām, cirkulējošās eTreg šūnas melanomas pacientiem ir ievērojami zemākas virsmas CTLA4 ekspresijas līmenī, kas liecina, ka anti-CTLA-4 mAb ārstēšana tās var ietekmēt mazāk.

Treg šūnu un antigēnu specifisko CD8 plus T šūnu skaita samazināšana, veicot in vitro apstrādi ar šūnu noārdošo anti-CTLA-4 mAb un vienlaicīgu antigēnu stimulāciju.

Lai noskaidrotu, vai anti-CTLA-4 mAb pretvēža iedarbība ir atkarīga no tā spējas noārdīt Treg šūnas ar ADCC palīdzību, mēs modificējām anti-CTLA-4 IgG1 mAb Fc daļu (klons MDX{{3). }}, ipilimumabs), kam bija mērena ADCC aktivitāte, lai mainītu savu afinitāti pret Fc RIIIa (CD16a), aktivējošo Fc R, ko ekspresē NK šūnas, monocīti/makrofāgi un citas šūnas (22) (2.A attēls). Tādējādi ģenerētam anti-CTLA-4 mAb ar augstu ADCC aktivitāti, ko mēs nosaucām par asimetrisko reinženierijas tehnoloģiju-Fc domēnu (ART-Fc), katrā smagajā ķēdē bija atšķirīga aminoskābju aizstāšana (23); tas ir, L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A aizstāšana vienā smagās ķēdes Fc reģionā un D270E/K326D/A330M/K334E aizstāšana otrā. Rekonstruētais mAb uzrādīja 1,{24}}reizi augstāku saistīšanās afinitāti pret cilvēka Fc RIIIa nekā nemodificētam mAb, nepalielinot afinitāti pret inhibējošo Fc RIIb. Mēs arī izveidojām anti-CTLA-4 mAb, kas gandrīz nesaistās ar Fc Rs, ko mēs saucām par kluso Fc anti-CTLA-4, aminoskābju aizstāšanas rezultātā; tas ir, L235R, G236R un S239K abu smago ķēžu Fc reģionā. Salīdzinot ar nemodificētu vai klusu Fc anti-CTLA-4 mAb, ART-Fc uzrādīja daudz augstāku in vitro citotoksicitāti pret CTLA-4 – ekspresējošām Ķīnas kāmja olnīcu (CHO) šūnām veselu donoru PBMC klātbūtnē. , ar paaugstinātu citotoksicitāti ilgākas inkubācijas rezultātā (2.B att.). Līdzīgi ART-Fc anti-CTLA-4 mAb efektīvi nogalināja tikko pagatavoto Fr. II Treg šūnas un mazākā mērā Fr. III ne-Treg vai Fr. I naivās Treg šūnas, savukārt IgG1 (ipilimumabs) vai klusais Fc mAb gandrīz neuzrādīja iznīcinošu aktivitāti (2. att. C).

Pēc tam mēs novērtējām šo Fc izstrādāto mAb ietekmi uz CD8 plus T šūnu antigēnu specifisko ekspansiju in vitro, stimulējot PBMC no HLA-A*0201, kas ekspresē veselus donorus vai melanomas pacientus 9 dienas ar dažādiem peptīdiem, piemēram: iegūts no Melan-A/MART-1, paš/audzēja antigēna, ko ekspresē normāli melanocīti un dažas melanomas šūnas (24); un NY-ESO-1, vēža/sēklinieku antigēns, ko ekspresē dažāda veida vēža šūnas un cilvēka dzimumšūnu šūnas (25), citomegalovīruss (CMV) vai gripas (gripas) vīruss. Šī in vitro peptīdu stimulācija, piemēram, ar Melan-A peptīdu, saglabāja augstu CTLA4 ekspresiju ar Treg šūnām (2. att. D un SI pielikums, S3. att.). Peptīdu stimulācija vien arī paplašināja peptīdu specifisko tetramēru (Tet) plus CD8 plus T šūnas, kas izteica augstāku CTLA-4 līmeni, īpaši uz šūnu virsmas, salīdzinot ar Tet- šūnām (2. att. E, F, un es). Ja ART-Fc anti-CTLA-4 mAb bija klāt no veselu donoru vai melanomas pacientu PBMC peptīdu stimulācijas sākuma, CTLA-4 ekspresējošo Treg šūnu attiecība starp CD4 plus T šūnām bija ievērojami samazināts atkarībā no devas, savukārt klusais Fc mAb šo efektu neuzrādīja (2. att. D un G un SI pielikums, S4. un S5. att.).

Tomēr Treg šūnu samazināšanās nebija saistīta ar antigēnu specifisko CD8 plus T šūnu paplašināšanos; drīzāk ārstēšana izraisīja dziļu Tet plus CD8 plus T šūnu attiecības samazināšanos starp CD8 plus T šūnām (2H att.). Šajās in vitro stimulācijās nemodificēts IgG1 vai klusais Fc anti-CTLA-4 mAb neuzrādīja nozīmīgu eTreg noārdošo aktivitāti (2. att.). Šo mAb izraisītā eTreg šūnu samazināšanās pakāpe patiešām korelēja ar antigēnu specifisko CD8 plus T šūnu samazināšanos neatkarīgi no stimulējošā antigēna, piemēram, Melan-A vai CMV peptīda (2. att.).

Tādējādi, lai gan Treg šūnas konstitutīvi ekspresē CTLA-4, īpaši intracelulāro CTLA-4, antigēna stimulācija paplašina CD8 plus T šūnas, kas ekspresē augstu CTLA-4 līmeni, īpaši uz šūnu virsmas. ART-Fc anti-CTLA-4 mAb ar augstu ADCC aktivitāti tādējādi spēj noārdīt ne tikai CTLA-4 plus Treg šūnas, bet arī antigēnu aktivētās CTLA-4 plus CD8 plus T šūnas. . Šis efektora CD8 plus T-šūnu samazināšanās var kompensēt eTreg šūnu samazināšanās imūnsistēmu uzlabojošo efektu imūnās reakcijās in vitro.

2. attēls. Vienlaicīga in vitro peptīdu stimulēšana ar ART-Fc anti-CTLA-4 mAb ierobežo antigēnu specifiskās CD8 un T šūnu atbildes reakcijas. (A) Kopsavilkums par aminoskābju aizstāšanu, kas veiktas pret cilvēka CTLA-4 IgG1 mAb Fc daļā (klons MDX-010, ipilimumabs), lai radītu ART-Fc vai kluso Fc mAb, un to afinitāte. uz inhibējošo Fc RIIb vai aktivējošo Fc RIIIa. Silent-Fc mAb afinitāte bija zem BIACORE testa noteikšanas robežas. (B) dažādu anti-CTLA4 mAb ADCC aktivitāte pret cilvēka CTLA-4-ekspresējošām CHO šūnām. Anti-CTLA-4 mAb (ART, ar ADCC uzlabots anti-CTLA-4 ART-Fc; IgG1, parasts nemodificēts anti-CTLA-4 IgG1; kluss, ar Fc reģionu inaktivēts anti- CTLA-4 silent-Fc) tika inkubēti ar CHO šūnām un HD PBMC (n=3) ar E/T attiecību 50:1. Līdzekļi ± SEM. Zvaigznītes norāda būtiskas atšķirības starp katru antivielu un kluso-Fc attiecīgajās koncentrācijās {{30}}h (melns) vai 24-h (sarkans) kultūrām. (C) ADCC aktivitāte katrai CD4 plus un CD8 plus T šūnu frakcijai no PBMC ar ART-Fc, IgG1 vai silent-Fc anti-CTLA-4 mAb (n=4 vai 5). Ir norādīts mirušo šūnu biežums starp KTV iepriekš marķētām šūnām pēc {{40}}h kultūras. (D) Fr. CTLA-4 izteiksme. II Treg šūnas pēc 9 d Melan-A peptīda stimulācijas un 1 ug/ml ART-Fc, silent-Fc vai IgG1 anti-CTLA-4 mAb apstrādes veseliem PBMC (n {{50 }}). (E un F) Virsmas CTLA-4 izpausmes ar Tet plus un Tet−CD8 plus T šūnām pēc norādītajām peptīdu stimulācijām. Reprezentatīvās histogrammas (E) un vidējās fluorescences intensitātes (MFI) (F) kopsavilkums (Melan-A, n=9; CMV, n=9; Flu, n=3; ESO{{ 57}}, n=4). (G un H) Reprezentatīvie zemes gabali un frekvences Fr. II eTreg šūnas (G) un antigēnu specifiskās CD8 plus T šūnas (H) no HD (n=6) vai melanomas pacientiem (n=5) pēc kultivēšanas ar norādīto peptīdu un 1 ug/ml ART -Fc anti-CTLA-4 mAb kā D. (I) Treg šūnu (augšējā) un Tet plus CD8 plus T šūnu (apakšējā) biežuma noteikšana pēc 9 d Melan-A vai CMV antigēna stimulācijas HD PBMC ar norādītajiem anti-CTLA-4 mAb G un H. Vidēji ± SEM. Attēlotā nozīme starp abām grupām tika aprēķināta, izmantojot pāra t-testu, vienvirziena ANOVA vai divvirzienu ANOVA ar post hoc Tukey HSD testu. *P mazāks vai vienāds ar 0,05, **P mazāks vai vienāds ar 0,01, ***P mazāks vai vienāds ar 0,001 un ****P mazāks vai vienāds ar 0,0001.

Spēcīga antigēnu specifisko CD8 plus T šūnu paplašināšanās, eTreg šūnu izsīkšana pirms antigēnu stimulācijas.

. Pēc tam mēs mēģinājām noārdīt CTLA-4 plus Treg šūnas pirms antigēna stimulācijas, lai pasargātu antigēnu aktivētās CTLA-4 – ekspresējošās CD8 plus T šūnas no nonāvēšanas ar anti-CTLA-4 mAb. Mēs kultivējām veselus PBMC no veseliem donoriem vai melanomas pacientiem ART-Fc anti-CTLA-4 mAb klātbūtnē 5 dienas bez antigēna stimulācijas, noņēmām mAb, pēc tam 8 dienas stimulējām šūnas ar dažādiem peptīdiem un analizējām tās, lai noteiktu Treg šūnu un Tet plus CD8 plus T šūnu attiecība attiecīgi starp CD4 plus T šūnām vai CD8 plus T šūnām (3. att.). FOXP3hi Treg šūnu attiecība tika ievērojami samazināta 5 dienu laikā ar ART-Fc pirmapstrādi (3.A att. un SI pielikums, S6. att.) un saglabājās zemā līmenī turpmākās peptīdu stimulācijas laikā (3.B att.), norādot, ka Treg. šūnas nebija pilnībā atveseļojušās antigēnu stimulācijas periodā. Šī ART-Fc pirmapstrāde apvienojumā ar antigēna stimulāciju izraisīja spēcīgu Melan-A specifisko CD8 plus T šūnu ekspansiju no veseliem donoru PBMC un NY-ESO-1 specifiskām CD8 plus T šūnām no PBMC pacientiem, kuru melanomas audi bija ekspresēti. NY-ESO-1 (3. C attēls). CMV specifiskās CD8 plus T šūnas īpaši neietekmēja ART-Fc mediētā Treg izsīkšana. Atšķirībā no ART-Fc, klusais Fc anti-CTLA-4 mAb nemainīja Treg šūnu biežumu un nespēja paplašināt Tet plus CD8 plus T šūnas neatkarīgi no antigēna sugām (3. D attēls).

Viens no dažādajiem nomākšanas mehānismiem, ko izmanto Treg šūnas, ir no CTLA-4 atkarīga CD80 un CD86 ekspresijas pazemināšana ar dendrītiskajām šūnām (DC) (14, 15). Lai izpētītu šī mehānisma iespējamo ieguldījumu paš/audzēja antigēnam specifisko CD8 plus T šūnu paplašināšanā pēc in vitro ART-Fc anti-CTLA-4 mAb terapijas, mēs novērtējām CD80 un CD86 ekspresiju, izmantojot DC, kas fenotipiski tika definēti kā Lin-1- CD11c plus HLA-DR plus, veseliem donoru PBMC. Gan CD80, gan CD86 ekspresija uzrādīja izteiktu augšupregulāciju ART-Fc iepriekš apstrādātajā grupā, atšķirībā no nemainītās CD80/CD86 ekspresijas nemodificētā IgG1- iepriekš apstrādātā, klusajā Fc. – iepriekš apstrādāta vai neapstrādāta grupa (3. E attēls). Turklāt mAb Fc R saistīšanās afinitātes pakāpei bija laba korelācija ar to Treg izsīkšanas aktivitāti un arī ar Tet plus CD8 plus T šūnu inducējošo aktivitāti (3.F attēls). Tā kā vienkārša CTLA-4 bloķēšana ar Silent-Fc neregulēja CD80/86, rezultāti liecināja, ka Treg izsīkšana ar ART-Fc aktivizēja DC, lai gan pastāv iespēja, ka pats ART-Fc varētu papildus veicina DC aktivizēšanu, ar augstu afinitāti saistoties ar to aktivizējošajiem Fc receptoriem.

Kopumā šie rezultāti liecina, ka Treg samazināšanās ar ART-Fc anti-CTLA-4 mAb vairākas dienas pirms antigēna iedarbības var novērst CTLA-4 plus antigēnu aktivēto CD8 plus T šūnu nogalināšanu, ko izraisa antiviela. paplašinot tos, vismaz daļēji, uzlabojot CD80/CD86 izteiksmi ar APC.

3. attēls. Treg šūnu iepriekšēja samazināšanās, izmantojot ART-Fc anti-CTLA-4 mAb, uzlabo paš/audzēja antigēnu specifiskās CD8 un T šūnu atbildes reakcijas. (A–D) Antigēnam specifiskās CD8 plus T šūnas tika inducētas no veseliem HD (n=7) vai pacientu (n=5) ​​PBMC pēc 5 dienu pirmapstrādes ar ART-Fc anti-CTLA{ {11}} mAb. (A) Eksperimenta shēma un CD4 plus T šūnu reprezentatīva FOXP3 un CD45RA krāsošana eksperimenta dienā -5 un dienā 0. Kopsavilkums par Fr. II eTreg frekvences dienā 0 (apakšā). (B un C) CD4 plus T šūnu (B) un antigēnu specifisko CD8 plus T šūnu (C) reprezentatīva FOXP3 krāsošana ar vai bez ART-Fc pirmapstrādes katram peptīdam pēc kultūras. Treg un antigēnu specifisko CD8 plus T šūnu biežuma kopsavilkums pēc kultivēšanas (apakšā). (D) Kopsavilkums par Fr. II eTreg un Tet plus CD8 plus T šūnu frekvences ar Silent-Fc anti-CTLA-4 mAb pirmapstrādi, nevis ART-Fc, kā A–C. (E) CD80 un CD86 ekspresijas līmeņi, izmantojot Lin-1-CD11c plus HLA-DR plus DC pēc 5 dienas Melan-A stimulācijas ar iepriekšēju apstrādi ar norādīto anti-CTLA. -4 mAb (n=6). Cipari histogrammās parāda MFI. (F) Treg un Tet plus CD8 plus T šūnu biežuma kopsavilkums pēc pirmapstrādes ar norādītajiem anti-CTLA-4 mAb, kam sekoja Melan-A26-35 stimulācija, kā norādīts A-C. Līdzekļi ± SEM. Attēlotā nozīme starp abām grupām tika aprēķināta, izmantojot pāra t-testu. *P Mazāks vai vienāds ar 0,05.

CTLA-4 — mediēta Treg izsīkšana pirms audzēja antigēna vakcinācijas uzlabo pretvēža reakciju pelēm.

Lai apstiprinātu in vitro atradumus ar cilvēka PBMC un anti-cilvēka CTLA-4 mAb, mēs izveidojām mAb ar augstu vai zemu ADCC un no antivielām atkarīgu šūnu fagocitozes (ADCP) aktivitāti no anti-peles CTLA{{4 }} IgG2a izotipa (turpmāk saukta par mIgG2a) mAb (klons UC10) ar aminoskābju aizstāšanu Fc domēnā (4.A attēls). Mutācija S239D abās smagajās ķēdēs paaugstināja afinitāti pret peles Fc RIV ~septiņkārtīgi (mFa55 mIgG2a variants), savukārt L235R, G236R un S239K mutācijas abās smagajās ķēdēs padarīja tās nesaistošas ​​ar peles Fc Rs (mFa3a1 mIgG); pirmais tika saukts par peles ADCC/ADCP-enhanced-Fc (uzlabotu), otro peles kluso-Fc (mSilent) mAb. Lai salīdzinātu šo Fc modificēto anti-peles–CTLA-4 mAb pretvēža aktivitāti kombinācijā ar audzēja antigēna vakcināciju, mēs subkutāni inokulējām BALB/c pelēm CMS5a fibrosarkomas šūnas, kas ekspresē cilvēka NY-ESO-1 antigēnu, un 9. dienā, kad audzējs izveidojās, ārstēja peles ar 100 ug katra mAb un tajā pašā dienā vakcinēja ar NY-ESO-1 peptīdu (9. diena; turpmāk protokolu saucam par "vienlaicīgu ārstēšanu"). vai 3 dienas vēlāk (12. diena; turpmāk "Ab priekšapstrāde") (4.B att.). Ab pirmapstrāde ar mEnhanced mAb bija efektīvāka nekā vienlaicīga ārstēšana vai pirmapstrāde ar mIgG2a vai mSilent mAb audzēja augšanas aizkavēšanā; pēdējo divu mAb ietekme uz audzēja augšanu bija zema un būtiski neatšķīrās starp Ab pirmapstrādi un vienlaicīgu ārstēšanu (4.C att.). Dzīvildze bija ievērojami labāka pelēm, kas iepriekš tika ārstētas ar mIgG2a, kā arī pelēm, kurām tika veikta vienlaicīga ārstēšana vai pirmapstrāde ar mIgG2a, lai gan neviens no mIgG2a ārstēšanas veidiem vairumam peļu neizraisīja audzēja regresiju (4. C un D attēls).

4. attēls. Iepriekšēja apstrāde ar ADCC/ADCP pastiprinātu anti-CTLA-4 mAb izraisa spēcīgu pretvēža iedarbību pelēm. (A) Kopsavilkums par aminoskābju aizstāšanu, kas veiktas anti-peles CTLA-4 IgG2a mAb Fc daļā (klons UC10; mIgG2a), lai ģenerētu ar ADCC/ADCP uzlabotu anti-peles-CTLA{{ Tiek parādīti 10}} (uzlaboti) vai klusie Fc anti-peles–CTLA-4 (mSilent) mAb un to afinitāte pret peles Fc RIV. mAb mAb afinitāte bija zem BIACORE testa noteikšanas robežas. (B–D) Eksperimenta shēma (B). Peles tika inficētas ar 2 × 106 CMS5a fibrosarkomu, kas ekspresēja cilvēka NY-ESO-1 dienā {{40}}, un tās netika ārstētas vai apstrādātas ar mEnhanced, mIgG2a vai silent. anti-peles-CTLA-4 mAb 9. dienā. Vakcinācija ar NY-ESO-181-88 peptīdiem, kas sajaukti ar CFA, tika veikta tajā pašā dienā (9. diena, vienlaicīga ārstēšana) vai 3 dienas vēlāk (diena 12, Ab pirmapstrāde). Katras peles audzēja augšana ar treknu līniju, kas norāda katras ārstēšanas grupas vidējo vērtību (C) (n=8–13 katrā grupā). Katras ārstēšanas grupas vidējā audzēja augšanas kopsavilkums (D, pa kreisi). Zvaigznītes norāda P vērtības starp mEnhanced mAb pirmapstrādes grupu, izmantojot divvirzienu ANOVA ar Tukey vairāku salīdzināšanas testu. Katras ārstēšanas grupas izdzīvošanas līmeņa kopsavilkums (D, pa labi). P vērtības starp katras grupas dzīvildzi un tikai vakcīnas kontroles izdzīvošanu tika aprēķinātas ar log-rank testu. Nāves gadījums atbilst audzēja garumam, kas lielāks par 200 mm vai vienāds ar to, vai peles nāvei. *P mazāks vai vienāds ar 0,05, **P mazāks vai vienāds ar 0,01, ***P mazāks vai vienāds ar 0,001 un ****P mazāks vai vienāds ar 0,0001.

Uzlabotā mAb pirmapstrāde izraisīja arī ievērojamu audzēju infiltrējošo CD8 plus T šūnu skaita pieaugumu un CD8/Treg attiecību TIL, lai gan nedaudz palielinājās FOXP3 plus šūnu procentuālais daudzums starp CD4 plus T šūnām (5. att. C). Turklāt, lai gan NY-ESO-1 peptīdam specifisko CD8 plus TIL biežums pelēm, kas tika ārstētas ar katru mAb vai starp pirmapstrādi un vienlaicīgu ārstēšanu, statistiski neatšķīrās, antigēnam specifiskie CD8 un TIL no uzlabotā mAb tika iepriekš apstrādāti. pelēm, salīdzinot ar citām grupām, uzrādīja ievērojami aktīvāku IL-2 un IFN veidošanos pēc in vitro restimulācijas ar NY-ESO-1 peptīdu (5. att. D un E). Turklāt efektora atmiņas CD8 plus T šūnas, kas definētas kā CD44highCD62Llow populācija, ievērojami palielinājās starp NY-ESO-1-specifiskiem CD8 plus TIL pelēm, kas iepriekš apstrādātas ar uzlabotu mAb (5. att. F un G).

Kopumā mEnhanced mAb pirmapstrāde bija visefektīvākā, lai izraisītu audzēja imunitāti, kam sekoja pirmapstrāde ar mIgG2a, kurai bija zināma ADCC aktivitāte, savukārt mSilent mAb bija daudz mazāk efektīva. Rezultāti liecina, ka audzēju saturošu peļu pirmapstrāde ar ADCC/ADCP pastiprinātu anti-CTLA-4 mAb, kam seko audzēja antigēna vakcinācija, var efektīvi izraisīt pretvēža imūnās atbildes reakcijas in vivo.

Diskusija

Galvenie atklājumi šajā ziņojumā ir šādi: (i) galīgi diferencētas, ļoti nomācošas eTreg šūnas ir daudz audzēja audos un ekspresē virsmas CTLA-4 augstākā līmenī nekā audzējā infiltrējošās CD8 plus T šūnas; (ii) anti-CTLA-4 mAb ar augstu ADCC aktivitāti spēj noplicināt/samazināt CTLA-4augstas eTreg šūnas un CTLA-4 plus efektora CD8 plus T šūnas; un (iii) šūnu noārdīšanas anti-CTLA-4 mAb var izraisīt un uzlabot efektīvu audzēja imunitāti, ja antivielu ārstēšanas shēma ir izstrādāta tā, lai tā neietekmētu CTLA-4 plus efektora CD8 plus T šūnas, piemēram, mainot Treg šūnu izsīkuma un vēža antigēna vakcinācijas laiku.

Anti-CTLA{0}} mAb ADCC aktivitāte ir galvenais faktors, kas nosaka eTreg samazināšanas efektivitāti un no tā izrietošo ar audzēju reaģējošo CD8 plus T šūnu paplašināšanos. Atbalstot domu, mēs parādījām, ka anti-CTLA-4 mAb (ART-Fc) ar pastiprinātu ADCC aktivitāti (un/vai ADCP aktivitāti pelēm) spēj palielināt pretvēža imūnās atbildes reakcijas in vitro cilvēkiem un in vivo pelēm, noārdot CTLA{5}}-ekspresējošās Treg šūnas. Anti-CTLA4 mAb (klusais-Fc), kas modificētas tā, lai uzrādītu daudz mazāku ADCC aktivitāti vai tās neesamību, neuzrādīja šādu pretvēža aktivitāti, pat ja tiem bija tāda pati specifika attiecībā uz CTLA-4 molekulas epitopu. Joprojām nav skaidrs, vai ipilimumaba ar IgG1 Fc daļu pretvēža iedarbība ir saistīta ar CTLA4 molekulas bloķēšanu vai CTLA{11}} ekspresējošo šūnu samazināšanos ar ADCC. Pelēm tika pierādīts, ka, lai uzlabotu pretvēža imunitāti ar anti-CTLA-4 mAb, bija nepieciešams izsīkt audzējos infiltrējošās Treg šūnas ar Fc R mediētu ADCC (19–21, 26, 27). Līdzīgi tika pierādīts, ka antivielas pret GITR, OX40 un CD25 molekulām, kurās audzēju infiltrējošās Treg šūnas ekspresē vislielāko daudzumu, ir atkarīgas no ADCC izraisītas Treg šūnu samazināšanās audzēja atgrūšanas gadījumā (19, 26, 28). Tika arī ziņots, ka ārstēšana ar ipilimumabu melanomas pacientiem ievērojami samazināja FOXP3 plus Treg šūnas audzēja audos, īpaši klīniski reaģētājiem (29).

Turklāt nesenā ziņojumā ir parādīts, ka starp melanomas pacientiem ar augstu audzēja mutāciju slogu tiem pacientiem, kuriem ģenētiski ir augstas afinitātes Fc RIIIa variants ar pastiprinātu ADCC (V158 variants pretstatā F158 zemas afinitātes variantam), bija ievērojami labāki rādītāji. klīniskās atbildes reakcijas uz ārstēšanu ar ipilimumabu un labāku kopējo dzīvildzi (27). Šis atklājums apstiprina uzskatu, ka anti-CTLA-4 mAb ar labāku Treg izsīkšanas aktivitāti vēža imūnterapijā var būt efektīvāki par ipilimumabu. Tādējādi ir iespējams, ka ART-Fc anti-CTLA4 mAb, kam ir augsta afinitāte pret V158 variantu (KD=3,7 × 10–10 M, salīdzinot ar 3,1 × 10–6 M ipilimumabam vai IgG1) , var būt labāka klīniskā efektivitāte vēža imūnterapijā, samazinot Treg šūnas. Kopumā šie atklājumi cilvēkiem un pelēm liecina, ka augsta ADCC/ADCP anti-CTLA-4 mAb var būt efektīva, lai izraisītu un uzlabotu audzēja imunitāti, noārdot Treg šūnas.

5. attēls. Ag-specifiskas CD8 plus T šūnu atbildes reakcijas, ko izraisīja pelēm ar audzējiem, iepriekš apstrādājot ar ADCC/ADCP pastiprinātu anti-CTLA-4 mAb. (A–G) TIL no 4. attēla tika analizēti 19 dienas pēc audzēja implantācijas (n=4–6 katrā grupā). Infiltrēto T šūnu skaits uz gramu audzēja (A). CD8/Treg šūnu attiecība (B). Foxp3 plus Treg šūnu biežums starp CD4 plus T šūnām (C). Reprezentatīvi IL-2 plus IFN- plus CD8 plus T šūnu diagrammas (D). Citokīnu ražošana tika mērīta, atkārtoti stimulējot TIL ar ESO-181-88 peptīdiem in vitro 5 stundas. Kopsavilkums par Tet plus CD8 plus T šūnām audzējā un IL{{20}} plus IFN- plus CD8 plus T šūnām D pēc restimulācijas (E). Reprezentatīvie grafiki (F) un kopsavilkums (G) CD44 un CD62L izpausmēm pēc NY-ESO-1-Tet plus CD8 plus T šūnām katras ārstēšanas grupas audzējā. Dati tika iegūti no trim neatkarīgiem eksperimentiem. P vērtības starp Naive vai EM CD8 plus T šūnu apakškopām katrā stāvoklī. Līdzekļi ± SEM. *P mazāks vai vienāds ar 0.05, † P mazāks vai vienāds ar 0.05, **P mazāks vai vienāds ar 0,01, ††P mazāks vai vienāds ar 0,01 un ***P mazāks vai vienāds ar 0,001, izmantojot divvirzienu ANOVA ar Tukey vairāku salīdzināšanas testu.

Materiāli un metodes

Donoru paraugi.

Perifēro asiņu paraugi tika iegūti no veseliem indivīdiem vai pacientiem ar III līdz IV stadijas melanomu. PBMC tika izolēti ar blīvuma gradientu ar Ficoll-Paque (GE Healthcare). TIL tika iegūti no izdalītiem melanomas audiem. Audzējs tika sasmalcināts, un pēc maigas MACS disociācijas (Miltenyi) iegūtās vienšūnu suspensijas tika sagatavotas, filtrējot caur 40- μm šūnu sietiņu. Visi donori pirms paraugu ņemšanas sniedza rakstisku informētu piekrišanu saskaņā ar Helsinku deklarāciju. Šo pētījumu apstiprināja Osakas universitātes Institucionālā pārskata padome.

CyTOF analīze.

TIL un splenocīti no pelēm ar audzējiem tika bagātināti ar CD3 plus šūnām un iekrāsoti ar 198-cisplatīnu, lai atšķirtu mirušās šūnas, un antivielu paneli, ieskaitot šādas ar metālu konjugētas antivielas: 172Yb-CD4 (RM4-5). ), 168Er-CD8 (53-6.7), 164Dy-CTLA-4 (UC-10), 158GdFOXP3 (FJK-16s). Cilvēka PBMC un TIL šūnu suspensijas tika svītrkodētas ar anti-CD45 antivielām ar dažādiem metālu konjugātiem, kā aprakstīts iepriekš (35), pirms krāsošanas ar 198-cisplatīnu mirušo šūnu diskriminācijai un pēc tam antivielu krāsošanas ar šādu paneli. Ar metālu konjugētās antivielas tika iegūtas no Fluidigm vai Maxpar Antibody Labeling komplekts (Fluidigm) tika izmantots saskaņā ar ražotāja norādījumiem, lai konjugētu attīrītas antivielas: 89Y-CD45 (klons: HI30; Fluidigm), 115In-CD45 (HI30; Biolegend),-. CD45 (HI30; Biolegend) antivielas tika izmantotas dažādu paraugu svītrkodēšanai; CLA-FITC (HECA-452; BD), CCR8-PE (L263G8; Biolegend), CXCR5-Biotīns (RF8B2; BD), eVolve 605 (114 Cd)-CD8a (RPA) -T8; eBioscience), 139La-CD123 (6H6; Biolegend), 141Pr-CCR6 (11A9; Fluidigm), 142Nd-CD14 (M5E2; Biolegend), 144Nd-FITC (CLA) (FIT22; CD14RPAN-T),4 ; Fluidigm), 148Sm-CD20 (2H7; Biolegend), 149Sm-CCR4 (205410; Fluidigm), 150Nd-SAV (CXCR5) (1D4-C5; Fluidigm), 151Eu-ICOS (C3); F98luid. , 152Sm-CD69 (FN50; Biolegend), 153Eu-CD45RA (HI100; Fluidigm), 154Sm-CD3 (UCHT1; Fluidigm), 155Gd-CD197 (CCR7) (150503; R&D Systems),-1-anti PE001; Fluidigm), 158Gd-CD27 (L128; Fluidigm), 159TbCD19 (HIB19; Biolegend), 160Gd-CD39 (A1; Fluidigm), 163Dy-CXCR3 (G025H7; Fluidigm (G025H7; Fluidigm (G025H7; Fluidigm),-6-25; CD45RO (UCHL1; Fluidigm), 166Er-CD279 (PD-1) (EH12.2H7; Biolegend), 167Er-PDL1 (29E.2A3; Biolegend), 169Tm-CD25 (IL-2R) ( 2A3; Fluidigm), 171Yb-CD11c (3.9; Biolegend), 172YbCD38 (HIT2; Fluidigm), 173Yb-TIGIT (MBSA43; eBioscience), 174Yb-HLA-DR (L243; Fluidigm), 176Yb-CD127 (IL-7R) (A019D5; Fluidigm), 209Bi-CD11b (ICRF44; Fluidigm), 146Nd-Helios (22F6; Biolegend), 161Dy–CTLA} ({143}; Fluidigm), 162Dy-FOXP3 (236A/E7; eBioscience) un 168Er-Ki-67 (Ki-67; Fluidigm).

Cilvēka un peles šūnas pirms intracelulārās krāsošanas tika fiksētas ar eBioscience Foxp3 / transkripcijas faktora krāsošanas buferiem (ThermoFisher). Pēc tam iekrāsotās šūnas tika atkārtoti suspendētas 2% PFA ar 191/193-irīdija DNS interkalatoru (Fluidigm) uz nakti, pēc tam mazgātas un atkārtoti suspendētas Maxpar ūdenī (Fluidigm) un EQ četru elementu lodītes (Fluidigm) tieši pirms analīzes ar Helios CyTOF. sistēma (Fluidigm). Normalizētie dati tika analizēti ar Cytobank Premium.

Antigēnam specifisku CD8 plus T šūnu stimulēšana.

Veseli PBMC no veseliem indivīdiem un melanomas pacientiem tika stimulēti ar 10 μM īsiem peptīdiem, kas specifiski HLA-A*0201 (Operon Biotechnology) 8–9 dienas: Melan-A26–35 (EAAGIGILTV), CMV495–503 (NLVPMVATV), Flu58. –66 (GILGFVFTL) vai NY-ESO1157–165 (SLLMWITQC) (12, 22). Lai noteiktu anti-CTLA-4 mAb iedarbību ar dažādiem ADCC, tajā pašā dienā vai 5 dienas pirms antigēna stimulācijas kultūrai tika pievienots viens no šiem mAb ar 1 ug/ml (ja nav norādīts citādi): ADCC. -uzlabots anti-cilvēka–CTLA-4 IgG1 (MDX-010-ART-Fc), parasts nemodificēts anti-CTLA-4 IgG1 (MDX-010-IgG1) vai klusais Fc anti-CTLA-4 IgG1 antivielas (MDX-010-silent-Fc): visus mAb laipni nodrošināja uzņēmums Chugai Pharmaceutical. Puse barotnes tika aizstāta ar svaigu barotni, kas satur 10 V/mL IL-2 un 40 ng/ml IL-7 ik pēc 3 dienām.

Laktātdehidrogenāzes izdalīšanās tests ar cilvēka CTLA-4 – ekspresējošām CHO šūnām.

Tika veikts laktāta dehidrogenāzes (LDH) izdalīšanās tests, lai noteiktu ADCC aktivitāti PBMC. CHO DG44-hCTLA4 šūnas (no Chugai Pharmaceutical) tika iesētas uz 96-iedobes apaļdibena plāksnēm (1 × 104 šūnas katrā iedobē) un inkubētas ar dažādu koncentrāciju mAb 15 minūtes. Pēc tam no veseliem donoriem iegūtie PBMC tika pievienoti kultūrai ar efektora un mērķa (E∕T) attiecību 50:1. Šūnas tika inkubētas 37 grādu temperatūrā 5% CO2 6 vai 24 stundas, no katras iedobes tika savākti 100 μL supernatanta un tika mērīta 492 nm un 630 nm absorbcija, izmantojot Cytation 5 šūnu attēlveidošanas daudzrežīmu lasītāju (BioTek Instruments). Tika uzskatīts, ka LDH izdalīšanās ir maksimālā pēc šūnu inkubācijas 1% Nonidet P-40 šķīdumā. Citotoksicitāte (procentos) tika noteikta pēc formulas; (AC)∕(BC) × 100, kur A, B un C attiecīgi apzīmē katra eksperimenta LDH izdalīšanos, maksimālo LDH izdalīšanos un fona LDH izdalīšanos. Visi eksperimenti tika veikti divos eksemplāros.

ADCC tests ar svaigi izolētu cilvēka PBMC.

Veselu donoru PBMC tika sašķiroti FACS katrai T frakcijai, un Treg šūnas tika iepriekš marķētas ar CellTrace Violet (CTV; ThermoFisher) un kultivētas ar šūnām, kas nav T, kā efektoršūnas ar mērķa un efektora attiecību 1:50. Pēc tam 10 % cilvēka AB serumam, kas satur RPMI1640 barotni ar 5 SV/mL IL{10}}, tika pievienots 1 ug/ml norādītā anti-CTLA-4 mAb. Pēc 24-h kultivēšanas 37 grādos FACS novērtēja mirušo šūnu biežumu, kas norādīts ar LIVE/DEAD fiksējamu krāsošanu (ThermoFisher), starp KTV plus šūnām.

Peļu audzēju eksperimenti.

Sešus līdz 7- nedēļas vecas BALB/c peles tika iegādātas no CLEA Japan un tika uzturētas īpašos apstākļos, kas brīvi no patogēniem. Peles tika pakļautas subkutānai iedarbībai ar 2 × 106 CMS5a-NY-ESO-1. Deviņas dienas pēc audzēja implantācijas peles intravenozi saņēma 100 ug anti-peles-CTLA4 mAb (UC-10 klons; mIgG2a, mEnhanced vai mSilent, no Chugai Pharmaceutical). Uzlabotais variants (mFa55 mIgG2a variants) tika ģenerēts ar S239D mutāciju CH2 domēnā, un tam ir uzlabota saistīšanās afinitāte ar peles Fc RIV aptuveni septiņas reizes, salīdzinot ar savvaļas tipa mIgG2a. Peles tika vakcinētas ar 100 ug ESO-181–88 peptīdu (Operon Biotechnology), kas sajaukti ar 200 μL CFA/PBS (attiecībā 1:1), vai nu tajā pašā dienā (9. diena, vienlaicīga ārstēšana) vai 3. d vēlāk (12. diena, Ab pirmapstrāde) subkutāni. Audzēja lielums tika mērīts ik pēc 3–4 dienām. Eksperimentus apstiprināja Institucionālā pārskata padome, un tie tika veikti saskaņā ar Osakas universitātes noteikumiem.

Plūsmas citometrija.

Kā aprakstīts iepriekš (12, 23), in vitro radītās antigēnam specifiskās CD8 plus T šūnas tika iekrāsotas ar PE iezīmētu Melan-A, CMV vai Flu tetramēru (TC Matrix) vai ar PE iezīmētu NY-ESO-1 tetramēru (MBL) 10 minūtes 37 grādu temperatūrā un pēc tam iekrāso ar dažādiem virsmas mAb. Virsmas CTLA-4 krāsošanai šajā pētījumā tika izmantota biotinilēta anti-cilvēka CD152 antiviela (klons BNI3; BD Biosciences) 4 grādu temperatūrā 15 minūtes kopā ar citām antivielām pret virsmas molekulām. Pēc mazgāšanas mēs pievienojām APC-streptavidīnu (Biolegend) arī 4 grādos 15 minūtes, lai izvairītos no CTLA-4 molekulu iekrāsošanās, kas iziet uz virsmas pēc ilgstošas ​​krāsošanas 37 grādos. Šīs krāsošanas procedūras tika veiktas pirms fiksācijas un permeabilizācijas, kā aprakstīts mūsu iepriekšējā pētījumā (24).

FOXP3 intracelulārā krāsošana tika veikta, izmantojot FOXP3 transkripcijas faktora krāsošanas bufera komplektu (eBioscience). Cilvēka šūnu krāsošanai tika izmantotas šādas antivielas ar norādītām fluorescējošām iezīmēm: PerCP/Cy5.5-CCR7 (150503; BD Biosciences), FITC-CD45RA (HI100; BD Biosciences), biotīns–CTLA-4 (BNI3). ; BD Biosciences), APC-Streptavidin (BioLegend), V500-CD8 (RPA-T8; BD Biosciences), BrilliantViolet711-CD3 (OKT3; Biolegned), AlexaFluor700-CD4 (RPA) -T4; eBioscience), FITC-Lineage maisījums (BD Biosciences), PerCP/Cy5.{25}}CD11c (3.9; BioLegend), APC-HLA-DR (LN3; eBioscience), PE-CD86 (IT2.2; eBioscience), AlexaFluor700-CD80 (L307.4; BD Biosciences), PE-FOXP3 (236A/E7; eBioscience) un fiksējama dzīvotspējas krāsviela eFluor780 (eBioscience). Peļu šūnu iekrāsošanai tika izmantotas šādas antivielas: V500-CD8 (53-6.7; BD Biosciences), PE-Cy7-CD3e (145-2C11; eBioscience), eFluor 450-CD4 (RM4-5; eBioscience), APC-CD25 (PC61.5; eBioscience), PE-FOXP3 (FJK-16s; eBioscience), FITC–IFN- (XMG1. 2; BD Biosciences), AlexaFluor647-IL-2 (JES6-5H4; eBiosciences) un fiksējama dzīvotspējas krāsviela eFluor780 (eBioscience). Antigēnam specifiskās TIL CD8 plus T šūnas no pelēm tika iekrāsotas ar PE iezīmētiem, H-2Dd ierobežotiem ESO-181-88 tetramēriem (TC Matrix), kā aprakstīts iepriekš. Lai izmērītu citokīnu veidošanos no CD8 plus T šūnām, peles TIL tika atkārtoti stimulētas 5 stundas 37 grādu temperatūrā 10 μM to pašu ESO-181-88 peptīdu klātbūtnē, ko izmantoja vakcinācijai ar GolgiPlug (BD Bioscience). Fiksācija un permeabilizācija tika veikta ar Cytofix / Cytoperm bufera komplektu (BD Bioscience). Šūnas tika iegūtas ar LSR Fortessa (BD Bioscience) un analizētas, izmantojot FlowJo v9.9.5 programmatūru.

Statistiskā analīze

Lai novērtētu nozīmīgumu starp abām grupām, tika izmantots divpusēju pāru t-tests. Vairāku grupu salīdzināšanai tika izmantota vienvirziena vai divvirzienu ANOVA ar post hoc Tukey godīgo nozīmīgu atšķirību (HSD) testu. Visas statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot Prism v6 programmatūru (GraphPad). P vērtības < 0,05 tika uzskatītas par nozīmīgām.

PATEICĪBA.

Mēs pateicamies Osakas Universitātes Medicīnas augstskolas Dermatoloģijas nodaļas locekļiem par pacientu paraugu savākšanu; un K. Teshima, T. Shimizu un N. Mizoguchi par tehnisko palīdzību. Inženierizētas pret cilvēka un peles CTLA-4 antivielas ģenerēja un nodrošināja Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Šo pētījumu atbalstīja Grant-in-Aid for Specially Promoted Research 16H06295 (SS), Grants-in-Aid. Zinātniskajai izpētei (A) 26253030 (uz SS) un (B) 26290054 (uz HN), Grantin-Aid izaicinošai izpētei 26670581 (uz HN) un Grant-inAid jaunajiem zinātniekiem (B) 26860331 un 23 (līdz 717). A. Tanaka) no Japānas Izglītības, kultūras, sporta, zinātnes un tehnoloģiju ministrijas; un Japānas Zinātnes un tehnoloģiju aģentūras (SS) sniegtie pamatpētījumi evolūcijas zinātnei un tehnoloģijai. Šis pētījums daļēji tika veikts kā Japānas projekta novatorisku vēža terapijas pētījumu izstrādei (P-DIRECT) un praktisko pētījumu inovatīvai vēža kontrolei un vēža izpētes un terapeitiskās evolūcijas projektam (P-CREATE). Medicīnas pētniecības un attīstības aģentūra.

1. Sakaguchi S (2004) Dabiski radušās CD4 plus regulējošās T šūnas imunoloģiskai paštolerancei un imūno reakciju negatīvai kontrolei. Annu Rev Immunol 22:531–562.

2. Zou W (2006) Regulējošās T šūnas, audzēja imunitāte un imūnterapija. Nat Rev Immunol 6:295–307.

3. Tanaka A, Sakaguchi S (2017) Regulējošās T šūnas vēža imūnterapijā. Cell Res 27: 109–118.

4. Quezada SA, Peggs KS, Curran MA, Allison JP (2006) CTLA4 blokāde un GM-CSF kombinētā imūnterapija maina efektoru un regulējošo T šūnu intratumor līdzsvaru. J Clin Invest 116:1935–1945.

5. Shimizu J, Yamazaki S, Sakaguchi S (1999) Audzēja imunitātes indukcija, noņemot CD25 plus CD4 plus T šūnas: kopīgs pamats starp audzēja imunitāti un autoimunitāti. J Immunol 163:5211–5218.

6. Vilks AM, u.c. (2003) regulējošo T šūnu palielināšanās vēža slimnieku perifērajās asinīs. Clin Cancer Res 9:606–612.

7. Curiel TJ, et al. (2004) Īpaša regulējošo T šūnu piesaiste olnīcu karcinomas gadījumā veicina imūnās privilēģijas un paredz samazinātu izdzīvošanu. Nat Med 10:942–949.

8. Petersen RP, et al. (2006) Audzēju infiltrējošas Foxp3 plus regulējošās T-šūnas ir saistītas ar recidīvu I stadijas NSCLC pacientiem. Cancer 107:2866–2872.

9. Shang B, Liu Y, Jiang SJ, Liu Y (2015) Audzēju infiltrējošo FoxP3 plus regulējošo T šūnu prognostiskā vērtība vēža gadījumā: sistemātisks pārskats un metaanalīze. Sci Rep 5:15179.

10. Miyara M, et al. (2009) Cilvēka CD4 un T šūnu, kas izsaka FoxP3 transkripcijas faktoru, funkcionālā noteikšana un diferenciācijas dinamika. Imunitāte 30:899–911.

11. Wing JB, et al. (2017) Atsevišķa CD25-T-folikulu regulējošo šūnu apakšpopulācija lokalizējas dīgļu centros. Proc Natl Acad Sci USA 114:E6400–E6409.

12. Saito T, et al. (2016) Divas FOXP3 (plus) CD4 (plus) T šūnu apakšpopulācijas skaidri kontrolē kolorektālā vēža prognozi. Nat Med 22:679–684.

13. Sugiyama D, et al. (2013) Anti-CCR4 mAb selektīvi noārda efektora tipa FoxP3 plus CD4 plus regulējošās T šūnas, izraisot pretvēža imūnās atbildes cilvēkiem. Proc Natl Acad Sci USA 110:17945–17950.

14. Shevach EM (2009) Mehānismi foxp3 plus T regulējošo šūnu mediētu apspiešanu. Imunitāte 30:636–645.

15. Wing K u.c. (2008) CTLA-4 kontrolē Foxp3 un regulējošo T šūnu funkciju. Zinātne 322:271–275.

16. Qureshi OS, et al. (2011) CD80 un CD transendocitoze86: CTLA-4 šūnu ārējās funkcijas molekulārais pamats. Zinātne 332:600–603.

17. Hodi FS, et al. (2010) Uzlabota dzīvildze ar ipilimumabu pacientiem ar metastātisku melanomu. N Engl J Med 363:711–723.

18. Robert C, et al. (2011) Ipilimumabs un dakarbazīns iepriekš neārstētas metastātiskas melanomas gadījumā. N Engl J Med 364:2517–2526.

19. Bulliard Y, et al. (2013) Fc receptoru aktivizēšana veicina imūnregulācijas receptoru mērķa antivielu pretvēža aktivitātes. J Exp Med 210:1685–1693.

20. Simpson TR, et al. (2013) No Fc atkarīga audzēju infiltrējošo regulējošo T šūnu samazināšanās nosaka anti-CTLA-4 terapijas efektivitāti pret melanomu. J Exp Med 210:1695–1710.

21. Selby MJ, et al. (2013) IgG2a izotipa anti-CTLA-4 antivielas pastiprina pretvēža aktivitāti, samazinot intratumorālo regulējošo T šūnu skaitu. Cancer Immunol Res 1: 32–42.

22. Nimmerjahn F, Ravetch JV (2008) Fcgamma receptori kā imūnās atbildes regulatori. Nat Rev Immunol 8:34–47.

23. Mimoto F, et al. (2013) Jauns asimetriski izstrādāts antivielu Fc variants ar augstāku Fc R saistīšanās afinitāti un specifiskumu salīdzinājumā ar fukozilētu Fc variantu. MAbs 5:229–236.

24. Maeda Y, et al. (2014) Pašreaktīvu CD8 plus T šūnu ar anerģisku fenotipu noteikšana veseliem indivīdiem. Zinātne 346:1536–1540.

25. Gnjatic S, et al. (2006) NY-ESO-1: Imunogēna audzēja antigēna apskats. Adv Cancer Res 95:1–30.

26. Arce Vargas F, et al.; Melanomas TRACERx konsorcijs; Nieru TRACERx konsorcijs; Plaušu TRACERx konsorcijs (2017) Fc optimizētais anti-CD25 noārda audzējos infiltrējošās regulējošās T šūnas un sinerģē ar PD-1 blokādi, lai izskaustu konstatētos audzējus. Imunitāte 46:577–586.

27. Arce Vargas F, et al.; TRACERx Melanoma; TRACERx Nieres; TRACERx Lung consortia (2018) Fc efektora funkcija veicina cilvēka anti-CTLA-4 antivielu aktivitāti. Cancer Cell 33:649–663.e4.

28. Bulliard Y, et al. (2014) OX40 iesaistīšanās samazina intratumorālos Tregus, aktivizējot Fc Rs, izraisot pretaudzēju efektivitāti. Immunol Cell Biol. 92:475–480.

29. Romano E, et al. (2015) Ipilimumaba atkarīgā šūnu mediētā regulējošo T šūnu citotoksicitāte ex vivo ar neklasiskiem monocītiem melanomas pacientiem. Proc Natl Acad Sci USA 112:6140–6145.

30. Walker LSK, Sansom DM (2011) CTLA4 jaunā loma kā T šūnu reakciju šūnu ārējam regulatoram. Nat Rev Immunol 11:852–863.

31. Linsley PS, et al. (1996) CTLA-4 intracelulāra tirdzniecība un fokusa lokalizācija TCR iesaistīšanās vietās. Imunitāte 4:535–543.

32. Egen JG, Allison JP (2002) Citotoksiskā T limfocītu antigēna-4 uzkrāšanās imunoloģiskajā sinapsē tiek regulēta ar TCR signāla stiprumu. Imunitāte 16:23–35.

33. Ko K, et al. (2005) Progresētu audzēju ārstēšana ar agonistisku anti-GITR mAb un tās ietekme uz audzēju infiltrējošām Foxp3 plus CD25 plus CD4 plus regulējošām T šūnām. J Exp Med 202: 885–891.

34. Prieto PA, et al. (2012) CTLA-4 blokāde ar ipilimumabu: ilgstoša novērošana 177 pacientiem ar metastātisku melanomu. Clin Cancer Res 18:2039–2047.

35. Mei HE, Leipold MD, Schulz AR, Chester C, Maecker HT (2015) Dzīvu cilvēka perifēro asiņu mononukleāro šūnu svītrkodēšana multipleksētai masas citometrijai. J Immunol 194:2022–2031.

Danbee Haa,b, Atsushi Tanaka, Tatsuya Kibayashia,c, Atsushi Tanemurad, Daisuke Sugiyamaa,1, James Badger Winga, Ee Lyn Lima, Karen Wei Weng Tenge, Dennis Adeegbea,2, Evan W. Newelle, Ichiro Hirawa Katayamad,hi 1,3 un Šimons Sakagučija, b,4.

Eksperimentālās imunoloģijas, Imunoloģijas Frontier Research Center, Osakas Universitāte, 565-0871 Osaka, Japāna; b Eksperimentālās imunoloģijas laboratorija, Reģenerācijas zinātnes un inženierzinātņu nodaļa, Pierobežas dzīvības un medicīnas zinātņu institūts, Kioto Universitāte, 606-8507 Kioto, Japāna; c Pētniecības nodaļa, Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., 247-8530 Kanagawa, Japāna; d Dermatoloģijas nodaļa, Medicīnas augstskola, Osakas Universitāte, 565-0871 Osaka, Japāna; un e Zinātnes, tehnoloģiju un pētniecības aģentūra, Singapūras imunoloģijas tīkls, 138632 Singapūra.

Autors Šimons Sakaguči, 2018. gada 23. novembris (nosūtīts pārskatīšanai 2018. gada 19. jūlijā; pārskatījuši Miyuki Azuma un Serhio A. Quezada).

For more information:1950477648nn@gmail.com