Echinacoside Retards Cilvēka fibroblastisko šūnu šūnu senescence MRC-5

Kontakti: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 e-pasts:audrey.hu@wecistanche.com

Cistanche aktīvā viela: Kā Echinacoside anti-novecošanās?

Hong Xie 1, Hui Zhu1,2, Cong Cheng1, Yu Liang1, Zhao Wang1

Šajā pētījumā tika pētīta Echinacoside, viena no feniletanoīdiem, kas izolēti no ķīniešu tradicionālo augu izcelsmes zāļu Cistanches salsa stublājiem, ietekme uz cilvēka embriju plaušu fibroblastiskām MRC-5 šūnām. Šūnu proliferācijas aktivitāte tika novērtēta, lietojot Alamar Blue, parādot, ka ārstēšana ar ehinacīdu var aizkavēt sensibilitāti. Plūsmas citometrijas rezultāti liecina, ka Echinacoside var izraisīt šūnas G1 fāzē, lai iekļūtu S fāzē un G2 fāzē, un varētu uzlabot ROS noārdīšanos. Komētas testa rezultāti liecina, ka ehinancīds varētu aizsargāt šūnas no DNS bojājumiem, daļēji izskaidrojot tā iedarbības mehānismu. Visi iepriekš minētie rezultāti liecina, ka Echinacoside ir iespējama anti-senescences aktivitāte.

Cistanche deserticola ir daudz efektu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

1. Ievads

In vitro kultivētās normālās šūnas vairojas ierobežotam skaitam populācijas dubultošanās ("Hayflflick robeža") un nonāk replikatīvas senescences stadijā. Senescentās šūnas tiek pakļautas šūnu augšanas apstāšanās brīdim G1 fāzē un morfoloģijas un vielmaiņas izmaiņām, ieskaitot šūnu palielināšanos, palielinātu lizosomu bioģenēzi un augstākas -galaktozidāzes aktivitātes ekspresiju pie pH 6 (senescences saistīta -galaktozidāze, SA- - -Gal) (Hayflflick and Moorhead 1961; Dimri 1995). Senescentu šūnu uzkrāšanās prognozē ar vecumu saistīto samazināšanosAudu/orgānsFunkcijas. Lai piekļūtu novecošanas aizkavēšanas vai apvēršanas veidam, centieni atklāt aktīvās pretnovecošanās vielas nekad nav beigušies.Echinacosideir viens no feniletanoīdiem, kas izolēti noCistanches salsa, Ķīnas tradicionālās augu izcelsmes zāles, kurām ir potenciālas bioloģiskas aktivitātes gan kā imūnserums, ganantifatigueaģents (Deng et al. 2004; Xiong et al. 1996). Ir arī ziņots, ka tas uzvedas in vitro kā spēcīgsbrīvsRadikālasAttīrītāju(Facino et al. 1995) un eksponātineiroprotektīvsDarbībasin vitro un in vivo (Koo et al. 2005; Geng et al. 2007). Echinacoside var būt pretnovecošanās vielas kandidāts, un pretnovecošanās aktivitāte varētu būt viena no tā bioloģiskajām īpašībām. Tādējādi mēs ārstējām senescentu cilvēka embriju plaušu fibroblastisko šūnu līniju MRC-5 ar Echinacoside, cerot, ka tas varētu aizkavēt vai mainīt sensescenci.

2. Izmeklēšana un rezultāti

Pirmkārt, mēs pievienojām ehinacīdu kultūras vidē, lai pārbaudītu tā ietekmi uz šūnu augšanu un šūnu cikliem. Tika novērots, ka šūnu dzīvotspēja ar 48 h ekspozīciju echinacoside palielinājās acīmredzami attiecībā pret kontroli, jo koncentrācija palielinājās (1. att. A), kas norāda, ka ehinokosīds palīdzēja senescentām šūnām vairoties. SA- Gal krāsošanas rezultāts parādīja, ka SA- -Gal līmenis acīmredzami samazinājās pēc Echinacoside ārstēšanas (dati nav parādīti), kas liecina, ka daļa senescentu šūnu tika mainītas no senescences. Lai apstiprinātu, vai senescentās šūnas patiešām tika virzītas, lai vairotos ar ehinacīdu, tika ieviesta cita citometrija, lai pārbaudītu senescento MRC-5 šūnu šūnu cikla fāzes izmaiņas pēc ārstēšanas ar ehinacīdu. Mūsu pētījumā mēs novērojām, ka, palielinoties Echinacoside koncentrācijai, šūnu attiecība G1 periodā tika pakāpeniski samazināta. Gluži pretēji, vairāk šūnu tika virzītas, lai iekļūtu S fāzē un G2 fāzē (1. att. B). Ar senesenci saistītu heterohromatīna fokusu (SAHF) uzkrāšanās ir vēl viens specifisks senescentu šūnu biomarķieris (Shay and Wright 2001). Senescentām šūnām bija pieturzīmes DNS fokusi, kurus vizualizēja Hoechst krāsošana (1.C attēls). Turpretī MRC-5 šūnām, kas ārstētas ar ehinacīdu, šķita, ka tām ir mazāk SAHF.

Reaktīvo skābekļa sugu (ROS) līmenis palielinās, kad šūnas tuvojas Hayflflick robežai (Hutter et al. 2002). Nepārtraukta šūnu apstrāde ar subletālu ROS līmeni ne tikai palielina oksidatīvo bojājumu produktu, piemēram, lipofuscīna, līmeni (Sitte et al. 2001), bet arī izraisa pastāvīgu augšanas apstāšanos, ko papildina p53 augšanas inhibējošā ceļa aktivācija (Toussaint et al. 2000). Tāpēc šūnu līmenī ROS ir galvenā loma senescences izraisīšanā. FL fluorescējošā krāsviela DCFH-DA tika izmantota, lai izmērītu ROS saturu ar kolēģiem citometrijas veidiem. Tika pierādīts, ka, salīdzinot ar kontroli, ROS saturs acīmredzami samazinājās šūnās, kas inkubētas ar ehinacīdu (2. att. A). Šie rezultāti liecina, kaEhinokosīdsvar darboties kā antioksidants, samazinot ROS ražošanu vai paātrinot ROS noņemšanu.

Uzkrātās reaktīvās skābekļa sugas (ROS) izraisa ievērojamu makromolekulu traucējumu šūnās, tostarp olbaltumvielās, DNS un telomēros (Kovtun et al. 2007). Oksidatīvie DNS bojājumi izraisa no p53 atkarīgu G1 augšanas apstāšanos pēc p21Waf-1/SDI-1/Cip1 (Chen et al. 1998) ekspresijas un šūnu senescences normāliem cilvēkiem fibroblastiem. Mēs izmantojām komētas testu, lai izmērītu DNS bojājumus un to labošanu. DNS fragmentu lielums un pārtraukumu skaits nosaka redzētās komētas migrāciju un modeli. Astes DNS saturs (astes garuma un astes DNS satura produkts) palielinās līdz ar bojājumiem. Mūsu rezultāti liecina, ka pirmapstrāde ar ehinacīdu var daļēji veicināt DNS bojājumu atjaunošanos, vismaz aizsargāt šūnas no H2O2 izraisītiem DNS bojājumiem (2.B attēls). Pamatojoties uz šiem faktiem, mēs secinām, ka Echinacoside ir anti-senescences aktivitāte vismaz MRC-5 šūnās. Mūsu pētījuma rezultāti liecina, ka Echinacoside var samazināt ROS uzkrāšanos, aizsargāt šūnas no DNS bojājumiem, veicināt MRC-5 šūnas no G1 fāzes uz S un G2 fāzēm un tādējādi uzlabot šūnu proliferāciju. Vispārīgi runājot, echinacozīda ietekmi uz MRC-5 šūnām varētu iedalīt divos aspektos: veicināt šūnu proliferāciju un samazināt ROS uzkrāšanos. Lai gan precīzs šūnu senescences mehānisms joprojām nav zināms un šūnu cikla regulēšanas tīkls joprojām ir pretrunīgs, mēs esam pierādījuši, ka Echinacoside var aizsargāt šūnas no oksidatīviem bojājumiem. Tāpēc mēs spekulējam, kaEhinokosīdsvarētu būt labs kandidāts senescences regulēšanai, lai gan precīzs pamatā esošais mehānisms joprojām ir atklāts jautājums un notiek turpmāki pētījumi.

3. Eksperimentāls

3.1. Šūnu kultivēšana un apstrāde

Cilvēka embrija plaušu fibroblastisko šūnu līnija MRC-5 (Bioķīmijas un šūnu bioloģijas institūts, SIBS, CAS) tika uzturēta modificētā minimālā būtiskā barotnē (Gibco/BRL) un papildināta ar 10% augļa liellopu serumu. MRC-5 šūnām tiek veikta replikatīva senescence pēc vairākām šūnu ejām, ko novērtē pēc metabolisma palēnināšanās un dalīšanās pārtraukšanas 7 dienu laikā. Visas kultūras tika sētas ar šūnu blīvumu 104/cm2, ja vien nav norādīts citādi, un tām bija atļauts netraucēti vairoties 7 dienas. Dažādas echinacozīda koncentrācijas tika pievienotas 48 stundas pirms pārbaudes ar šķīdinātāju kā kontroli, ja vien nav norādīts citādi. DMSO koncentrācija kultūrās bija mazāka par 0,3% (v/v). H2O2 terapijai šūnas tika inducētas ar 250M H2O2 12 stundas.

3.2. Izdzīvošanas koeficienta noteikšana

Šūnas tika kultivētas un apstrādātas ar ehinacīdu uz 96 aku plāksnēm. Pirms atklāšanas barotnei tika pievienots 10% Alamar BlueTM un inkubēts 4 stundas. Absorbciju mērīja ar spektrofotometru.

3.3. Plūsmas citometrijas analīze

Plūsmas citometrija tika ieviesta, lai izmērītu DNS saturu un intracelulāro ROS līmeni, attiecīgi izmantojot propīdija jodīdu un DCFH-DA. Šūnas tika pārklātas ar blīvumu 105cells/10 ml šūnu šķīduma 100 mm diametra traukos un papildinātas ar ehinacīdu 48 stundas pēc šūnu sēšanas. Pēc 48 stundu apstrādes šūnas pēc centrifugēšanas tika novāktas un mazgātas PBS, pēc tam atkārtoti suspendētas PBS šķīdumā ar 0,1% RNase un 50 g/ml propīdija jodīdu vai barotni, kas satur 10 M DCFH-DA 30 min. DNS vai ROS saturu noteica ar FL fluorescenci aktivētu šūnu šķirošanu uz Beckman Coulter Flow citometrijas sistēmas. Datus analizēja MultiCycle programmatūra.

3.4. Hoechst krāsošana

Šūnas tika kultivētas un apstrādātas ar ehinacīdu 48 stundas uz 96 akas plāksnes. Barotne tika noņemta, šūnas tika mazgātas ar PBS, pēc tam 20 minūtes fiksētas ar 4% formaldehīdu PBS, pēc tam vienu reizi mazgājot ar PBS un 10 minūtes iekrāsojot ar Hoechst krāsu. Attēli tika uzņemti.

3.5. Vienšūnas gēla elektroforēze (komētas pārbaude)

Komētas pārbaude tika veikta, kā ziņots (Olive and Banath 2006). Atsevišķi komētu attēli tika analizēti, izmantojot CometScore programmatūru. Atzinība: Šo darbu finansiāli atbalstīja Ķīnas Nacionālā fundamentālo pētījumu programma (973 projekts) (Nr. 2007CB507406), Ķīnas Nacionālais dabaszinātņu fonds (Nr. 30572341) un Tsinghua-Yue-Yuen medicīnas zinātņu fonds (THYY20070008).