Smadzeņu audu lejupejošās proteomikas uzlabošana ar FAIMS 1. daļa

Abstrakts

Alcheimera un Parkinsona slimības proteomiskie pētījumi ir snieguši vērtīgu ieskatu neirodeģeneratīvajos traucējumos. Līdz šim šie pētījumi lielā mērā ir aprobežoti ar pieeju no apakšas uz augšu, kavējot pakāpi, kādā var raksturot proteīna "neskarto" stāvokli.

Alcheimera slimība ir neirodeģeneratīva slimība, kas neatgriezeniski ietekmē cilvēka atmiņu un kognitīvās spējas. Lai gan cilvēki nevar pilnībā izārstēt šo slimību, ar rūpīgu ārstēšanu un profilaksi var pēc iespējas palēnināt slimības progresēšanu un saglabāt pacienta fizisko un garīgo veselību.

Atmiņa ir viens no acīmredzamākajiem aspektiem, ko ietekmē Alcheimera slimnieki. Viņi bieži var aizmirst svarīgu informāciju, piemēram, savu vārdu, mīļoto vārdus, svarīgus datumus utt. Turklāt var tikt aizmirsti daži uzlaboti pašmācības vārdu krājumi, piemēram, abstrakti jēdzieni un sinonīmi. Tomēr ar kādu kognitīvo apmācību un ārstēšanu Alcheimera slimnieki joprojām var saglabāt atmiņu dažos aspektos.

Lai gan Alcheimera slimība var radīt negatīvas sekas, mums uz to jāskatās pozitīvi. Pirmkārt, palielinot izpratni un izpratni par slimību, mēs varam labāk to novērst un ārstēt. Otrkārt, Alcheimera slimnieku aprūpētāji un ģimenes locekļi var arī iemācīties efektīvi sazināties un mijiedarboties ar viņiem, lai palīdzētu pacientiem saglabāt pašcieņu un dzīvot laimīgi, cik vien iespējams.

Kopumā, lai gan Alcheimera slimība var neatgriezeniski ietekmēt atmiņu un kognitīvās spējas, mums vajadzētu saglabāt optimistisku attieksmi un mēģināt palēnināt slimības progresēšanu, izmantojot ārstēšanu un profilakses pasākumus. Vienlaikus mums arī vairāk jāsniedz palīdzība un atbalsts tiem, kas aprūpē Alcheimera slimības pacientus, un kopīgi jāveido siltāka un interaktīvāka kopiena. Var redzēt, ka mums ir jāuzlabo atmiņa. Cistanche var ievērojami uzlabot atmiņu, jo tas ir tradicionāls ķīniešu ārstniecības materiāls ar daudziem unikāliem efektiem, no kuriem viens ir atmiņas uzlabošana. Cistanche iedarbība rodas no dažādām tajā esošajām aktīvajām sastāvdaļām, tostarp miecskābei, polisaharīdiem, flavonoīdu glikozīdiem utt. Šīs sastāvdaļas var veicināt smadzeņu veselību daudzos veidos.

Noklikšķiniet uz zināt 10 veidus, kā uzlabot atmiņu

No augšas uz leju proteomika (TDP) pārvar šo ierobežojumu; tomēr tas parasti aprobežojas ar tikai visbiežāk sastopamo salīdzinoši maza izmēra proteoformu novērošanu.

Tāpēc, lai samazinātu paraugu sarežģītību, parasti tiek izmantotas frakcionēšanas metodes. Šeit mēs pētām tegas fāzes frakcionēšanu, izmantojot augsta lauka asimetrisko viļņu formas jonu mobilitātes spektrometriju (FAIMS) TDP ietvaros.

Izmantojot augstas sarežģītības paraugu, kas iegūts no Alcheimera slimības (AD) smadzeņu audiem, mēs aprakstām, kā FAIMS pievienošana TDP var ievērojami uzlabot proteomu pārklājuma dziļumu.

Piemēram, FAIMS ieviešana ar ārējo kompensācijas spriegumu (CV), kas pakāpjas pie –50, –40 un –30 CV, varētu vairāk nekā divas reizes palielināt vidējo nelieko proteoformu, gēnu un proteomu sekvences pārklājumu, salīdzinot ar bezFAIMS.

Mēs arī atklājām, ka FAIMS var ietekmēt proteoformu un to lādiņu apvalku pārnešanu, pamatojoties uz to lielumu. Svarīgi, ka FAIMS ļāva identificēt neskartas amiloidbeta (A ) proteoformas, tostarp ar agregāciju pakļauto A 1–42 variantu, kas ir cieši saistīts ar AD.

Neapstrādāti dati un saistītie faili ir deponēti ProteomeXchange konsorcijā, izmantojot MassIVE datu repozitoriju ar datu kopas identifikatoru PXD023607.

IEVADS

Pēdējo 2 gadu desmitu laikā neirodeģeneratīvo slimību sastopamība ir vairāk nekā divkāršojusies visā pasaulē, un Alcheimera slimība (AD) ir visizplatītākā forma.1 Divas proteīnu sugas, beta amiloīda (A) peptīdi un fosforilēts ar mikrotubuliem saistītais proteīns tau(tau), 2–5 ir cieši saistīti ar AD.

Tāpēc detalizētam AD proteomeraksturam ir bijusi īpaša nozīme.6,7 Masspektrometrijai ir bijusi galvenā loma šajos pētījumos8, galvenokārt izmantojot augšupēju pieeju.9–16

Tomēr proteāzes sagremošana, kas nepieciešama augšupējām analīzēm, kavē proteīna pilnīga stāvokļa uztveršanu, kas var mainīties ģenētisko alēļu, alternatīvas savienošanas, proteolītiskās apstrādes un pēctranslācijas modifikāciju (sauktas par "proteoformām") dēļ.17– 20

Tā kā proteomiskās (TDP) pieejas no augšas uz leju analizē proteīnus neskartā stāvoklī, ar noteiktām patoloģijām saistītu proteoformu uztveršanas iespējamība ir lielāka un ļauj izveidot spēcīgāku, tiešāku saikni starp genotipu un fenotipu. 20–22

Piemēram, TDP ir īpaši piemērots, lai uztvertu endogēnus proteolītiskos fragmentus, kas iegūti no proteīniem, piemēram, tau, kas ir saistīti ar Alcheimera patoloģiju.23–26 Vairāki iepriekšējie TDP lietojumi ir izrādījuši lielu solījumu, atklājot reģionālo smadzeņu proteomu neviendabīgumu un neironu izmaiņas, reaģējot uz dažādiem stimuliem. .27–30

Tomēr sarežģītu paraugu TDP parasti prasa bezsaistes frakcionēšanas paņēmienus, lai samazinātu parauga sarežģītību, jo cilvēka proteomu izmērs un pārpilnība ir vairākas kārtas, un proteīni parasti nav labi izšķirti ar reversās fāzes augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju (LC).31

Šo bezsaistes frakcionēšanu var veikt, izmantojot ar želeju eluētu šķidrās frakcijas ieslodzījuma elektroforēzi, izmēru izslēgšanas hromatogrāfiju, jonu apmaiņas hromatogrāfiju vai afinitātes attīrīšanu. 22,32–35

Diemžēl bezsaistes frakcionēšana parasti samazina ražu un caurlaidspēju, jo ir nepieciešama ilgstoša parauga apstrāde.36 Gāzes fāzes jonu mobilitātes atdalīšana ir pievilcīga frakcionēšanas alternatīva, ko var ieviest starp LC un MSdimensions, neprasot papildu parauga apstrādes darbības.

Augsta lauka asimetriskā viļņu formas jonu mobilitātes spektrometrija (FAIMS) ir īpaši labi piemērota šim uzdevumam, jo ​​nesen tika ieviesta FAIMS Pro ierīce, kuras modulārā konstrukcija ļauj viegli iekļaut jonu mobilitāti vairākos strāvas Orbitrap instrumentos.

FAIMS, ko dēvē arī par diferenciālās mobilitātes spektrometriju, nesējgāzē atdala jonus, pamatojoties uz tādu faktoru kombinācijām kā izmērs, lādiņš vai forma, ieviešot asimetrisku viļņu formu ar augstu un zemu elektrisko lauku.38 Lai novērstu jonu sadursmi ar elektrodu, novirze jona ceļā tiek ieviesta, izmantojot līdzstrāvas kompensācijas spriegumu (CV),39 ļaujot selektīvi pārraidīt šo jonu.

FAIMS pielietojums neskartu olbaltumvielu analīzē lielākoties ir aprobežojies ar atsevišķu proteīnu konformeru atdalīšanu vai nelielu proteīnu kombināciju; 40–45

tomēr FAIMS nesen tika izmantots neskartu un native proteīnu analīzēm, izmantojot šķidruma ekstrakcijas virsmas analīzi.46–50Šeit mēs izmantojam FAIMS-TDP analīzi visa audu paraugam no Alcheimera slimības pacienta mediālās frontālās garozas (MFC).

Skenēšana CV diapazonā no –50 līdz –20 CV ar ārēju soli ļāva mums noteikt, kā FAIMS CV modulācija ietekmē to jonu īpašības, kas tiek pārraidīti caur cilindrisko FAIMS vienību, un kā šīs attiecības var izmantot, lai mērķētu uz proteoformām, pamatojoties uz izmēru.

FAIMS-TDP vairāk nekā divkāršoja proteoformu identifikāciju vienā CV, salīdzinot ar bez FAIMS, un ļāva dziļāk izmeklēt proteoformas, kas attiecas uz neirodeģeneratīvām slimībām, tostarp -, - un -sinukleīniem, PARK7, tau savienojuma izoformām un vairākām neskartām A proteoformām.

Kopumā šajā darbā ir aprakstīts, kā var panākt lielāku proteoformu identifikāciju un proteomu pārklājumu, izmantojot gāzes fāzes frakcionēšanu ar FAIMS TDP.

METODES

Parauga sagatavošana

MFC paraugs tika saņemts no Rašas Universitātes Alcheimera slimības centra. Dalībnieki bija klīnikā strādājoši gados vecāki cilvēki, kuri no 1992. līdz 2005. gadam reģistrējās ar atmiņas traucējumiem un/ordemenci.

Viņi tika novērtēti Rush Memory klīnikā attiecībā uz iespējamo demenci un piekrita smadzeņu ziedošanai kā daļa no Rush Alcheimera slimības pamata centra klīniskā kodola. Pētījumu apstiprināja Rush Universitātes Medicīnas centra Institucionālā pārskata padome.

Pēc nāves tuvākie radinieki deva piekrišanu autopsijai. Pacienta vispārējā kognitīvās diagnostikas kategorija bija Alcheimera demence bez citiem kognitīvo traucējumu cēloņiem51, savukārt pēcnāves intervāls bija 230 minūtes.

Visas paraugu apstrādes darbības tika veiktas, ievērojot BSL{{0}} piesardzības pasākumus. 33 mg MFC audu, kas uzglabāti -80 grādu temperatūrā, tika pārnesti uz 1,5 ml LoBind Eppendorf mēģenēm (Eppendorf, Cat# 022431081), pievienojot 0,5 ml homogenizācijas buferšķīduma, kas sastāvēja no 8 M urīnvielas, 10 m Mamonija bikarbonāta (ABC) un tris(2-karboksietil)fosfīns (TCEP) pie pH 7,5.

Homogenizācija tika panākta, veicot fiziskus traucējumus, pirms 0,5 ml homogenizācijas bufera pievienošanas istabas temperatūrā uz 3 0 s (BioVortexer ar SpiralPestle; Biospec 1083 un 1017) piestājot ar rokas motoru darbināmu granulu piestu.

Pēc tam paraugu inkubēja 37 grādu temperatūrā 60 minūtes ar ātrumu 1200 apgr./min, izmantojot ThermoMixer, lai ļautu ekstrahēt un denaturēt šūnu proteīnus. Urīnviela nešķīstošā materiāla granulēšana tika veikta, centrifugējot pie 18,{5} g 20 minūtes 22 grādos, un iegūto supernatantu pievienoja 3 ml mazgāšanas buferšķīduma (WB; 8 M urīnviela, 10 mM ABC, pH 7). .5) 4 ml 100 kDa molekulmasas robežvērtības (MWCO) filtrā, lai noņemtu lielas MW sugas.

Pēc 1 stundas centrifugēšanas 22 grādos un 5000 g aizturētā šķidruma tilpums bija 200 μFun filtrāta tilpums bija 3, 8 ml. 3,8 ml filtrāta tika pārnesti uz 3 kDa MWCO filtru, lai noņemtu mazo molekulu piesārņotājus un zemas MW peptīdus.

3 kDa MWCO filtru centrifugēja 22 grādos un 7300 g 1 stundu, iegūstot aiztures tilpumu 200 μL. 200 μL aiztures no 100 kDa MWCO filtra vēlreiz nomazgāja, atšķaidot to līdz 4 ml ar WB un vēlreiz filtrējot caur to pašu filtru.

Šī caurplūde tika pievienota tam pašam 3 kDa MWCO filtram, kā minēts iepriekš, un koncentrēta vēl vienu reizi.

Pēdējie 200 μL aiztures no 3 kDa MWCO filtra mazgāšanas tika pārnesti uz 1,5 ml LoBindEppendorf cauruli. Lai paskābinātu paraugu, tika pievienots 10 μL 10% skudrskābes (FA), kā rezultātā gala paraugā tika iegūta 0, 5% FA koncentrācija.

Paraugu centrifugēja ar ātrumu 18,000g 15 minūtes, lai noņemtu nogulsnēto materiālu, pirms tika mērīta proteīna koncentrācija, izmantojot bicinhonīnskābes (BCA) testu.

Liellopu seruma albumīna standarti tika sagatavoti 8 M urīnvielā, 10 mM ABC un 0,5% FA, lai ņemtu vērā iespējamo bufera ieguldījumu BCA testā. Proteīna koncentrācija ar BCA testu tika noteikta kā 1,1 mg/ml, kas atbilst galīgajai iznākumam 0,22 mg kopējā reģenerētā proteīna ~200 μL paraugā. atšķaidīts līdz 0,5 mg/ml ar WB, kas satur 0,5% FA, un uzglabāts -80 grādu temperatūrā līdz LC-MS analīzei.

Jāatzīmē, ka sākotnējie eksperimenti (dati nav publicēti), izmantojot tradicionālo proteāzes / fosfatāzes inhibitoru kokteili mūsu homogenizācijas buferī, izraisīja maldinošus BCAassay un LC-MS rezultātus, jo 3KMWCO filtrs aizturēja vairākus kokteiļa komponentus.

Turklāt daudzi parasti izmantotie fosfatāzes un proteāzes inhibitori ir ķīmiski nesaderīgi ar reducējošiem līdzekļiem, piemēram, TCEP. Ņemot vērā šīs nesaderības un to, ka sagaidāms, ka 8 M urīnvielas ar 10 mM TCEP spēcīgi denaturējošie apstākļi inaktivēs lielāko daļu proteāžu, mēs uzskatījām, ka šādos apstākļos proteolītiskā sadalīšanās joprojām tiks samazināta.

LC-MS/MS analīzes un FAIMS iestatījumi

Paraugi tika analizēti, izmantojot Waters NanoACQUITY UPLC sistēmu ar kustīgajām fāzēm, kas sastāv no {{0}},2% FA H2O (kustīgā fāze A) un 0,2% FA ACN (kustīgā fāze B).

Gan slazdošanas priekškolonna (100 μm id, 5 cm garums), gan analītiskā kolonna (75 μm id, 50 cm garums) bija suspensijas, kas pildītas ar C2 iepakojuma materiālu (attiecīgi 5 un 3 μm slazdam/analītiskajam, 300 Å, atdalīšanas metode). . Paraugi tika ievietoti 5 μLloop, kas atbilst 2, 5 ug no ievietotā materiāla daudzuma, un injicēti slazdošanas kolonnā ar izokrātisku plūsmu 5% b ar ātrumu 3 μL / min 20 minūšu laikā.

Atdalīšana tika veikta ar 5–50% b gradientu 180 minūšu laikā ar ātrumu 300 nL / min. Olbaltumvielu MS/MS analīzei NanoACQUITY sistēma tika savienota ar Thermo Scientific Orbitrap Fusion LumosTribrid masas spektrometru, kas aprīkots ar FAIMS Pro saskarni.

Avota parametri ietvēra elektrosmidzināšanas spriegumu 2,2 kV, pārneses kapilāru temperatūru 275 grādi un jonu piltuves radiofrekvences amplitūdu 60%. FAIMS tika iestatīts uz standarta izšķirtspēju bez papildu lietotāja kontrolētas nesējgāzes plūsmas un dispersijas sprieguma –5 kV (atbilst izkliedes laukam –33,3 kV/cm),50, savukārt CV mainījās atkarībā no eksperimenta (saukts par "ārēju pakāpienu). ").

Fusion Lumos tika iestatīts uz "inactprotein" lietojumprogrammas režīmu, kas samazina augstākas enerģijas C-slazdu disociācijas (HCD) šūnasN2 spiedienu līdz 2 mTorr, un dati tika apkopoti kā pilns profils. MS1 un MS2 dati tika iegūti ar izšķirtspēju 120 k un 60 k, mikroskenēs — 3 un 2, diapazonā no 500–2, 000 m/z un 400–2, 000 m/z, un ar AGC mērķi attiecīgi 5 × 106 un 5 × 105.

MS1 un MS2 tika iegūti arī ar maksimālo injekcijas laiku 400 ms. No datiem atkarīgie iestatījumi ietvēra 6 visintensīvāko jonu atlasi, to jonu izslēgšanu, kuri ir zemāki par lādiņa stāvokli5+, nenoteiktu lādiņa stāvokļu iekļaušanu un dinamisku izslēgšanu pēc viena novērojuma 30 s.

MS2 atlasītie joni tika izolēti ±1,5 m/z logā un sadrumstaloti, izmantojot sadursmes izraisītu disociāciju (CID) ar sadursmes enerģiju 35%. Mēs izmantojām CID, nevis HCD, jo normalizētās sadursmes enerģijas atkarība ir mazāka, lai iegūtu interpretējamus proteīna fragmentācijas spektrus, tādējādi dodot priekšroku mūsu proteoformas novērojumu plašumam, nevis sekvences pārklājumam.

Datu kopas katram FAIMS CV tika savāktas trīs eksemplāros. Visi neapstrādātie faili ir deponēti MassIVE datu krātuvē, un tiem var piekļūt, izmantojot pievienošanos MSV000086696 vai PXD023607 vietnē ProteomeXchange.

For more information:1950477648nn@gmail.com