Ergosta{0}},9(11),22-trien-3 -ol glābj AD deficītus, modulējot mikroglia aktivāciju, bet ne oksidatīvo stresu

Abstrakts: Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) tika izolēts no Taivānai specifiskās ārstniecības sēnītes Antrodia camphorate, kas ir pazīstama ar savu veselības veicināšanu un anti- novecošanās ietekme tautas medicīnā. Alcheimera slimība (AD) ir galvenā ar novecošanu saistīta slimība. Mēs pētījām ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol efektivitāti un iespējamo mehānismu AD simptomu noteikšanai. Kā AD modelis tika izmantots Drosophila ar cilvēka amiloīda (A) pārmērīgu ekspresiju visā neironā. Mēs salīdzinājām dzīves ilgumu, motorisko funkciju, mācīšanos, atmiņu, oksidatīvo stresu un mikrogliju aktivācijas biomarķierus un ergostas-7,9(11),22-trien-3 -ol- iekaisumu. ārstēto grupu pret neārstētās kontroles grupām. Ergosta-7,9(11), 22-trien-3 -ols, efektīvi uzlaboja AD modeļa dzīves ilgumu, motorisko funkciju, mācīšanos un atmiņu salīdzinājumā ar neārstētu kontroli. Tika samazināti mikroglia aktivācijas un iekaisuma biomarķieri, savukārt visuresošā lipīdu peroksidācija, katalāzes aktivitāte un superoksīda dismutāzes aktivitāte nemainījās. Visbeidzot, ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ols glābj AD deficītu, modulējot mikrogliju aktivāciju, bet ne oksidatīvo stresu.

Cistanche glikozīds var arī palielināt SOD aktivitāti sirds un aknu audos un būtiski samazināt lipofuscīna un MDA saturu katrā audā, efektīvi attīrot dažādus reaktīvos skābekļa radikāļus (OH-, H2O₂ utt.) un aizsargājot no izraisītiem DNS bojājumiem. ar OH-radikāļiem. Cistanche feniletanoīda glikozīdiem ir spēcīga brīvo radikāļu attīrīšanas spēja, augstāka reducējošā spēja nekā C vitamīnam, tie uzlabo SOD aktivitāti spermas suspensijā, samazina MDA saturu un zināmā mērā aizsargā spermas membrānas darbību. Cistanche polisaharīdi var uzlabot SOD un GSH-Px aktivitāti eksperimentāli novecojošu D-galaktozes izraisītu peļu eritrocītos un plaušu audos, kā arī samazināt MDA un kolagēna saturu plaušās un plazmā, kā arī palielināt elastīna saturu. laba attīrošā iedarbība uz DPPH, pagarina hipoksijas laiku novecojošām pelēm, uzlabo SOD aktivitāti serumā un aizkavē plaušu fizioloģisko deģenerāciju eksperimentāli novecojošām pelēm Ar šūnu morfoloģisko deģenerāciju eksperimenti ir parādījuši, ka Cistanche ir labas antioksidanta spējas un tas var būt zāles ādas novecošanās slimību profilaksei un ārstēšanai. Tajā pašā laikā ehinakozīdam Cistančā ir ievērojama spēja attīrīt DPPH brīvos radikāļus un novērst reaktīvās skābekļa sugas un novērst brīvo radikāļu izraisītu kolagēna noārdīšanos, kā arī tam ir laba iedarbība uz timīna brīvo radikāļu anjonu bojājumiem.

Noklikšķiniet uz Cistanche tablešu priekšrocības

【Lai iegūtu plašāku informāciju:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Atslēgvārdi: Alcheimera slimība; Drosophila; EK100; ergosta-7,9(11),22-izmēģinājis-3 -ol

1. Ievads

Antrodia camphorata ir Taivānai unikāla ārstnieciska sēne, kas 19. gadsimtā bija nozīmīga ekonomiska kultūra Taivānas ārējā tirdzniecībā [1]. Taivānas pirmajā vēstures grāmatā Tâi-uân Thong-sú (burtiski Taivānas vispārējā vēsture) tika reģistrēts Antrodia kampara pielietojums medicīnā, tostarp patogēnu likvidēšana, "veselības uzlabošana", "asins uzmundrināšana", "alkohola detoksikācija", " aizsargā aknas" un "pret-novecošanos" [2–4]. Tā kā novecošanas dēļ mēs saskaramies ar globālu iedzīvotāju veselības problēmu [5], ļoti svarīgi ir zinātniski pētīt vietējo medicīnu, lai izmantotu zināšanas par novecošanos.

Starp galvenajām ar novecošanu saistītām slimībām, piemēram, makulas deģenerāciju, aterosklerozi, vēzi un insultu, Alcheimera slimība (AD) ir ciets rieksts tās nenotveramā patoloģiskā mehānisma dēļ. Efektīva slimību modificējoša AD ārstēšana joprojām nav pieejama [6]. Pašreizējās AD patoloģiskās hipotēzes ietver, bet ne tikai, holīna acetiltransferāzes samazināšanos, glutamāta eksitotoksicitāti, amiloīda beta (A) agregāciju, tau fosforilāciju, smadzeņu insulīna rezistenci [7] un zarnu mikrobiomu izmaiņas [8]. Tomēr, neatkarīgi no iesaistīto AD ierosinošo cēloņu veida, oksidatīvais stress un iekaisuma mikroglia aktivācija ir kopīgas pazīmes, kas pavada AD neirodeģenerāciju [9, 10]. Interesanti, ka neiroiekaisums un oksidatīvais stress ir savstarpēji saistīti notikumi, kas tiek novēroti gan AD, gan hipotēzes AD patoloģijā. No vienas puses, senils A nogulsnēšanās plāksnes izraisa iekaisuma reakcijas, mikroglia aktivāciju, citokīnu izdalīšanos un astrocitozi, izraisot nevēlamas sekas, piemēram, progresējošus neironu bojājumus un, visbeidzot, kognitīvās disfunkcijas. Imūnās atbildes reakcijas aktivizēšana var sākotnēji apkarot iebrūkošos patogēnus ar A vai novērst pārmērīgas A nogulsnes; tomēr process neizbēgami rada reaktīvās skābekļa sugas (ROS), kas var izraisīt neironu bojājumus mikrovidē. No otras puses, A var izraisīt ROS no iekaisuma neatkarīgā veidā. Piemēram, A tika atrasts AD pēcnāves mitohondriju membrānās un varēja iekļūt mitohondrijās, izraisot elektronu transportēšanas ķēdes (ETC) traucējumus un izraisot ROS veidošanos. Paaugstināts ROS savukārt var izraisīt citokīnu izdalīšanos un izraisīt iekaisumu [7, 9, 10]. Tāpēc antioksidatīvās un pretiekaisuma molekulas varētu būt potenciāli AD terapijas līdzekļi.

Antrodijas kamparatam, īpaši vienam no tā iegremdētajiem vesela buljona izolētajiem savienojumiem ergosta-7,9(11), 22-trien-3 -ol (pazīstams arī kā EK100), bija izteikti antioksidanti un antioksidanti. -iekaisuma aktivitātes [11–13]. Turklāt Chang et al. [14] ir parādījuši, ka antrohinonols, vēl viens savienojums, kas izolēts no fermentētā Antrodia kampara micēlija, uzlabo mācīšanos un atmiņu AD peles modelī ar pazeminātu astrogliozi un oksidatīvo stresu. Tomēr cēloņsakarības starp samazināto astrogliozi un oksidatīvo stresu, ārstējot ar antrohinonolu, nevarēja apstiprināt, un oksidatīvā stresa samazināšanās tika uzskatīta par mediācijas faktoru [14]. EK100 drošība iepriekš tika pārbaudīta saskaņā ar Ekonomiskās sadarbības un attīstības organizācijas (OECD) vadlīnijām 407, izmantojot peles modeli ar 10 un 20 mg/kg dienā [15]. Tāpēc šajā pētījumā mēs pieņēmām aptuveni līdzvērtīgas augļu mušu brīvās barošanas koncentrācijas.

Augļu mušas (Drosophila melanogaster) A 42 pārmērīgas ekspresijas modelis ir vispāratzīts AD dzīvnieku modelis [16] ar raksturīgiem AD simptomiem, tostarp samazinātu dzīves ilgumu, mācīšanās un motora deficītu [17], oksidatīvo stresu [18] un mikroglia aktivāciju. [19]. AD modelēšanas izaicinājumi Drosophila melanogaster neietver BACE aktivitāti Drosophila un dzimumu atšķirības, kas liecina par smagākiem simptomiem vīriešu failos. Tie nav novēroti cilvēka AD gadījumā [20]. Tāpēc AD modelim mēs pieņēmām cilvēka A 42 peptīdu ekspresējošās mušas, kur A 42 ražošanai nav nepieciešama BACE aktivitāte. Šajā pētījumā mēs pārbaudījām, vai EK100 uzlabo AD simptomus un, vēl svarīgāk, vai gan oksidatīvā stresa, gan astrogliozes modulācijas ir būtiskas AD uzlabošanai.

2. Rezultāti

2.1. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol izglābta AD Drosophila izdzīvošana un kāpšana

AD diagnoze ir saistīta ar vidējā dzīves ilguma samazināšanos [21], un gandrīz puse AD pacientu cieš no aktivitātes traucējumiem [22]. Tāpēc mēs pārbaudījām, vai Antrodia camphorata ekstrakts ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) uzlabo dzīvnieka izdzīvošanu un kāpšanas spēju. AD Drosophila modelis. Mēs atklājām, ka ārstēšana ar ergosta-7,9(11),22-trien-3 -olu 125 vai 250 µg/ml ievērojami uzlaboja AD Drosophila izdzīvošanu (p < 0,01) (attēls). 1A un papildu tabula S1), bet tikai liela deva (250 µg / ml) uzlaboja AD Drosophila kāpšanu (1.B attēls). Tā kā izdzīvošanas un mobilitātes deficīts ir AD klīniskie simptomi, turpmākajos pētījumos tika izmantota koncentrācija 250 µg/ml, kas uzlaboja abus simptomus.

2.2. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol Izglābtas mācības un vienas stundas atmiņa par AD Drosophila

Pēc tam mēs pārbaudījām, vai ārstēšana ar ergosta{{0},9(11),22-trien-3 -ol uzlabo mācīšanās un atmiņas defektus, kas ir raksturīgs AD simptoms. AD mušas tika ārstētas ar ergosta- 7,9(11),22-trien-3 -ol 250 ug/ml 14 dienas un tika pakļautas mācīšanās un atmiņas testiem ar T veida labirints. Kā parādīts 2.A attēlā, salīdzinot ar savvaļas tipa kontroli (AD(-)/EK(-)), AD kontroles (AD( plus )/EK(-)) mācīšanās spējas ievērojami samazinājās (p < 0,01), savukārt ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol ārstēšana būtiski uzlaboja AD mācīšanās spējas (p < 0,05). Turklāt ergosta-7,9(11), 22-trien-3 -ols, arī uzlaboja AD pavājinātu vienas stundas atmiņu (2.B attēls).

2.3. Ergosta-7,9(11),22-izmēģināja-3 -ol modulētu mikroglia aktivāciju AD Drosophila

Pēc tam mēs pārbaudījām, vai ārstēšana ar ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol samazina mikroglia aktivāciju AD gadījumā. AD gadījumā aktivētās mikroglijas pavada fagocitoze un neirodeģenerācija [23]. Drosofilā mikroglia šūnu absorbcijas marķieris un līdz ar to arī mikroglia aktivācijas marķieris ir drapējuma (Drpr) un pakārtotā CED izpausme [24]. Pēc ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ola apstrādes AD mušas tika iznīcinātas, un no mušu galvas tika iegūta RNS RT-qPCR. Kā parādīts 3.A attēlā, abi Drpr tika ievērojami samazināti ar ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol ārstētu AD Drosophila, salīdzinot ar neārstētu AD. Tas nozīmē, ka ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ols samazināja mikroglia aktivāciju AD Drosophila. Turklāt ergosta-7,9(11), 22-trien-3 -ols, arī samazināja CNS iekaisumu, kā liecina ar iekaisumu saistīto gēnu pazemināšanās (3.B attēls). .

2.4. Ergosta-7,9(11),22-izmēģinājis-3 -ols nemodulēja visuresošo oksidatīvo stresu AD Drosophila gadījumā

Pēc tam mēs pārbaudījām, vai visuresošā, ti, visa ķermeņa, oksidatīvā stresa modulācija ir nepieciešama, lai ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol glābtu AD. Ergosta-7,9(11),22-izmēģināta- 3 -ola apstrāde nemainīja lipīdu peroksidāciju (4.A attēls), katalāzes aktivitāti (4.B attēls), superoksīda dismutāzes aktivitāti (4.C attēls). , vai ar oksidatīvo stresu saistīto gēnu ekspresija (attēls

3. Diskusija

Šajā pētījumā ir ziņots par ergosta-7,9(11),22- mēģina-3 -ol, ekstrakta no Antrodia kampara, efektivitāti un iespējamo pamatā esošo mehānismu AD simptomu modificēšanai, izmantojot Drosophila. modelis ar cilvēka-A pārmērīgu ekspresiju. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ols efektīvi uzlaboja mācīšanos un atmiņu un pagarināja pacientu ar AD dzīvi. Turklāt tika samazināti mikroglia aktivācijas un iekaisuma biomarķieri, bet visuresošais oksidatīvais stress nemainījās.

Ir daudzi oksidatīvā stresa avoti AD gadījumā, tostarp, bet ne tikai, iedzimtas imunitātes aktivizēšana, piemēram, A uzkrāšanās, mitohondriju izjaukšana ar A, hiperfosforilētais tau un metālu malmetabolisms [25]. Lai gan iekaisums un oksidatīvais stress var savstarpēji inducēt viens otru, mēs varam pieņemt, ka to sinhronās izmaiņas notiek tikai apstākļos, kad citi oksidatīvā stresa avoti paliek nemainīgi. Tomēr šajā pētījumā tas tā nav. Iedzimtās imunitātes samazināšanās, īpaši mikroglia aktivācija, vienlaikus mazina tās ieguldījumu A klīrensā, kas var izraisīt A uzkrāšanos. Interesanti, ka pati uzkrāšanās vairākos veidos izraisa oksidatīvā stresa veidošanos. Tādējādi EK1000, kas samazina mikroglia aktivāciju un iekaisuma reakcijas, daļēji var aizsargāt neironus no nevēlamiem imūnsistēmas uzbrukumiem, bet maksās par A klīrensa pavājināšanos. Tādējādi šī pētījuma rezultāts var atspoguļot mikroglia mērķa stratēģijas ierobežojumus, vismaz AD Drosophila modelī.

Mikroglia mediētā iedzimtā imūnsistēma ir aprakstīta kā abpusēji griezīgs zobens neirodeģeneratīvās slimībās, īpaši AD [26, 27]. Aktivētās mikroglijas cenšas noņemt toksiskus patogēnus, piemēram, A, bet neizbēgami izraisa neironu bojājumus mikrovidē. 250 µg/mL EK100 pārākums 35 dienu laikā var nozīmēt, ka mikroglia aktivācijas samazināšanas stratēģija ir ierobežota patoloģiskā stadijā, vismaz augļu mušu AD modeļa gadījumā. Turklāt būtiskais mikroglia aktivācijas un iekaisuma reakcijas biomarķieru samazinājums nav spējis pārvērsties līdzvērtīgi nozīmīgā izdzīvošanas uzlabošanā, un CNS funkciju daļēji var izskaidrot ar mikroglijas abpusējo zobenu. Tas nozīmē, ka mikroglia aktivācija nav ne vienīgais, ne dominējošais AD progresa faktors. Pazemināta mikroglia aktivācija arī nozīmē, ka pārmērīgi ekspresētā A degradācija augļu mušu modelī tika daļēji izslēgta, kas var arī izskaidrot augstāku mirstību augstākai EK100 koncentrācijai vecumā no 35 līdz 52 dienām.

Ir ziņots, ka antrohinonols, vēl viens Antrodia kampara ekstrakts, ir efektīvs AD peļu ārstēšanā, kam oksidatīvā stresa samazināšanās ir postulēta kā mediācijas faktors [14]. Tāpēc tas var nozīmēt, ka antrohinonols un ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ols uzlabo AD simptomus, izmantojot neatkarīgus ceļus, attiecīgi mediējot oksidatīvo stresu vai nē. Tāpēc būtu interesanti pārbaudīt, vai vienlaicīgai ārstēšanai ar antrohinonolu un ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ols būtu sinerģiska ietekme uz AD uzlabošanos.

Agrīnās AD stadijās zāļu izstrādes galvenais uzsvars tiek likts uz A nogulsnēšanās novēršanu (piemēram, nesen apstiprinātajā monoklonālajā antivielā aducanumabā [28], neskatoties uz to, ka vienā no diviem III fāzes klīniskajiem pētījumiem tā ir pretrunīga par minimāliem klīniskajiem ieguvumiem un neefektivitāti. [29]), vai mēģinājumi palielināt A mikroglia uzņemšanu [30–32]. Tomēr mērenās vai progresējošās AD stadijās pārmērīga mikroglia aktivizēšana pasliktina neirodeģenerāciju [33], un tāpēc ir nepieciešamas alternatīvas terapeitiskās stratēģijas.

4. Materiāli un metodes

4.1. Lidojuma krājumu uzturēšana un kalpošanas laika mērīšana

A transgēnais Drosophila celms H29.3/CyO tika iegūts no [16] un tika krustots ar w(CS10) sešās paaudzēs. Panneirālā draivera elav-GAL4c155 līnija tika pārspēta ar w(CS10) sešās paaudzēs. Balto acu līnija w1118 (Bloomington Drosophila Stock Center #3605), kas šķērsota Canton S līniju (Bloomington Drosophila Stock Center # 64349) 10 reizes (w (CS10)), tika izmantota kā standarta krājums. Panneirālā draivera elav-GAL4c155 līnija tika iegūta no Bloomington Drosophila Stock Center (#458). Eksperimentālo mušu – ti, AD modeļa – genotips bija [elav; H29.3/ plus ], kas tika atlasīts no F1 pēcnācējiem bez CyO marķiera. Mušas tika turētas kukurūzas miltu standarta barotnē 25 ◦C temperatūrā 12 stundu gaismas-tumsas ciklā. T-labirintam izvirzot [elav; H29.3/ plus ] mušas tika savāktas (abi dzimumi jauktas un neapstrādātas) un kultivētas ar EK100 apstrādi vai bez tās līdz d14 pēc parādīšanās. Izdzīvošanai, kāpšanai un RT-qPCR tika izmantoti tikai tēviņi. RNS paraugi tika savākti d30 pēc parādīšanās, kad gan dzīves ilgums, gan kāpšanas līknes uzrādīja ievērojamu atdalīšanu salīdzinājumā ar neapstrādātu AD modeli.

Dzīves ilguma analīzē divdesmit līdz trīsdesmit mušas tika izaudzētas pārtikas flakonā ar vai bez CS; katrai apstrādei tika sagatavoti vismaz četri flakoni. Pārtikas flakoni tika nomainīti ik pēc 2 līdz 3 dienām, un tajā laikā tika skaitītas beigtās mušas. Katrā izmēģinājumā tika veikti vismaz trīs atkārtojumi. Izdzīvošanas procentuālo daļu nosaka kā dzīvu mušu skaitu, kas dalīts ar kopējo mušu skaitu testa sākumā.

4.2. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (Ek100)

Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol tika iegūts no Antrodia camphorata laipnās dāvanas, kā aprakstīts iepriekš [34]. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ols istabas temperatūrā veido gaiši dzeltenas krāsas pulveri. Izejas šķīdums tika sagatavots 6, 25 mg / ml koncentrācijā EtOH tieši pirms lietošanas. Dzīves ilguma un pretģeotakses pārbaudēm galīgās koncentrācijas bija 125 un 250 µg/ml. Mācīšanās atmiņas un gēnu ekspresijas testos galīgā koncentrācija bija 250 µg/ml. EK100 molekulmasa ir 396,65. Tātad atbilstošās molārās koncentrācijas ir attiecīgi 315 vai 630 µM. Mušas tika apstrādātas ar divām EK100 devām ar galīgo koncentrāciju 125 un 250 µg/mL, kas tika sajauktas barībā ar Ad libitum barošanu. Kontroles barība saturēja tādu pašu šķīdinātāja EtOH daudzumu kā eksperimenta grupās ar galīgo EtOH koncentrāciju 3 tilpumprocenti. Ārstēšana sākās no parādīšanās līdz katra testa datu vākšanas laika punktam. Lai veiktu izdzīvošanas un kāpšanas testu, ārstēšana tika veikta visu mūžu. Mušu skaits katrai replikācijai tika aprakstīts katra testa metodes sadaļā. Mēs arī pārbaudījām mūža ilguma testus ar apstrādātām/neapstrādātām savvaļas tipa mušām, lai nodrošinātu ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol drošību mušu modeļos (papildu attēls S1 ).

4.3. Antigeotakses testi

Šis protokols ir balstīts uz iepriekš publicētu metodi [35] ar dažām modifikācijām. Īsumā kā ģeotakses aparāts tika izmantots caurspīdīgs cilindrisks plastmasas flakons ar diametru 2,5 cm un augstumu 9,5 cm (garāks būs labi, bet ar to būs grūtāk rīkoties). Flakona apakšdaļa tika pārklāta ar vienu mušu barības slāni kā spilvenu. Uz flakona ārējās virsmas tika piestiprināta 5 cm atzīme virs spilvena. Otrs flakona gals bija atvērts, un no turienes tika ielādētas mušas. Tā kā tests tika veikts vienlaikus ar izdzīvošanas testu, ielādēto mušu skaits bija identisks tajā brīdī izdzīvojušo mušu skaitam. Mušas tika ievietotas flakonā; augšdaļa tika noslēgta ar vāciņu, un flakona apakšdaļa tika atkārtoti (divas sekundes) sita pret cieto virsmu, uz kuras tas stāvēja (šajā gadījumā laboratorijas stends). Klauvēšana bija pietiekami spēcīga, lai nobiedētu mušas un liktu tām kāpt gar flakona sienām, taču ne tik spēcīga, lai tās fiziski kaitētu. Viss process tika ierakstīts video 18 sekundes, atzīmējot mušu skaitu, kas uzkāpa virs 5 cm atzīmes, un izteikts procentos katrai grupai. Tika saskaitīts mušu skaits, kas uzkāpušas pāri 5 cm atzīmei. Katrai grupai tika veikti četri atkārtojumi. Kāpšanas spēju procentuālais daudzums tiek definēts kā kāpjošo mušu skaits, dalīts ar kopējo mušu skaitu testa sākumā. Kāpšanas spējas tika pārbaudītas arī apstrādātām/neapstrādātām savvaļas mušām, lai nodrošinātu ergosta-7, 9 (11), 22-trien-3 -ol drošību mušu modeļos (papildu attēls S2). .

4.4. Drosophila mācību un atmiņas platforma (T-Maze)

Lai novērotu Drosophila mācīšanos un atmiņu, augšējā kausa kamerā vispirms tika ievietotas aptuveni 100 mušas, kuras var nodrošināt ar elektrisko spriegumu un nogādāt mušām elektriskās strāvas triecienu. Mušas vispirms tika piegādātas ar 1. smaku (MCH) kopā ar elektriskās strāvas trieciena viļņiem. Pēc tam mušas tika piegādātas ar 2. smaku (OCT) bez elektrošoka viļņiem. Pēc apmācības mušas tika pārvietotas uz zemāk esošo telpu, kurā divas atvērtās puses tika apgādātas ar attiecīgi 1. vai 2. smaku. Novērojot mušu kustības virzienu, smakas 2 novirzi pret smaku 1 var novērtēt ar veiktspējas indeksu (PI), kas definēts kā mušu skaita starpība starp divām smakām, kas dalīta ar kopējo mušu skaitu. Veiktspējas indekss atspoguļo Drosophila spēju mācīties un atmiņu [36]. Cita mušu grupa tika kondicionēta ar apgrieztu smaku pāriem tā, ka katra smaka vienu reizi kalpoja kā elektriskās strāvas trieciens un vienu reizi kā elektriskās strāvas trieciens. Šo divu testu PI tika aprēķināts kā viena atkārtojuma galīgais PI. "1 h-atmiņa" tika pārbaudīta pēc 1 h intervāla līdz apmācībai, savukārt "mācīšanās" tika pārbaudīta pēc 1,5 min atstarpes līdz treniņam. Mēs arī pārbaudījām AD mušu izvairīšanos no MCH un OCT ar EK100 apstrādi vai bez tās, lai nodrošinātu, ka apstrāde rada neobjektivitāti pret nepatīkamām smakām (papildu attēls S3).

4.5. Kvantitatīvā PCR

Pirms RNS ekstrakcijas galvas un ķermeņi tika atdalīti. Vienā atkārtojumā mušas tika anestēzētas ar CO2; savākti, 100 vienā reizē, Eppendorf mēģenēs; un pēc tam iegremdē šķidrā slāpeklī uz 1 min, lai ķermeņi kļūtu trausli. Iegūtie sasaldētie līķi pēc tam tika iekrauti sietu kratītāju kaudzēm (Bunsekifurui, Nr. 40 un Nr. 25) un maisīti. Ķermeņi sadalījās un tika sašķiroti pēc sieta acu izmēra divās atsevišķās frakcijās: "galvās" un "ķermeņos". Kopējā RNS tika ekstrahēta ar RNeasy Mini komplektu (Qiagen, Diseldorfa, Vācija) un pēc tam izmantota cDNS sintezēšanai ar VersoTM cDNS sintēzes komplektu (Thermo Scientific, Waltham, MA, ASV). Pētīto gēnu RNS ekspresijas līmeņi tika kvantificēti ar reāllaika PCR (Applied Biosystems 7700, Thermo Scientific, Waltham, MA, ASV) ar Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Scientific, Waltham, MA, ASV). Rezultāti tika normalizēti atbilstoši Gapdh vai Rpl32 relatīvajam daudzumam. Izmantotie grunti ir norādīti zemāk. Gapdh: 50 -GAAAAAGCGGCAGTCGTAAT-30 un 50 -AATTCCGATCTTCGACATGG-30 ; Drpr: 50 -TGTGATCATGGTTACGGAGGAC-30 un 50 -CAGCCGGGTGGGCAA-30 ; CED: 50 - CGTTTACAAGGAGCGACT-30 un 50 -TTCCCAGATTGAAGAGCAGG-30; Kaķis: 50 -TGACT ACAAAAACTCCCAAACG-30 un 50 -TTGATTCCAATGGGTGCTC-30 ; PHGPx: 50 -TGACA TCGGCGAGGTGT-30 un 50 -CGGTCTGCTTGGCCTTTA-30 ; Cnc: 50 -GCCAACTATGGTGG TGGAGT-30 un 50 -ACGCTGCGATTCAGACG-30 ; SOD1: 50 -GTCGACGAGAATCGTCAC CT-30 un 50 -GGAGTCGGTGATGTTGACCT-30; SOD2: 50 -AAATTTCGCAAACTGCAAGG- 3 0 un 50 -GGTCGCCATTTGTTGCTATT-30; SOD3: 50 -TCAGCATGGGTGCTCACTAT-30 un 50 -TAATGCCCGTGGAGTTGG-30 ; mkk3: 50 -CCGCTACCCATACGACAAT-30 un 5 0 -GAATTCCGGCGAAAATGT-30; mekk1: 50 -TTTAACGGCAGTGGAACTGT-30 un 50 - TGCATCTGCAACTGCTCAC-30 ; imd: 50 -AGATCGACCAGGCCATAATC-30 un 50 -AATCC ACTGGAGCAACAGC-30; rac1: 50 -CCGTGTTCGACAACTACTCG-30 un 50 -AGTCGGTCG TAGTCCTCCTG-30; garša: 50 -GCCATACTCCCTTGGAATTG-30 un 50 -TCTCCCTTCTCCG GATACAC-30 ; Rpl32: 50 -CGGATCGATATGCTAAGCTGT-30 un 50 -CGACGCACTCTGTTG TCG-3.

4.6. Oksidatīvā stresa testi

Trīs lipīdu peroksidācijas, katalāzes aktivitātes un superoksīda dismutāzes aktivitātes atkārtojumi tika mērīti ar BIOXYTECH LPO-586 (OxisResearch, OXIS International, Beverly Hills, CA, ASV), Catalase Assay Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). , ASV) un Superoxide Dismutase Assay Kit (Kaimana), ievērojot ražotāja norādījumus. Īsumā, SOD aktivitāte tika novērtēta, mērot komplektā piegādātās ksantīna oksidāzes radīto superoksīda radikāļu dismutāciju, un tā tika noteikta, pārveidojot tetrazolija sāli formazāna krāsā, pēc tam kvantitatīvi nosakot pēc absorbcijas pie 440–460 nm. CAT aktivitāte tika novērtēta, mērot formaldehīda veidošanos no metanola H2O2 klātbūtnē, ko katalizē CAT, ko noteica komplektā piegādātais hromogēnais 4-amino-3- hidrazino-5-merkapto-1 ,2,4-triazolu, pēc tam kvantitatīvi nosaka pēc absorbcijas pie 540 nm. Lipīdu peroksidācijas aktivitāte tika novērtēta, mērot polinepiesātināto taukskābju peroksīdu sadalīšanos malonaldehīdos (MDA) un 4-hidroksialkenālos, ko noteica komplektā iekļautais hromogēnais N-metil-2-fenilindols, pēc tam kvantitatīvi nosakot pēc absorbcijas pie 586. nm. SOD, Cat un LPO testos veselu homogenizēto mušu skaits katrā atkārtojumā bija attiecīgi 50, 50 un 100.

4.7. Statistiskā analīze

Atšķirības nozīme starp izdzīvošanas līknēm un kāpšanas līknēm ergosta{0}},9(11),22-trien-3 -ol ārstētajās un kontroles grupās tika vērtēta pēc log-rank (Mantel– Koksa) un Gehana–Breslova–Vilkoksona testi. Atšķirības nozīme starp ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol ārstēto un kontroles grupu mācīšanās atmiņas veiktspējas indeksu tika novērtēta ar Stjudenta t-testu.

5. Secinājumi

Mēs pārliecinājāmies, ka ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) no Antrodia kampara uzlabo izdzīvošanu, mācīšanos un atmiņu AD Drosophila modelī ar samazinātiem biomarķieriem. mikroglia aktivāciju un iekaisumu. Turklāt simptomu izmaiņas nenotika visuresoša oksidatīvā stresa samazināšanas rezultātā, kas nozīmē, ka ergosta-7,9(11) un 22-trien-3 -ols uzlabo AD simptomus, izmantojot dažādus ceļus uz citu. Antrodijas kampara ekstrakts, antrohinonols. EK100 efektīvi samazināja mikroglia aktivāciju un iekaisumu, kas var palīdzēt novērst tipiskus ar AD saistītus kognitīvos trūkumus, piemēram, mācīšanās un atmiņas deficītu.

Papildu materiāli:Tālāk ir pieejami tiešsaistē. S1 attēls: ar EK100 apstrādātu savvaļas mušu izdzīvošana; S2 attēls. Savvaļas tipa mušu kāpšana, kas apstrādāta ar EK100; Attēls S3: Aversīva smaka novēršana AD mušām, kas apstrādātas ar EK100; S1 tabula. Izdzīvošanas līkņu statistika.

Autora ieguldījums:H.-PL, Y.-HK un W.-YL izstrādāja eksperimentus. Y.-HK piedalījās EK100 sagatavošanā. JC, L.-ZC, M.-SC, L.-WS un T.-NC veica eksperimentus. Manuskripta sagatavošanā piedalījās visi autori. Visi autori ir izlasījuši un piekrituši publicētajai manuskripta versijai.

Finansējums: šis darbs tika atbalstīts ar Taivānas Zinātnes un tehnoloģiju ministrijas dotācijām (MOST 108-2320-B-039-031-MY3, MOST 109-2314-B-039-030, MOST 110-2314- B-039-009), Ķīnas Medicīnas universitāte un slimnīca (CMU109-MF-85, CMU108-MF-68, CMU108-MF{{12 }}, CMU109- AWARD-02 un DMR-109-150), kā arī no Featured Areas Research Center programmas Izglītības ministrijas (IZM) Higher Education Sprout Project ietvaros. Taivānā (CMRC-CHM-2-1).

Institucionālās pārbaudes padomes paziņojums:Nav piemērojams.

Informētas piekrišanas paziņojums:Nav piemērojams.

Paziņojums par datu pieejamību:Dati, kas izmantoti, lai pamatotu šī pētījuma secinājumus, ir iekļauti rakstā.

Interešu konflikti:Y.-HK ir viens no patenta US-9757393-B2 ar nosaukumu "Ergostatrien-3- -ola atvasinājumi no aniridijas kampara un tā antiglikēmisks, antihiperlipidēmisks un pazeminošs aknu tauku lietojums" izgudrotājiem, bet nav cesionārs. Citi autori paziņo, ka viņiem nav konkurējošu interešu. Finansētājiem nebija nekādas nozīmes pētījuma izstrādē; datu vākšanā, analīzē vai interpretācijā; rokraksta rakstīšanā vai lēmumā par rezultātu publicēšanu.

Paraugu pieejamība:Savienojumu paraugi ir pieejami no autoriem.

Atsauces

1. Davidson, JW Formosa sala, pagātne un tagadne: vēsture, cilvēki, resursi un komerciālās perspektīvas. Tēja, kampars, cukurs, zelts, ogles, sērs, ekonomiski augi un citi izstrādājumi; Macmillan & Company: Ņujorka, NY, ASV, 1903. gads.

2. Tsai, Z.; Liaw, S. Ganodermas lietošana un ietekme; Sheng-Yun Publishers, Inc.: Taichung, Taivāna, 1985; 116.–117.lpp.

3. Chen, C.-J. Pētījums par Antrodia camphorata cieto audzēšanu un bioaktivitāti. Sēnīte. Sci. 2001, 16, 65–72.

4. Gētangili, M.; Tzengs, Y.-M. Antrodia kampara un tā bioaktīvo savienojumu farmakoloģiskās iedarbības apskats. Uz pierādījumiem balstīts papildinājums. Altern. Med. 2011, 2011, 212641. [CrossRef] [PubMed]

5. Ogura, S.; Jakovļevičs, MM Pasaules iedzīvotāju novecošanās – veselības aprūpe, sociālās un ekonomiskās sekas. Priekšpuse. Sabiedrības veselība, 2018, 6, 335. [CrossRef] [PubMed]

6. Kamingss, J.; Lī, G.; Riters, A.; Zhong, K. Alcheimera slimības zāļu izstrādes cauruļvads: 2018. Alcheimera dements. Tulk. Res. Clin. Interv. 2018, 4, 195–214. [CrossRef] [PubMed]

7. Šarma, P.; Srivastava, P.; Sets, A.; Tripathi, PN; Banerjee, AG; Shrivastava, SK Visaptverošs Alcheimera slimības patoģenēzes mehānismu un iespējamo terapeitisko stratēģiju pārskats. Prog. Neirobiol. 2019, 174, 53–89. [CrossRef] [PubMed]

8. Sočoka, M.; Donskova-Łysoniewska, K.; Dinizs, BS; Kurpas, D.; Brzozovska, E.; Lešeks, J. Alcheimera slimības zarnu mikrobiomu izmaiņas un iekaisuma izraisīta patoģenēze — kritisks pārskats. Mol. Neirobiol. 2019, 56, 1841–1851. [CrossRef]

9. Agostinju, P.; A Cunha, R.; Oliveira, C. Neiroinflammation, oksidatīvais stress un Alcheimera slimības patoģenēze. Curr. Pharm. Des. 2010, 16, 2766–2778. [CrossRef]

10. Galaško, D.; Montine, TJ Oksidatīvo bojājumu un iekaisuma biomarķieri Alcheimera slimībā. Biomark. Med. 2010, 4, 27–36. [CrossRef]

11. Kuo, Y.-H.; Lin, T.-Y.; Jūs, Y.-J.; Wen, K.-C.; Sung, P.-J.; Chiang, H.-M. No Antrodia camphorata izolēta ergostatrien-3 -ola pretiekaisuma un fotobojāšanas iedarbība uz bezspalvas peles ādu. Molecules 2016, 21, 1213. [CrossRef]

12. Čao, T.-Y.; Hsieh, C.-C.; Hsu, S.-M.; Vans, C.-H.; Liana, G.-T.; Tseng, Y.-H.; Kuo, Y.-H.; Hsieh, S.-C. Ergostatrien-3 -ol (EK100) no Antrodia camphorata mazina oksidatīvo stresu, iekaisumu un aknu bojājumus in vitro un in vivo. Iepriekšējā Nutr. Food Sci. 2021, 26, 58. [CrossRef]

13. Tsai, T.-C.; Tungs, Y.-T.; Kuo, Y.-H.; Liao, J.-W.; Tsai, H.-C.; Chong, K.-Y.; Čens, H.-L.; Chen, C.-M. Antrodia camphorata un tās aktīvā savienojuma Ergostatrien{10}ol pretiekaisuma iedarbība peles ādas išēmijas modelī. FASEB J. 2015, 29, LB444.

14. Čans, V.-H.; Čens, MC; Cheng, IH Antrohinonols pazemina smadzeņu amiloīda līmeni un uzlabo telpisko mācīšanos un atmiņu Alcheimera slimības transgēnās peles modelī. Sci. Rep. 2015, 5, 1.–12. [CrossRef] [PubMed]

15. Čeņs, Y.-M.; Sung, H.-C.; Kuo, Y.-H.; Hsu, Y.-J.; Huangs, C.-C.; Liang, H.‑L. Ergosta-7, 9 (11), 22-trien-3 -ol no Antrodia camphorate ietekme uz peļu bioķīmisko profilu un vingrinājumu veiktspēju. Molecules 2019, 24, 1225. [CrossRef]

16. Finelli, A.; Kelkars, A.; Dziesma, H.-J.; Jans, H.; Konsolaki, M. Modelis Alcheimera A 42-inducētās toksicitātes izpētei Drosophila melanogaster. Mol. Šūna. Neirosci. 2004, 26, 365–375. [CrossRef] [PubMed]

17. Ping, Y.; Hahm, E.‑T.; Varo, G.; Dziesma, Q.; Vo-Ba, D.-A.; Licursi, A.; Bao, H.; Ganoe, L.; Finčs, K.; Tsunoda, S. 42-izraisītās paaugstinātas uzbudināmības saistīšana ar neirodeģenerāciju, mācīšanās un kustību traucējumiem un īsāku dzīves ilgumu Alcheimera slimības modelī. PLoS Genet. 2015, 11, e1005025. [CrossRef] [PubMed]

18. Sāncensis, T.; Lapa, RM; Čandraratna, DS; Sendals, TJ; Raiders, E.; Liu, B.; Lūiss, H.; Rozāls, T.; Hider, R.; Camargo, L. Fenton ķīmija un oksidatīvais stress veicina -amiloīda peptīda toksicitāti Alcheimera slimības Drosophila modelī. Eiro. J. Neurosci. 2009, 29, 1335–1347. [CrossRef]

19. Rejs, A.; Speese, SD; Logan, MA Glial drapējums glābj A toksicitāti Alcheimera slimības Drosophila modelī. J. Neurosci. 2017, 37, 11881–11893. [CrossRef]

20. Jeibmans, A.; Paulus, W. Drosophila melanogaster kā smadzeņu slimību paraugorganisms. Int. J. Mol. Sci. 2009, 10, 407–440. [CrossRef] [PubMed]

21. Brūkmeijers, R.; Korrada, MM; Curriero, FC; Kawas, C. Izdzīvošana pēc Alcheimera slimības diagnozes. Arch. Neirol. 2002, 59, 1764–1767. [CrossRef]

22. Lama, LC; Tangs, V.; Leungs, V.; Chiu, HF Alcheimera slimības uzvedības profils ķīniešu gados vecākiem cilvēkiem – Alcheimera slimības uzvedības patoloģijas vērtēšanas skalas ķīniešu versijas validācijas pētījums. Int. J. Geriatr. Psih. 2001, 16, 368–373. [CrossRef] [PubMed]

23. Švābs, C.; McGeer, PL Alcheimera slimības un citu neirodeģeneratīvu traucējumu iekaisuma aspekti. J. Alcheimera Dis. 2008, 13, 359.–369. [CrossRef] [PubMed]

24. Makdonalds, Dž. M.; Pludmale, MG; Porpiglia, E.; Šīhana, AE; Vats, RJ; Frīmens, MR Drosophila šūnu līķa absorbcijas receptors Drapers mediē atdalīto aksonu glia klīrensu. Neuron 2006, 50, 869–881. [CrossRef]

25. Čeņs, Z.; Zhong, C. Oksidatīvais stress Alcheimera slimībā. Neirosci. Bullis. 2014, 30, 271–281. [CrossRef]

26. Stankovičs, ND; Teodorčiks, M.; Ploens, R.; Zips, F.; Schmidt, MH Microglia un asinsvadu mijiedarbība: abpusēji griezīgs zobens smadzeņu patoloģijās. Acta Neuropathol. 2016, 131., 347.–363. [CrossRef]

27. Koniši, H.; Kiyama, H. Microglial TREM2/DAP12 signalizācija: abpusgriezīgs zobens nervu slimībās. Priekšpuse. Šūna. Neirosci. 2018, 12, 206. [CrossRef] [PubMed]

28. Sevigny, J.; Čiao, P.; Bussière, T.; Veinreba, PH; Viljamss, L.; Maiers, M.; Dunstans, R.; Sallovejs, S.; Čens, T.; Ling, Y. Antiviela aducanumabs samazina A plāksnes Alcheimera slimībā. Daba 2016, 537, 50.–56. [CrossRef]

29. Lalli, G.; Šots, JM; Hardijs, Dž.; De Strooper, B. Aducanumab: jauns posms Alcheimera slimības terapeitiskajā attīstībā? EMBO Mol. Med. 2021, 13, e14781.

30. Takata, K.; Kitamura, Y.; Saeki, M.; Terada, M.; Kagitani, S.; Kitamura, R.; Fudžikava, Y.; Maelike, A.; Tomimoto, H.; Taniguchi, T. Galantamīna izraisīts amiloīda klīrenss, ko izraisa mikroglia nikotīna acetilholīna receptoru stimulēšana. J. Biol. Chem. 2010, 285, 40180–40191. [CrossRef] [PubMed]

31. Mandrekars-Koluči, S.; Karlo, JC; Landreth, GE. Mehānismi, kas ir pamatā ātram peroksisomu proliferatora aktivizētam receptoram- -mediētam amiloīda klīrensam un kognitīvā deficīta novēršanai Alcheimera slimības peļu modelī. J. Neurosci. 2012, 32, 10117–10128. [CrossRef]

32. Makgīrs, PL; McGeer, EG Mērķtiecīga mikroglia Alcheimera slimības ārstēšanai. Ekspertu viedoklis. Tur. Mērķi 2015, 19, 497–506. [CrossRef] [PubMed]

33. Dziesma, WM; Colonna, M. Mikrogliju identitāte un funkcija neirodeģenerācijā. Nat. Immunol. 2018, 19, 1048–1058. [CrossRef] [PubMed]

34. Kuo, Y.-H.; Lin, C.-H.; Ši, C.-C. Ergostatrien-3 -ol no Antrodia camphorata inhibē diabētu un hiperlipidēmiju pelēm, kas ārstētas ar augstu tauku diētu, regulējot ar aknām saistītus gēnus, glikozes transportētāju 4 un AMP aktivētu proteīnkināzes fosforilāciju. J. Agric. Food Chem. 2015, 63, 2479–2489. [CrossRef] [PubMed]

35. Le Bourg, E.; Lints, FA Hipergravitācija un novecošanās Drosophila melanogaster. 4. Kāpšanas aktivitāte. Gerontoloģija 1992, 38, 59–64. [CrossRef]

36. Waddell, S.; Quinn, WG Mušas, gēni un mācīšanās. Ann. Rev. Neurosci. 2001, 24, 1283–1309. [CrossRef] [PubMed]

【Lai iegūtu plašāku informāciju:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】