Cistanche Deserticola kā estrogēnu receptoru adjuvanta glikozīdu estrogēnā aktivitāte in vitro

Kontaktpersona: Odrija Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pasts:audrey.hu@wecistanche.com

Hui Song, Wen-Lan Li, Xiang-Ming Sun, Yang Hu, Jing-Xin Ding, Yu-Bin Ji, Jing-Ya Wang

IEVADS

Cistanche deserticola("Rou Cong Rong" ķīniešu valodā), tradicionālas ķīniešu ārstniecības augu zāles, kas pirmo reizi tika reģistrētas ShenNongBenCaoJing, ir izmantotas nieru mazspējas, impotences, senils aizcietējumu un asins trūkuma ārstēšanai tūkstošiem gadu.[1] Tas galvenokārt izplatīts Ķīnas ziemeļrietumu tuksnešainajos reģionos, piemēram, Gansu un Siņdzjanā.[2] Mūsdienu farmakoloģijas pētījumi parādīja, ka C. deserticola var veicināt plašas medicīniskas funkcijas, piemēram, hormonu regulēšanu, imūnmodulējošu, antioksidantu, neiroprotektīvu, pretiekaisuma un estrogēnu darbību.[3,4] Cistanču glikozīdi (GC) tika uzskatīti par vienu no galvenie aktīvie komponenti ar dažādu bioloģisku iedarbību.[5,6]

Estrogēnu receptori (ER) un ER ir ER apakštipi, kas varētu regulēt fizioloģiskās funkcijas.[7] Šie proteīni varētu regulēt mērķa gēnu transkripciju, saistoties ar saistītajām DNS regulējošajām sekvencēm šūnu kodolā. Abi apakštipi ir izteikti izteikti sirds un asinsvadu un centrālajā nervu sistēmā.[8,9] ER galvenokārt pastāv piena dziedzeros, dzemdē, olnīcās, kaulos, vīriešu reproduktīvajā orgānā un prostatā. ER galvenokārt atrodas prostatā, olnīcās un urīnpūslī.[10,11] Turklāt abiem apakštipiem ir dažas kopīgas fizioloģiskas lomas, piemēram, olnīcu attīstībā un darbībā, kā arī sirds un asinsvadu sistēmas aizsardzībā. [12,13] Iepriekšējie pētījumi mūsu grupā atklāja estrogēnu līdzīgu GC mehānismu, izmantojot metabolomiskās analīzes metodi.[14] Nepārtrauktā pētījumā mēs analizējām GC estrogēnās aktivitātes mehānismu MCF-7 šūnu līnijās, kas saistītas ar ER.

MATERIĀLI UN METODES

Instrumenti

ECO-170P-230 inkubators bija no New Brunswick Scientific (China) Co., Ltd., Bio-Rad 680 mikroplašu lasītājs, un elektroforēzes aparāts bija no Bio-Rad Laboratories, Inc., mikroskops CX21 bija no Olympus Co., Ltd. , GIS-2019 gēla attēlveidošanas sistēma bija no Tanon Science and Technology Co., Ltd., plakanā apakšējā plāksne bija no Corning Inc., EPICS-XL plūsmas citometrija bija no Beckman-Coulter Inc. un StepOnePlus Real-Time polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) sistēma bija no Thermo Fisher Scientific.

Ķīmiskās vielas un reaģenti

GC tika sagatavoti mūsu laboratorijā saskaņā ar iepriekš aprakstīto metodi [14], un ar ultravioleto spektrofotometriju tika noteikts, ka GC tīrība ir 52 procenti (akteozīds tika izmantots kā marķieris GC noteikšanai). Estradiols (E2) tika iegādāts no Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Šanhaja, Ķīna). Liellopu augļa serums (FBS) un RPMI-1640 bija no Gibco Co., Ltd., 96 iedobju plakanā dibena plāksne bija no Corning Inc., un dimetilsulfoksīds (DMSO) un 3-[4,5-dimetil-2-tiazolils ]-2,5-difeniltetrazolija bromīds (MTT) tika iegādāts no Sigma-Aldrich Corporation. TRIzol reaģents, reversās transkripcijas (RT) komplekts un TB Green™ RT-PCR komplekts tika iegādāti no TaKaRa Co., Ltd., Dalian, Ķīna. Anti-ER Rabbit pAb, anti-ER Rabbit pAb un aktīna antivielas tika iegādātas no Wanlei Biotechnology Co., Ltd. Visas pārējās izplatītās ķīmiskās vielas tika iegādātas no standarta komerciāliem piegādātājiem.

Parauga sagatavošana

Cistanches izejas šķīduma glikozīdu sagatavošana

GCs ekstrakts tika izšķīdināts DMSO, lai pagatavotu izejas šķīdumu ar koncentrāciju 0,1051 g/ml un uzglabāts 4 grādu temperatūrā. Fenolsarkano nesaturošais RPMI-1640 tika izmantots, lai pirms lietošanas izejas šķīdumu atšķaidītu dažādās koncentrācijās.

Estradiola izejas šķīduma pagatavošana

E2 ekstrakts tika izšķīdināts DMSO, lai iegūtu izejas šķīdumu ar koncentrāciju 0,27 mg/ml un uzglabāts 4 grādu temperatūrā. Fenolsarkano nesaturošais RPMI-1640 tika izmantots, lai pirms lietošanas izejas šķīdumu atšķaidītu dažādās koncentrācijās.

Ar kokogles dekstrānu apstrādāta liellopu augļa seruma sagatavošana

Simtiem mililitru FBS tika sajaukti ar 250 mg aktīvās ogles pulvera un 25 mg dekstrāna. Pēc 45 minūšu inkubācijas 55 grādu temperatūrā maisījumu centrifugēja 4 grādu temperatūrā, 1000 apgr./min 15 minūtes. Supernatants tika filtrēts, izmantojot Millipore Express PES membrānu, lai iegūtu ar kokogles dekstrānu apstrādātu (CDT)-FBS, un uzglabāts -20 grādu temperatūrā.

Šūnu kultūra

Cilvēka krūts vēža MCF-7 šūnu līnijas tika iegūtas no Amerikas tipa kultūras kolekcijas (ATCC). Turklāt šūnas tika kultivētas ar RPMI-1640 barotni, kas satur 10 procentus FBS un 1 procentu penicilīna-streptomicīna 37 grādu temperatūrā mitrinātā 5 procentu CO2 atmosfērā. Šūnas 4 dienas pirms MTT testa tika kultivētas fenolsarkano nesaturošā RPMI-1640 barotnē, kas satur 5 procentus CDT-FBS, lai šūnās būtu jāiztīra estrogēns.

Estradiola šūnu proliferācijas analīze MCF{0}} šūnu līnijās

Šūnu proliferācija tika mērīta, izmantojot MTT testu MCF-7 šūnām.[15,16] E2 tika izšķīdināts RPMI-1640 barotnē, kas satur 0,1 procentu DMSO pie galīgās koncentrācijas {{27 }}.1, 1, 10, 100 un 1000 nM. MCF-7 šūnu līnijas 4 dienas tika kultivētas RPMI-1640 barotnē, kas nesatur fenolu. Pēc trīs reizes mazgāšanas ar fosfātu buferšķīdumu (PBS), 100 µl FBS nesaturošas RPMI-1640 barotnes pievienoja 96 iedobju plāksnēm ar 1,5 × 104 katrā iedobē un inkubēja 37 grādu temperatūrā 24 stundas. Pēc tam šūnas 72 stundas apstrādāja ar dažādām E2 šķīduma koncentrācijām. Pēc tam katrai iedobei pievienoja 100 µL MTT šķīduma (0,5 mg/ml). Šūnas tika inkubētas 4 stundas. Visbeidzot, lai izšķīdinātu formazāna kristālus, pievienoja 150 µL DMSO. Absorbcija tika mērīta pie 570 nm ar mikroplašu lasītāju, un tika aprēķināts proliferācijas ātrums (PR).

Cistanches glikozīdu šūnu proliferācijas analīze MCF-7 šūnu līnijās

Šūnu proliferācija tika mērīta, izmantojot MTT testu MCF-7 šūnām. GC tika izšķīdināti RPMI-1640 barotnēs, kas satur 0,1 procentu DMSO, gala koncentrācijās 0.0175, 0,175, 1,75, 17,5 un 175 µg /ml. MCF-7 šūnu līnijas 4 dienas tika kultivētas RPMI-1640 barotnē, kas nesatur fenola sarkanu, kas satur 5 procentus CDT-FBS. Pēc trīs reizes mazgāšanas ar PBS, 100 µL FBS nesaturošas RPMI-1640 barotnes pievienoja 96 iedobju plāksnēm ar 1,5 × 104 katrā iedobē un inkubēja 37 grādu temperatūrā 24 stundas. Pēc tam šūnas tika apstrādātas ar dažādām GC šķīduma koncentrācijām attiecīgi 24, 48 un 72 stundas. Pēc tam katrai iedobei pievienoja 100 µL MTT šķīduma (0,5 mg/ml). Šūnas tika inkubētas 4 stundas. Visbeidzot, lai izšķīdinātu formazāna kristālus, pievienoja 150 µL DMSO. Absorbciju mērīja pie 570 nm ar mikroplašu lasītāju, un tika aprēķināts PR. Fenolsarkano nesaturošā RPMI-1640 un barotne, kas satur E2 (2,725 × 10–3 µg/ml), bija attiecīgi negatīvā un pozitīvā grupa.

Cistanches glikozīdu šūnu proliferācijas analīze ar fulvestrantu uz MCF{0}} šūnu līnijām

Šūnu proliferācija tika mērīta, izmantojot MTT testu MCF-7 šūnām. GC tika izšķīdināti RPMI-1640 barotnēs, kas satur 0,1 procentus DMSO gala koncentrācijās 1,75, 17,5 un 175 µg/ml. MCF-7 šūnu līnijas 4 dienas tika kultivētas RPMI-1640 barotnē, kas nesatur fenola sarkanu, kas satur 5 procentus CDT-FBS. Pēc trīs reizes mazgāšanas ar PBS, 100 µL FBS nesaturošas RPMI-1640 barotnes pievienoja 96 iedobju plāksnēm ar 1,5 × 104 katrā iedobē un inkubēja 37 grādu temperatūrā 24 stundas. Pēc tam šūnas tika apstrādātas ar dažādām GC šķīduma koncentrācijām un inkubētas ar fulvestrantu (6, 06 × 10–5 µg / ml) 48 stundas. Pēc tam katrai iedobei pievienoja 100 µL MTT šķīduma (0,5 mg/ml). Šūnas tika inkubētas 4 stundas. Visbeidzot, lai izšķīdinātu formazāna kristālus, pievienoja 150 µL DMSO. Absorbciju mērīja pie 570 nm ar mikroplašu lasītāju, un tika aprēķināts PR. Fenolsarkano nesaturošā RPMI-1640 un barotne, kas satur E2 (2,725 × 10–3 µg/ml), bija attiecīgi negatīvā un pozitīvā grupa.

Šūnu cikla tests

GC tika izšķīdināti RPMI-1640 barotnēs, kas satur 0,1 procentus DMSO gala koncentrācijās 1,75, 17,5 un 175 µg/ml. MCF-7-šūnu līnijas 4 dienas kultivēja fenolsarkano nesaturošā RPMI-1640 barotnē, kas satur 5 procentus CDT-FBS. Pēc trīs reizes mazgāšanas ar PBS, 1 ml FBS nesaturošas RPMI-1640 barotnes pievienoja 6 iedobju plāksnēm ar 2,5 × 105 katrā iedobē un inkubēja 37 grādu temperatūrā 24 stundas. Pēc tam šūnas tika apstrādātas ar dažādām GC šķīduma koncentrācijām un inkubētas ar fulvestrantu (6, 06 × 10–5 µg / ml) 48 stundas. Pēc tam šūnas tika savāktas un trīs reizes mazgātas ar PBS, centrifugētas pie 4 grādiem, 1000 apgr./min 10 minūtes un fiksētas ar 70% etanolu pie -20 grādiem uz nakti. Pēc divreiz mazgāšanas ar PBS šūnas tika iekrāsotas ar PI šķīdumu (50 mg / ml), kas satur 1 mg / ml RNāzes A un 0, 1% Triton X-100, 30 minūtes tumsā 4 grādu temperatūrā. Šūnu cikls tika noteikts, izmantojot plūsmas citometriju, un proliferācijas indekss (PI) tika aprēķināts šādi. Fenolsarkano nesaturošā RPMI-1640 un barotne, kas satur E2 (2,725 × 10–3 µg/ml), bija attiecīgi negatīvā un pozitīvā grupa. PI=(S plus G2 M)/(G0 /G1 plus S plus G2 M) × 100 procenti

RNS izolācija un reālā laika kvantitatīvā polimerāzes ķēdes reakcijas analīze

Lai izmērītu mRNS līmeni, tika izmantots RT kvantitatīvs PCR (qPCR) tests. Kopējā šūnu RNS tika ekstrahēta ar TRIzol reaģentu. qPCR gadījumā RNS tika reversi transkribēta uz cDNS no 4 µg kopējās RNS, izmantojot RT komplektu. RT-PCR analīzes tika veiktas, izmantojot TB Green™ RT-PCR komplektu. Visi protokoli tika veikti saskaņā ar ražotāja norādījumiem. ER pastiprināšanai izmantotais primer pāris bija 5'-GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG-3' (uz priekšu) un 5'-TGGCTGGACACATATAGTCGTT-3' (reverss); ER pastiprināšanai izmantotais praimeru pāris bija 5'-AGTGCCGCTCTTGGAGAGCTG-3' (uz priekšu) un 5'-CCTGGGTCGCTGTGACCAGA-3' (reverss). PCR apstākļi ER un ER bija 94 grādi 3 minūtes, kam sekoja attiecīgi 37 un 40 cikli: 94 grādi 30 sekundes, 58 grādi 2 minūtes un 72 grādi 2 minūtes. GAPDH pastiprināšanai izmantotais praimeru pāris bija 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3' (uz priekšu) un 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3' (reverss). PCR apstākļi GAPDH bija 94 grādi 3 minūtes, kam sekoja 30 cikli 94 grādi 30 sekundes, 58 grādi 2 minūtes un 72 grādi 2 minūtes. Katru reizi RT-qPCR eksperiments tika atkārtots vairāk nekā divas reizes. Šim nolūkam GAPDH tika izmantots kā iekšējā kontrole. Tika aprēķināta transfektantu ER /ER relatīvā gēnu ekspresija attiecībā pret kontroles šūnām: 2−(∆∆Ct).

Western blotēšana

ER un ER proteīnu ekspresija tika noteikta ar Western blot analīzi kā ziņoto metodi ar nelielām modifikācijām. Īsumā, MCF-7 šūnas tika audzētas 6 iedobju plāksnēs ar 2,5 × 105 šūnām katrā iedobē un apstrādātas ar GC galīgajā koncentrācijā 1,75, 17,5 un 175 µg/ml attiecīgi 48 stundas. Pēc inkubācijas visu šūnu ekstrakti tika sagatavoti, izmantojot RIPA buferšķīdumu, kas satur 1 mM PMSF. Olbaltumvielas veselu šūnu ekstraktos tika atdalītas ar 12% nātrija dodecilsulfāta-poliakrilamīda gēla elektroforēzi un pēc tam pārnestas uz polivinilidēna difluorīda membrānām. Membrāna tika bloķēta ar 5% (w/v) vājpienu, kas izšķīdināts TBST buferšķīdumā, un pēc kārtas inkubēja ar primārajām un sekundārajām antivielām. Tika novērotas saistītās antivielas.

Statistiskā analīze

Rezultāti tika izteikti kā vidējās vērtības un standarta novirzes, un statistiskā nozīmība tika noteikta, izmantojot Stjudenta t-testu ar SPSS 21.{1}} programmatūru (IBM Co., Ltd. America). P<0.05 was="" considered="" statistically="">

REZULTĀTI

Pēc 24 stundu ilgas E2 apstrādes MCF-7 šūnu proliferācija acīmredzami uzlabojās [1.a attēls]. 10 nM E2 šķīduma acīmredzami varētu stimulēt šūnu augšanu (123,89 procenti). Tomēr, palielinoties E2 koncentrācijai, šūnu proliferācijas spēja vājinājās. Tādējādi 10 nM bija optimālā E2 koncentrācija šajā eksperimentā.

GC grupa koncentrācijās 1,75, 17,5 un 175 µg/mg varēja uzlabot MCF-7 šūnu līniju proliferāciju atkarībā no laika un devas, un tai bija būtiska atšķirība ar negatīvo grupu [1.b attēls]. Salīdzinot ar negatīvo grupu, E2 grupai bija acīmredzama izplatība (120,06 procenti).

Kombinētā medikamentu grupa (CMG) (fulvestrants ar E2 vai GC) CDT-FBS barotnē tika inkubēts ar MCF-4 šūnām. Pēc 72 h inkubācijas CMG var izraisīt PR slīpumu salīdzinājumā ar individuālo medikamentu grupu (IMG) (P < 0,01)="" [1.c="">

Plūsmas citometrijas analīze parādīja, ka GC var nedaudz palielināt PI vērtību, kas liecina, ka GC varētu virzīt G{{0}}/G1 fāzes šūnas uz S un G2/M fāzēm [2. attēls un 1. tabula] un veicināt šūnu DNS. sintēze. Rezultāts, kas norāda, ka GC mehānisms uz MCF-7 bija līdzīgs E2. CMG (fulvestrants ar GC) šūnu PI PI vērtība nedaudz samazinājās līdz IMG vērtībai (P <>

RT-PCR analīze liecināja, ka ER un ER mRNS ekspresijas palielinājās, salīdzinot ar kontroles grupu (P < 0.01) atkarībā no devas pēc 48 stundu ilgas apstrādes ar dažādu koncentrāciju GC [attēls 3a un b].

Western blot rezultāts, kas norāda, ka pēc apstrādes ar dažādām GC koncentrācijām 48 stundas, ER un ER proteīnu saturs MCF-7 palielinās, palielinoties GC atkarībā no devas [3c-e attēls]

SECINĀJUMS

Šajā pētījumā GC ietekme uz MCF-7 proliferāciju un šūnu ciklu tika pārbaudīta ar attiecīgi MTT un plūsmas citometrijas metodi. GC varētu palielināt MCF-7 šūnu proliferāciju 1,75, 17,5 un 175 µg/ml koncentrācijā pēc 72 stundu inkubācijas. Tomēr pieaugumam ir tendence palēnināties, kad CC un fulvestrants tika lietoti kopā. GC varētu palielināt MCF-7 šūnu PI vērtību, samazināt G1 fāzes šūnu un palielināt S un G2 fāzes šūnu.

Fulvestrants ir ER specifisks antagonists, kas bloķē ER kodola lokalizāciju, pasliktinot receptoru dimerizāciju un no enerģijas atkarīgo kodola transportu.[17] Šajā pētījumā secinājums apstiprināja, ka fulvestrants var vājināt GC proliferāciju uz MCF-7 šūnām un var ietekmēt šūnu cikla transformāciju. Tādējādi šis pētījums norādīja uz GC estrogēnu aktivitāti, un arī ER ir GC mērķis. RT-PCR un Western blot eksperimentā ER un ER mRNS un olbaltumvielu ekspresija MCF-7 šūnās palielinājās, palielinoties GC koncentrācijai. Tādējādi GC var spēlēt lomu estrogēnā aktivitātē saskaņā ar pārregulētu ER un ER mRNS un proteīniem.