Cistanche Tubulosa ekstraktu ietekme uz tēviņu reproduktīvo funkciju streptozotocīna-nikotīnamīda izraisītām diabēta žurkām -Ⅱ

3.2. In vivo analīze

3.2.1. CTE ietekme uz ķermeņa svaru un kaloriju patēriņu

Pēc 6 nedēļu eksperimentiem diabēta grupai (HFD-DM) bija lielāks ķermeņa svars nekā kontroles grupai. HFD-DME4 grupai bija mazāks ķermeņa svars nekā HFD-DM un HFD-DMER grupām (7.a attēls). Kontroles grupas kaloriju patēriņš bija ievērojami mazāks nekā pārējās grupās. Nebija būtisku atšķirību starp pārējo piecu grupu kaloriju patēriņu (7.b attēls).

3.2.2. Perorālais glikozes tolerances tests (OGTT), lai noteiktu veiksmīgu diabēta ierosināšanu

Perorālais glikozes tolerances tests (OGTT) tiek izmantots kā daudzsološs līdzeklis cukura diabēta noteikšanai. Paaugstināts glikozes līmenis asinīs norāda uz diabēta stāvokli. Kā parādīts 8.a attēlā, glikozes līmenis plazmā CTE grupās bija zemāks nekā DM grupā pēc 0, 30, 90 un 120 minūtēm. Turklāt plazmas glikozes koncentrācijas laukums zem līknes (AUC) parādīja, ka CTE un RSG grupās glikozes uzņemšanas ātrums asinīs palielinājās (8.b attēls).

3.2.3. Kopējais plazmas glikozes, holesterīna un triglicerīdu saturs

Glikozes līmenis plazmā tukšā dūšā bija augstāks DM grupā un zemāks DME2 grupā (izņemot kontroli) nekā citās. Nebija būtiskas atšķirības kopējā holesterīna līmenī starp grupām, izņemot DME4 grupu. DME4 grupā holesterīna līmenis bija zemāks nekā pārējās. Triglicerīdu līmenis bija augstāks DM grupā un zemāks DME4 grupā, un triglicerīdu saturs tika samazināts, palielinoties CTE koncentrācijai (2. tabula). Rezultāti liecina, ka glikozes, holesterīna un triglicerīdu līmenis plazmā bija augstāks DM grupā un līmenis bija ievērojami pazemināts, ārstējot ar CTE.

3.2.4. Plazmas insulīna līmenis, plazmas leptīna līmenis un homeostāzes modeļa novērtējums – insulīna rezistences (HOMA-IR) vērtības

Plazmas insulīna, leptīna un HOMA-IR vērtības ir parādītas 3. tabulā. DM grupai bija augstāks plazmas insulīna un plazmas leptīna līmenis nekā kontroles grupai. HOMA-IR indekss arī bija ievērojami augstāks DM grupā. Plazmas insulīna, leptīna un HOMA-IR vērtības tika samazinātas, palielinoties CTE koncentrācijai. Plazmas leptīns bija ievērojami samazināts CTE grupās, bet RSG zāļu grupa (DMR) neuzrādīja būtisku atšķirību no DM grupas.

3.2.5. CTE ietekme uz LH un testosterona līmeni plazmā diabēta žurkām

Kā parādīts 4. tabulā, testosterona koncentrācija diabēta žurkām (DM) bija ievērojami samazināta,testosterona koncentrācija ievērojami palielinājāsdažādās CTE devās. Turklāt rezultāti uzrādīja nelielu LH līmeņa pazemināšanos DM grupā, salīdzinot ar DMR, DME1, DME2 un DME4. LH produkcija bija augstāka DME4 grupā.

3.2.6. CTE ietekme uz diabēta žurku spermas parametriem

Eksperimentālie rezultāti parādīja, ka DM grupā bija ievērojams spermatozoīdu skaita un kustīguma samazinājums nekā kontroles grupā, turpretim spermatozoīdu anomāliju līmenis bija ievērojami palielināts DM grupā. Interesanti, ka spermatozoīdu skaits, spermatozoīdu kustīgums un spermatozoīdu anomāliju līmenis DMR grupā uzlabojās, bet spermatozoīdu kustīgums nesasniedz nozīmīgu līmeni, salīdzinot ar DME4. DME2 uzrādīja labāku spermatozoīdu skaitu nekā visiem tiem, un DME4 grupā ievērojami palielinājās kustīgums. Nebija būtiskas atšķirības starp patoloģisku spermatozoīdu skaitu grupās, kas ārstētas ar RSG un CTE (5. tabula).

3.2.7. CTE ietekme uz sēklu kanāliņu morfoloģiju diabēta žurkām

9. attēlā parādīts sēklinieku sekcijas H&E krāsojums. Melnā bultiņa apzīmē Leydig šūnu, bet baltā bultiņa apzīmē Sertoli šūnu. Gan Leidiga šūnai, gan Sertoli šūnai DM grupā bija ievērojama atrofija, un lūmenā tika novērots dobums. Ar CTE un RSG ārstētajās grupās tika atjaunota Leidiga šūnu un Sertoli struktūra. Sēklu kanāliņu biezums bija lielāks CTE un RSG grupās nekā DM grupā.

3.2.8. CTE ietekme uz KiSS1, GPR54, SOCS-3 un SIRT1 MRNS diabēta žurku hipotalāmā

KiSS1 (10.a attēls), GPR54 (10.b attēls), SOCS-3 (10.d attēls) un SIRT1 (10.c attēls) ekspresija parādīta 10. attēlā. KiSS1 un receptora GPR54 mRNS ekspresija diabēta žurkām bija ievērojami zemāks nekā kontroles grupā. KiSS1 un GPR 54 mRNS ekspresijas līmeņi DMR, DME1, DME2 un DME4 tika ievērojami palielināti. Jo īpaši GPR54 mRNS ekspresija tika ievērojami palielināta DME4 un bija gandrīz līdzīga kontroles grupai.

NATURAL CISTANHE TUBULOSA TESTOSTERONA RAŽOŠANAS AIZSARGĀŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Šajā eksperimentā tālāk tika pētīts SOCS-3 un SIRT1 mRNS daudzums žurku hipotalāmā. SOCS-3 mRNS ekspresija diabēta žurkām bija ievērojami palielināta, norādot, ka leptīna pretestība bija nopietnāka. DMR, DME1, DME2 un DME4 grupām bija ievērojami uzlabojumi, salīdzinot ar diabēta grupu. SIRT1 mRNS ekspresija DM grupā tika ievērojami samazināta un ievērojami palielinājās DME1 un DME4 grupās.

3.2.9. CTE ietekme uz antioksidantu enzīmiem diabēta žurku plazmā un sēkliniekos

6. tabulā parādīts, ka diabēta žurkām plazmas SOD aktivitāte, GPx aktivitāte un katalāzes aktivitāte tika ievērojami samazināta un aktivitātes palielinājās grupās, kas ārstētas ar CTE un RSG. Papildus tam DME4 uzrādīja ievērojamus GPx aktivitātes uzlabojumus nekā citi. Rezultāti parādīja, ka SOD un katalāzes aktivitātes diabēta žurkām pēc sešām nedēļām tika ievērojami samazinātas. DMR grupas SOD un katalāzes aktivitāte nesasniedz nozīmīgu līmeni. Ar CTE ārstētajām grupām bija ievērojami uzlabojumi SOD un katalāzes aktivitātē. Palielināta katalāzes un SOD aktivitāte CTE grupās tika novērota arī sēkliniekos (7. tabula). Visaugstākā SOD un katalāzes aktivitāte tika novērota attiecīgi DME1 grupā un DME2 grupā.

3.2.10. CTE ietekme uz oksidatīvo stresu un cukura diabēta žurku plazmas un sēklinieku iekaisumu

Slāpekļa oksīda (NO) ražošana plazmā (11.a attēls) un sēkliniekos (11.b attēls) ir parādīta 11. attēlā. NO ražošana DM grupā bija ievērojami palielināta gan sēkliniekos, gan plazmā, salīdzinot ar kontroles grupu. DME1, DME2 un DME4 grupās (plazmā) tika novērota pakāpeniska NO ražošanas samazināšanās. DMR grupa arī uzrādīja ievērojamu NO ražošanas samazināšanos. Sēklinieku gadījumā CTE grupās tika novērots neliels NO ražošanas samazinājums, savukārt DMR grupa būtiski nesamazināja NO veidošanos.

Kā parādīts 12. un 13. attēlā, TNF- un IL-6 līmenis diabēta žurkām bija ievērojami paaugstināts (gan plazmā, gan sēkliniekos), norādot, ka iekaisums ir nopietnāks. Plazmā TNF- līmenis ir līdzīgs ar CTE un RSG ārstētajām grupām (12.a attēls). CTE grupas ievērojami (īpaši DME2) samazināja TNF- līmeni sēkliniekos (12.b attēls). IL-6 līmenis CTE un RSG grupu plazmā bija ievērojami samazināts (13.a attēls). Sēkliniekos bija tendence samazināties IL-6 līmenim, taču tas nesasniedza nozīmīgu līmeni (13.b attēls).

3.2.1.1. CTE ietekme uz oksidatīvo stresu un iekaisumu diabēta žurku spermatozoīdos, ko izraisa augsta tauku satura diēta

14. attēlā parādīts superoksīda anjonu saturs žurku spermā. Rezultāti parādīja, ka superoksīda anjonu ražošana cukura diabēta žurku spermā ievērojami palielinājās, un DMR grupā netika novēroti būtiski uzlabojumi. DME1 un DME4 grupas uzrādīja ievērojami samazinātu superoksīda anjonu veidošanos.

3.2.12. CTE ietekme uz lipīdu peroksidāciju diabēta žurku spermatozoīdos, ko izraisa augsta tauku satura diēta

Pētījumi liecina, ka lipīdu peroksidācija ir palielināta gan 1., gan 2. tipa diabēta pacientiem [19]. Malondialdehīda (MDA) līmenis plazmā, spermā un sēkliniekos ir parādīts 8. tabulā. DM grupas MDA līmenis plazmā, sēkliniekos un spermā bija ievērojami augstāks, un ārstēšana ar CTE un RSG samazināja MDA veidošanos. Ievērojams samazinājums tika novērots DME4 un DMEI grupās plazmā. Šis pētījums atklāja, ka diabēta žurkām ne tikai palielinājās lipīdu peroksidācijas pakāpe plazmā, bet arī palielinājās sēkliniekos un spermā. Ievērojams uzlabojums tika novērots, lietojot dažādas CTE devas.

4. Diskusija

Cukura diabēts ir hroniska slimība, kas saistīta ar augstu cukura līmeni asinīs. Nelīdzsvarotība starp antioksidantu un ROS līmeni novedīs pie stāvokļa, ko sauc par oksidatīvo stresu. Superoksīds, hidroksilradikālis, ūdeņraža peroksīds, slāpekļa oksīds un viengabala skābeklis ir daži no ROS piemēriem, kas oksidatīvā stresa ietekmē veicinās diabēta stāvokļus [20].Cistanche tubulosair tuksneša augs, kas satur aktīvās sastāvdaļas, piemēram,polisaharīdi, oligosaharīdi, feniletanoīdu glikozīdi (ehinakozīds, verbaskozīds), palmitīnskābe, linolskābe, iridoīdi, alditoli un lignāni. Šis augs spēj radīt pretiekaisuma, neiroprotektīvu, antibakteriālu, pretvīrusu, antioksidantu, pretaudzēju un imūnmodulējošu iedarbību [21]. Literatūras pētījumi liecina, ka feniletanoīdu glikozīdi no Cistanche tubulosa ir galvenais antioksidanta aktivitātes iemesls [22]. Resveratrols (RES) un rosiglitazons (RSG) tika uzskatīti par pozitīvo kontroli attiecīgi in vitro un in vivo pētījumos. RSG ir spēcīgs insulīna sensibilizators, un tam ir afinitāte pret peroksisomu proliferatora aktivētā receptora (PPARc) izoformu. Tas kontrolē hiperglikēmiju pacientiem ar cukura diabētu [23]. RES ir dabiska antioksidanta aktivitāte un darbojas kā vazodilatators, regulējot lipoproteīnu metabolismu, kavējot trombocītu agregāciju un novēršot vēzi [24,25]. Mūsu izmeklēšana norādīja, ka ECH uzrāda labāku radikāļu attīrīšanas aktivitāti nekā CTE un RES (1. attēls). Ir arī saprotams, ka ECH neizraisa būtisku toksicitāti LC-540 un TM3 Leidiga šūnām (2. attēls).

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA VĪRIEŠIEM SEKSUĀLĀ FUNKCIJA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

AGE tika izmantoti, lai Leydig šūnās izraisītu stresa apstākļus. AGE veidošanās, iekaisums, oksidatīvais stress un diabēts ir savstarpēji saistīti. Diabēta hiperglikēmiskais stāvoklis veicina šūnu bojājumus, veidojot AGE un oksidatīvo stresu. AGE izraisa šūnu toksicitāti, kas vēl vairāk veicina imūno šūnu piesaisti un šūnu nāvi. Paaugstināts AGE līmenis veicina divu veidu receptoru, ko sauc par RAGE un AGER1, ekspresiju [26]. Elektrona pilēšana un sekojoša pārnešana no mitohondriju elpošanas ķēdes uz molekulāro skābekli oksidatīvā stresa laikā izraisa superoksīda anjona veidošanos. Mūsu rezultāti liecina, ka AGE izraisītā superoksīda anjona ražošana kontroles grupā tika palielināta, un tika novēroti turpmāki uzlabojumi gan ar ECH, gan RES ārstēšanu. Saskaņā ar mūsu pētījumu tika saprasts, ka ECH un RES klātbūtnē tika samazināta AGE izraisītā superoksīda (3. attēls) un H2O2 (4. attēls) ražošana.

NF-κB ir pazīstams kā svarīgs ar diabētu saistītā iekaisuma mediators [27]. NF-κB ekspresija izraisa šūnu disfunkciju un šūnu nāvi. NF-κB aktivācija ar oksidatīvo stresu stimulē pro-iekaisuma reakciju, endotelīna regulēšanu un apoptozi [28]. RAGE un NF-κB ekspresija tika palielināta AGE stimulētajās grupās, un sekojošā samazināšanās tika novērota ar ECH un RES apstrādātajās šūnās (5. attēls).

Testosteronsir anaboliskais steroīds un primāraisvīriešu dzimuma hormonssintezēts no holesterīna. Process sākas ar holesterīna sānu ķēdes oksidatīvo šķelšanos ar holesterīna sānu ķēdes šķelšanās gēnu (CYP11A). Šis gēns ir lokalizēts mitohondriju membrānā un pārvērš holesterīnu pregnenolonā. Pēc tam CYP17A1 gēns no endoplazmatiskā tīkla noņem divus papildu oglekļa atomus un ražo vairākus C19 steroīdus. Papildus tam pregnenolons tiek oksidēts, veidojot androstenedionu/progesteronu ar hidroksisteroīdu dehidrogenāzes (3- -HSD) palīdzību. Visbeidzot, testosterons tiek ražots, reducējot keto grupu androstenediona 17. oglekļa pozīcijā ar 17-beta-hidroksisteroīdu dehidrogenāzi (17- -HSD). Leidiga šūnas ir iesaistītas galvenajā testosterona ražošanā. Holesterīna pārvietošanai iekšējā mitohondriju membrānā ir nepieciešama steroidogēna akūta regulējošā proteīna (StAR) darbība. Pašreizējie pētījumi liecina, ka StAR, CYP11A1, CYP17A1 un HSD17 3 ekspresija tika samazināta ar AGE apstrādātām šūnām (kontrole), un tika novērots milzīgs pieaugums ar ECH un RES apstrādātajās šūnās (6. attēls). . Tādējādi rezultāti liecina, ka ražošana notestosterona līmenis tika paaugstināts grupās, kas ārstētas ar ECH un RES. 

DABĪGA CISTANČE TUBULOZA DZIMUMSPĒKA UZLABOŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Diabētiskā stāvokļa laikā glikozes transportēšana uz orgāniem ir ierobežota, un rezultātā palielinās glikozes līmenis [29]. Tādējādi hiperglikēmiskais stāvoklis ir viens no svarīgiem marķieriem diabēta noteikšanai. Mūsu pētījumi liecina, ka cukura diabēta grupās glikozes līmenis plazmā bija paaugstināts un DM grupas AUC bija ievērojami augstāks nekā pārējās grupās (8. attēls). Līdz ar glikozes līmeni plazmā DM grupā ievērojami palielinājās kopējā holesterīna un triglicerīdu saturs (2. tabula). Aterosklerozi veicina paaugstināts holesterīna un triglicerīdu līmenis [30]. Tomēr holesterīna un triglicerīdu līmenis tika pazemināts grupās, kas ārstētas ar CTE un RSG. Triglicerīdu saturs DME4 grupā sasniedza gandrīz līdzīgas vērtības kā kontroles grupai.

Insulīns ir hormons, ko ražo aizkuņģa dziedzera šūnas un ir funkcionāls, lai kontrolētu cukura līmeni asinīs organismā, savukārt leptīns ir hormons, ko ražo adipocīti, kas spēj regulēt pārtikas uzņemšanu un enerģijas izmantošanu. Pētījumi liecina, ka leptīns ir iesaistīts aptaukošanās patofizioloģijā un ir pozitīva mijiedarbība starp leptīnu un insulīnu [31]. Mūsu pētījumi liecina, ka inulīna un leptīna līmenis plazmā bija augstāks DM grupā un insulīna līmenis pazeminājās, palielinoties CTE koncentrācijai. RSG grupa neuzrāda nekādas būtiskas atšķirības no DM grupas. Insulīna rezistence un šūnu funkcija tika novērtēta ar HOMA-IR metodi. HOMA-IR vērtība pieauga DM grupā un būtiski atšķīrās no citām grupām (3. tabula).

DM ietekmē reproduktīvo funkciju, izmantojot hormonālās izmaiņas HPG asī, un pētījumi atklāja, ka insulīna ekspresiju sēkliniekos ietekmē arī diabēts. To raksturo Sertoli šūnu vakuolizācija, palielināta DNS fragmentācija, traucēta spermatoģenēze un palielināta dzimumšūnu izsīkšana. Oksidatīvais stress arī veicina reproduktīvās funkcijas novirzes [32]. Spermas veidošanās procesu vīriešu reproduktīvajā orgānā (sēkliniekos) sauc par spermatoģenēzi. Sēklinieku veido cieši saritināti kanāliņi, ko sauc par sēklinieku kanāliņiem. Sertoli šūnas ir redzamas sēklu kanāliņu sieniņās un nodrošina nenobriedušu spermatozoīdu uzturu. Spermas parametru izpēte parādīja, ka DM grupā samazinājās spermatozoīdu skaits un kustīgums un palielinājās anomālijas (5. tabula). Ar CTE un RSG ārstētajās grupās tika novērots pretējs efekts. Gan Leidiga šūnām, gan Sertoli šūnām DM grupā bija ievērojama atrofija, un dobums bija redzams lūmenā. Sēklu kanāliņu biezums samazinājās arī DM grupā. Uzlabots rezultāts tika novērots grupās, kas ārstētas ar CTE un RSG (9. attēls). Papildus tam LH un testosterona līmenis pazeminājās DM grupā un līmenis palielinājās grupās, kas ārstētas ar CTE (4. tabula). Vīriešiem zems testosterona līmenis serumā un zemāks LH pulsa biežums bieži bija saistīts ar aptaukošanos un 2. tipa cukura diabētu [33].

KiSS1 gēna kodētie kisspeptīni ir pazīstami kā spēcīgs HPG ass stimulators, un jebkura kisspeptīna gēna mutācija novedīs pie zema dzimuma steroīdu un gonadotropīna līmeņa. Pētījumi liecina, ka STZ izraisītām diabēta žurkām Kiss1 mRNS līmenis bija pazemināts [33]. Zīdītāju neauglības ierosināšana un uzturēšana ir saistīta ar G-proteīnu saistītu receptoru 54 (GPR54). GPR 54 mutāciju raksturo seksuālās nobriešanas trūkums un zems gonadotropo hormonu (LH un FSH) līmenis. Iekaisuma citokīni, piemēram, IL-6 un TNF, regulē citokīnu signalizācijas 3 (SOCS3) supresora ekspresiju, kas saistīts ar iekaisuma izraisītu insulīna rezistenci aknās un adipocītos [34]. SIRT 1 ir gēns, kas saistīts ar vairāku novecošanas slimību regulēšanu. Šis gēns ir skaidri izteikts aizkuņģa dziedzera šūnās un regulē insulīna sekrēciju un novērš apoptozi. Pašreizējie pētījumi liecina, ka KiSS1, GPR54 un SIRT1 ekspresija samazinājās DM grupā, bet ekspresija palielinājās grupās, kas ārstētas ar CTE (10. attēls). SOCS -3 izteiksmju palielināšanās DM grupā norāda uz iekaisuma stāvokli. Pirmā molekulārā saikne, kas identificēta starp aptaukošanos un iekaisumu, bija TNF-. Tādējādi paaugstināts TNF līmenis ir iekaisuma indikators. Ar CTE ārstētajās grupās tika novērots samazināts pro-iekaisuma citokīnu līmenis, piemēram, TNF- un IL-6 (12. un 13. attēls).

Nelīdzsvarotība starp ROS un antioksidantiem izraisa diabēta stāvokli. Superoksīda dismutāze (SOD), katalāze (CAT) un glutationa peroksidāze (GPX) ir zināmi kā primārie antioksidanti, kas ir atbildīgi par optimālā ROS līmeņa uzturēšanu [35]. No rezultātiem tika konstatēts, ka antioksidantu aktivitāte bija ievērojami zemāka DM grupā. Ar CT apstrādātās grupas uzrādīja uzlabojumus antioksidantu ražošanā. Ar RSG ārstētā grupa neuzrādīja būtiskus uzlabojumus antioksidantu aktivitātē (6. un 7. tabula).

Slāpekļa oksīds (NO) ir pazīstams kā svarīgs ROS, kas veicina iekaisumu. Mūsu pētījumi norāda, ka NO līmenis bija pazemināts grupās, kas ārstētas ar CTE (11. attēls). Rezultāti parādīja, ka superoksīda anjonu saturs cukura diabēta žurku spermā ievērojami palielinājās un pēc RSG ievadīšanas nebija būtisku uzlabojumu. CTE grupās tika samazināta superoksīda ražošana.

MDA noteikšana ir ļoti noderīga lipīdu peroksidācijas novērtēšanai. Lipīdu peroksidācija ir lipīdu oksidēšanās process, kas galu galā izraisa šūnu bojājumus. MDA veidojas polinepiesātināto taukskābju lipīdu peroksidācijas rezultātā. Pētījumi liecina, ka MDA līmenis korelē ar vecumu un glikozes līmeni tukšā dūšā [36]. Pašreizējais pētījums norādīja, ka CTE uzlabo lipīdu peroksidāciju plazmā, sēkliniekos un spermā (8. tabula).

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA SEKSUĀLĀS FUNKCIJAS UZLABOŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

5. Secinājumi

Oksidatīvais stress diabēta apstākļos traucē vīriešu reproduktīvo sistēmu spermas un dzimumdziedzeru disfunkcijas dēļ. Cistanche tubulosa ir tuksneša augs, kas plaši atzīts ķīniešu medicīnā tā farmakoloģiskās iedarbības dēļ.ehinakozīds (ECH)ir galvenā CTE sastāvdaļa, kas ir atbildīga par tā antioksidantu un pretiekaisuma darbību. Mūsu in vitro rezultāti liecināja, ka ECH atjaunoja testosterona sintēzes ceļu un pazemināja NF-κB un RAGE proteīna ekspresijas līmeni. ECH efektīvi kavēja superoksīda anjonu un H2O2 veidošanos Leidigas šūnās. In vivo pētījumi atklāja, ka ECH samazināja holesterīna, triglicerīdu, TNF- un IL-6 līmeni. Papildus tam tika ievērojami uzlabotas mRNS ekspresijas diabēta žurku hipotalāmā. Jāatzīmē arī tas, ka ECH samazināja lipīdu peroksidāciju un uzlaboja insulīna rezistenci diabēta žurku tēviņiem. Antioksidantu aktivitātes palielinājās gan plazmā, gan sēkliniekos. Tāpēc mūsu pētījumi liecināja, ka ECH nodrošināja efektīvu aizsardzību pret reproduktīvo disfunkciju STZ izraisītām diabēta žurku tēviņiem.