1. daļa Cistanche Tubulosa iegūto feniletanola glikozīdu profilaktiskā ietekme uz liellopu seruma albumīna izraisītu aknu fibrozi žurkām

Kontaktpersona: Odrija Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pasts:audrey.hu@wecistanche.com

Abstrakts

Fons:Cistanche tubulosa ir tradicionāls ķīniešu augu izcelsmes zāles, ko plaši izmanto imunitātes regulēšanai.Feniletanola glikozīdi no cistanche(CPhG) no šī auga galvenokārt ir efektīvie materiāli. Šī pētījuma mērķis bija novērtēt CPhG profilaktisko un terapeitisko iedarbību uz BSA izraisītu aknu fibrozi žurkām un saistītos molekulāros mehānismus, kas ietver aknu zvaigžņu šūnas. Biejiarangan (BJRG), vēl viena tradicionālā ķīniešu augu izcelsmes medicīna, tika izmantota kā pozitīva kontrole. Metodes: in vivo eksperimentos 75 SD žurkas tika nejauši sadalītas 6 grupās: normālas (ar destilētu ūdeni apstrādātas), modelis (ar BSA apstrādātas), pozitīvas zāles (ar BSA apstrādātas un BJRG 60{{29} } mg/kg/dienā) un ar BSA ārstētām un CPhG (125, 250 un 500 mg/kg/dienā) grupām. Aknu un liesas rādītāji, aspartātaminotransferāzes (AST), alanīna aminotransferāzes (ALAT), heksadecēnskābes (HA), laminīna (LN), III tipa prokolagēna (PCIII), IV tipa kolagēna (IV-C), hidroksiprolīna ( Hyp) un transformējošais augšanas faktors 1 (TGF- 1) tika mērīts žurku aknās. Katrai grupai tika novērtētas aknu fibrozes histopatoloģiskās pakāpes, izmantojot H&E un Massona trihroma krāsošanu. TGF- 1, kolagēna I (Col-I) un kolagēna III (Col-III) ekspresija tika noteikta ar imūnhistoķīmiskās krāsošanas metodi. Šie efekti tika tālāk novērtēti in vitro, nosakot NF-κB p65 un Col-I ekspresijas līmeņus ar kvantitatīvām reālā laika PCR analīzēm. Col-I proteīna ekspresija tika pārbaudīta arī ar Western blot metodi. Rezultāti: visas CPhG devu grupas (125, 250 un 500 mg/kg/dienā) būtiski samazināja aknu un liesas indeksu, pazemināja ALAT, ASAT, HA, LN, PCIII, IV-C līmeni serumā, TGF- 1 saturs (P < 0,01,="" p="">< 0,01="" un="" p="">< 0,01)="" un="" hyp="" saturs.="" cphg="" arī="" ievērojami="" mazināja="" aknu="" šūnu="" pietūkumu="" un="" efektīvi="" novērsa="" hepatocītu="" nekrozi="" un="" iekaisuma="" šūnu="" infiltrāciju.="" imūnhistoķīmiskie="" rezultāti="" parādīja,="" ka="" cphg="" būtiski="" samazināja="" tgf-="" 1="" (p="">< 0,01,="" p="">< 0,01="" un="" p="">< 0,01),="" col-i="" un="" col-iii="" ekspresiju.="" cphg="" (100,="" 75,="" 50="" un="" 25="" ug/ml)="" in="" vitro="" ietekme="" uz="" hsc-t6="" parādīja,="" ka="" cphg="" ievērojami="" samazināja="" nf-κb="" p65="" un="" col-i="" mrns="" ekspresiju,="" un="" cphg="" arī="" pazemināja="" col-i="" proteīna="" ekspresiju.="" secinājumi:="" cphg="" ir="" nozīmīga="" pretaknu="" fibrozes="" iedarbība,="" un="" tos="" var="" izmantot="" kā="" hepatoprotektīvus="" līdzekļus="" aknu="" fibrozes="">

Atslēgvārdi: Aknu fibroze, Cistanche tubulosa, Feniletanola glikozīds, Chemokine BSA, Profilakse un terapija.

Fons

Aknu fibroze ir brūču dzīšanas reakcija uz smagu aknu bojājumu, kas rodas dažādu faktoru izraisīta hroniska hepatīta patoģenēzē. Šie faktori ir vīrusu infekcija, pārmērīga alkohola lietošana, holestāze un vielmaiņas un autoimūnas slimības [1–3]. Progresīva ekstracelulārās matricas (ECM) uzkrāšanās un samazināta remodelācija izjauc normālu aknu arhitektūru, izraisot aknu fibrozi [4]. Aknu fibroze ir kritiska hroniskas aknu slimības gadījumā un bieži attīstās par neatgriezenisku cirozi un kanceroģenēzi. Pašlaik nav metožu vai efektīvu zāļu aknu fibrozes ārstēšanai. Tāpēc ir steidzami jāatrod zāles pret aknu fibrozi, kas mazinās aknu bojājuma progresēšanu līdz fibrozei un vēzim.Cistanche tubulosaW (no Orobanchaceae dzimtas) ir parazitārs augs, ko plaši audzē Sjiņdzjanas dienvidu reģionā Ķīnā [5]. Cilvēki to parasti izmanto, lai uzmundrinātu nieres, barotu asinis, atslābinātu zarnas un aizkavētu novecošanos. Tas ir oficiāli iekļauts Ķīnas farmakopejā [6]. C. tubulosa satur dažādas aktīvās sastāvdaļas. Tie ietverFeniletanola glikozīdi no cistanche(CPhG), iridoīdi un polisaharīdi. Kā viens no daudzajiem aktīvajiem komponentiemC. tubulosa, CPhG ir uzrādījuši pārliecinošu antioksidantu, pretnoguruma, neiroprotektīvu un pretiekaisuma iedarbību gan in vivo, gan in vitro pētījumos [7]. Pēdējos gados ir ziņots, ka CPhG(Feniletanola glikozīdi no cistanche) ir hepatoprotektīva iedarbība. Potenciālie mehānismi, kas ir šīs ietekmes pamatā, ir brīvo radikāļu noņemšana, aknu membrānu aizsardzība, imūnregulācija, apoptozes inhibīcija, HBsAg un HBeAg ekspresijas kavēšana, HBV DNS replikācijas kavēšana un citi [8–11]. Tomēr daži pētījumi literatūrā attiecas uz grafikas anti-aknu fibrozes efektu. Tāpēc šī pētījuma mērķis bija izpētīt GPhC anti-aknu fibrozes efektu, izmantojot govju seruma albumīna (BSA) izraisītas aknu fibrozes modeli žurkām. Saistītie molekulārie mehānismi tika pētīti HSC-T6 šūnās.

Metodes

Ķīmiskās vielas un reaģenti

Hidroksiprolīna komplekts (sārma hidrolīze) (partija: 20140616) tika iegādāts no Nanjing Jiancheng Bioinženierijas institūta (Ķīna). Žurku TGF- 1 sviestmaižu ELISA komplekti (sērija: 238240615) tika iegādāti no Lianke Biotech Co., Ltd. (Ķīna). Trušu anti-kolagēna I antivielu (partija: 140619), trušu anti-kolagēna III antivielu (sērija: 980788 W) un truša anti-TGF- 1 antivielu (sērija: 140619) nodrošināja Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., LTD (Ķīna). Komplektā ar parasto aitas serumu (darba šķidrumu) (partija: WP141214), PV-6000 (partija: WK141225) un DAB komplektu (partija: K136621D) iegādājās no Zhongshan Golden Bridge Biotech Co., Ltd. (Ķīna). . Primāro antivielu noteikšana tika veikta, izmantojot 2. Antivielu šķīdumu (Alk-Phos. Conjugated, Anti-rabbit) un 2. Antivielu šķīdumu (Alk-Phos. Conjugated, Anti-mouse) (partija: 272387), kas iegādāts no Invitrogen Company (ASV). ). Liellopu seruma albumīns (BSA) (partija: SLBG8239V) tika iegādāts no Sigma (ASV). Pirms lietošanas BSA sagatavoja 18 g/l normālā fizioloģiskā šķīdumā, baktērijas noņēma filtrējot un uzglabāja BSA 4 grādu temperatūrā. Freunda nepilnīgais adjuvants, kas satur 1 g lipīdu no aitas matiem (partija: AF0220LA14, Shanghai juaņa ye Bio-Technology Co., Ltd. (Ķīna), tika sajaukts ar 2 g šķidrā parafīna (partija: 20130815, Tianjin Fuyu, Fine Chem. Ltd. (Ķīna), sterilizēts tvaika autoklāvā un uzglabāts 4 grādu temperatūrā. Pozitīvās zāles BJRG tika iegūtas kā Biejiarangan tabletes no Inner Mongolia Furui Medical Science Co., Ltd. (Ķīna). BJRG zāļu krājumus sagatavoja, izšķīdinot BJRG tabletes destilētā ūdenī ar koncentrāciju 600 mg/kg.

Augu materiāli

C. tubulosa(Orobanchaceae ģimene) tika iegādāts no Ķīnas Sjiņdzjanas Minfengas reģiona. Materiālu autentificēja pētnieks Jun Zhao no Sjiņdzjanas Materia Medica institūta Uiguru medicīnas galvenās laboratorijas. Vaučeru paraugi tika deponēti Sjiņdzjanas Materia Medica institūtā.

CPhG sagatavošana(Feniletanola glikozīdi no cistanche)

Žāvēti un sagriezti sakneņi noC. tubulosa(60 kg) tika pēc kārtas trīs reizes ekstrahēti ar atteci ar 70 procentiem etanola, un šķīdinātājs tika noņemts, lai iegūtu etanola ekstraktu. Etanola ekstrakti tika attīrīti, izmantojot AB-8 sveķus, lai iegūtu feniletanola glikozīdus (CPhG). CPhG izejas šķīdumi, ko izmantoja dažādām devu grupām pētījumos ar dzīvniekiem (attiecīgi 500 mg/kg, 250 mg/kg un 125 mg/kg), tika izšķīdināti 0,5 procentos (5 g/l) karboksimetilcelulozē (nātrija sāls).

CPhG kvantitatīva noteikšana(Feniletanola glikozīdi no cistanche)

Divu komponentu (ehinakozīda un akteozīda) saturs CPhG tika noteikts ar HPLC, izmantojot iepriekš aprakstīto metodi (Zhang et al. 2004) [12]. HPLC tika veikta, izmantojot Shimadzu LC-10A HPLC, kas aprīkots ar UV detektoru. HPLC kolonna bija Phenomenex Gemini ODS kolonna (250 × 4,6 mm, 5 μm). Izokrātiskā kustīgā fāze sastāvēja no metanola-acetonitrila -1 procentiem etiķskābes (15:10:75, v/v/v). Elucija notika 40 minūtes, un plūsmas ātrums tika uzturēts 0, 6 ml / min. Kolonnas temperatūra tika uzturēta nemainīga 30 grādos. UV noteikšana bija pie 334 nm.

Dzīvnieki un HSC-T6 šūnu līnija

[Grade SPF] veseli pieauguši Sprague–Dawley (SD) žurku tēviņi (180–220 g) tika iegādāti no Sjiņdzjanas Medicīnas universitātes dzīvnieku centra, licences Nr.: SCXK (jauns) 2011–0004. Žurkas tika barotas ar specifisku patogēnu brīvu (SPF) ēdienu. Visas procedūras, kas saistītas ar eksperimentiem ar dzīvniekiem, apstiprināja Sjiņdzjanas Medicīnas universitātes Pirmās saistītās slimnīcas Dzīvnieku ētikas komiteja. Žurkas tika izmitinātas būros kontrolētos vides apstākļos (25 grādi un 12 stundu gaismas/tumsas cikls), un tām bija brīva piekļuve standarta žurku granulu barībai un krāna ūdenim. Žurkas pirms ārstēšanas tika aklimatizētas. Iemūžināta žurku aknu zvaigžņu šūnu līnija HSC-T6 tika iegūta no Wuhan Procell Gene Biotechnology Co., LTD. (Uhaņa, Ķīna). HSC-T6 šūnas tika kultivētas Dulbecco modificētajā ērgļa barotnē (augsts glikozes līmenis) (DMEM, Pekina, Ķīna), kas papildināts ar 10% liellopu augļa serumu (Gibco, Dienvidamerika), 100 SV/ml penicilīna un 100 ug/ml streptomicīnu (Beijingomicīns). , Ķīna) mitrinātā inkubatorā 37 grādu temperatūrā ar 5 procentiem CO2.

BSA izraisīts aknu bojājums un ārstēšana

Septiņdesmit piecas SD žurkas tika nejauši sadalītas sešās grupās: parastās (apstrādātas ar destilētu ūdeni), modelis (BSAT apstrādātas), pozitīvās zāles (ar BSA apstrādātas plus BJRG 600 mg/kg/dienā) un ar BSA apstrādātas un CPhG.(Feniletanola glikozīdi no cistanche)(125, 250, 5{{20}}0 mg/kg/dienā). Ar BSA ārstētām un CPhG (125, 250, 500 mg/kg/dienā) grupām katrā grupā bija 13 žurkas, bet otrā grupā bija 12 žurkas katrā grupā. BSA izraisītu aknu bojājumu modelis ir sadalīts primārajā sensibilizēšanā, kam seko imunoloģiska lēkme) [13]. Izņemot parasto grupu, pārējām grupām tika ievadītas vairākas subkutānas injekcijas ar 0,5 ml (9 mg/ml) BSA Freunda nepilnīgo adjuvantu 1., 15., 22., 29. un 36. dienā primārai sensibilizācijai. Septiņas dienas pēc piektās injekcijas asinis tika iegūtas caur žurku tīklenes vēnu pinumu un pārbaudītas seruma albumīna antivielas. BSA antiviela žurku serumā tika noteikta ar dubultās agara difūzijas metodi. Uzbrukuma injekcija tika veikta, ievadot 0, 4 ml BSA normālā fizioloģiskā šķīdumā caur astes vēnu BSA antivielu pozitīvām žurkām divas reizes nedēļā desmit reizes. Koncentrācijas un injekciju laiki bija 5.00, 5.50, 6.00, 6.50, 7.00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 un 10.00 g/l attiecīgi 46., 50., 53., 57., 60., 64., 67., 71., 74. un 78. dienā. Parastā grupā imunoloģiskām primārajām (sensibilizācijas) un sekundārajām (uzbrukuma) injekcijām tika izmantots normāls fizioloģiskais šķīdums BSA vietā, un citi apstākļi bija tādi paši kā modeļu grupā. Parastajai grupai iekšķīgi ievadīja destilētu ūdeni ar devu 10 ml/kg/dienā. Modeļa grupai perorāli tika ievadīts 10 ml/kg/dienā 0,5% CMC-Na šķīdums. Pozitīvā zāļu grupa tika iekšķīgi ievadīta 600 mg / kg dienā BJRG. Ar BSA apstrādātie plus CPhG (125,

250 un 500 mg/kg/dienā) grupām perorāli tika ievadītas CPhG 125, 250 un 500 mg/kg/dienā.(Feniletanola glikozīdi no cistanche), attiecīgi. Dienas devas žurkām turpināja divas nedēļas pēc pēdējās injekcijas. Pēc eksperimenta perioda žurkas tika badā 12 stundas pirms 10% hlorālhidrāta un pēc tam nekavējoties eitanāzija. Seruma paraugi tika savākti no katras žurkas un nekavējoties izmantoti. Aknas tika novāktas diviem mērķiem: (1) saglabāšanai šķidrā slāpeklī Hyp komplektiem un (2) fiksācijai 10 procentu formaldehīdā histoloģiskiem un imūnhistoķīmiskiem izmeklējumiem. Viss pētījumu ar dzīvniekiem ilgums bija 93 dienas.

Aknu un liesas indeksi

Aknas un liesa tika atdalītas ar laparotomiju un mazgātas ar 4 grādu normālu fizioloģisko šķīdumu. Pēc liekā ūdens absorbēšanas ar filtrpapīru, aknas un liesa tika nosvērtas, lai aprēķinātu atbilstošos rādītājus: orgāna relatīvā masa=orgāna masa (g)/individuāla ķermeņa masa (g) × 100 procenti [14].

Šūnu eksperimenti

HSC-T6 šūnas tika izklātas 96-iedobes plāksnē. Sākotnēji šūnas 48 stundas kultivēja ar DMEM, kas satur 10 procentus FBS. Pēc tam barotne tika aizstāta ar DMEM bez FBS, lai šūnas badotu 12 stundas. Pēc tam šūnas 24 stundas kultivēja ar DMEM, kas satur 5,0 ng/ml TGF- 1 (bez FBS). Visbeidzot, dažādas CPhG koncentrācijas(Feniletanola glikozīdi no cistanche)(100 ug/ml, 50 ug/ml un 25 ug/ml), akteozīds (6 ug/ml, 3 ug/ml un 1,5 ug/ml) un ehinakozīds (500 ug/ml, 250 ug/ml un 125 ug/ml) tika veiktas plāksnē četros eksemplāros un inkubētas 48 stundas.

Reāllaika PCR analīze

NF-κB, p65 un kolagēna I mRNS ekspresijas līmenis tika noteikts ar reāllaika PCR. Lai noteiktu mRNS ekspresiju HSC-T6 šūnās, šūnas (4 × 105 šūnas) tika iesētas sešu iedobju plāksnēs ar 3 ml DMEM ar 10% FBS un inkubētas nakti 37 grādu temperatūrā un 5% CO2, pēc tam šūnu kultūras barotne. tika mainīti uz serumu nesaturošu DMEM. Tālāk, CPhGs(Feniletanola glikozīdi no cistanche)(100 ug/ml, 50 ug/ml un 25 ug/ml), akteozīds (6 ug/ml, 3 ug/ml un 1,5 ug/ml) un ehinakozīds (500 ug/ml , 250 ug/ml un 125 ug/ml) tika pievienoti iedobēm. Pēc 48 stundu inkubācijas ar CPhG vai monomēru kompozīcijām kopējā RNS tika ekstrahēta, izmantojot TRIzol reaģentu (Invitrogen, ASV), un enerģiski maisīja ar hloroformu 15 sekundes. Pēc 3 minūšu nostādināšanas istabas temperatūrā lizātu centrifugēja pie 12, 000 × g 15 minūtes 4 grādu temperatūrā. RNS ūdens fāzē tika izgulsnēts ar izopropanolu, un augšējā ūdens fāze tika pārnesta uz jaunu mikrocentrifūgas mēģeni. RNS tika izgulsnēts, pievienojot 0,75% etanola, pēc tam mikrocentrifūgas cauruli un centrifugēja pie 12,000 × g 4 grādu temperatūrā ne ilgāk kā 5 minūtes. Supernatants tika noņemts un RNS tika žāvēts istabas temperatūrā 5–10 minūtes. Īpaši praimeru komplekti (Sangona, Šanhaja, Ķīna), kas tika izmantoti žurku aktīna [GenBank: NM_031144.3], kolagēna I [GenBank: NM_ 053304.1] un NF amplifikācijai. -κB p65 [GenBank: NM_199267.2] gēni tika izstrādāti, izmantojot Batch Primer 3. Uz priekšu (fw) un reverse (rv) praimeri bija šādi: Kolagēns I (fw: GGA GAG AGC ATG ACC GAT GG , rv: GGG ACT TCT TGA GGT TGC CA), NF-κB p65 (fw: CAT ACG CTG ACC CTA GCC TG, rv: TTT CTT CAA TCC GGT GGC GA), -aktīns (fw: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GAT G, rv: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). Rezultāti tika normalizēti ar mājturības gēna aktīna mRNS kā iekšējo kontroli un tiek parādīti kā relatīvie mRNS līmeņi. Reakcijas tika veiktas ar 8 μL iQ SYBR Green Supermix, 1 μL 10 pM praimeru pāri, 8, 5 μL destilēta ūdens un 2, 5 μL cDNS. Katra polimerāzes ķēdes reakcija tika veikta šādos apstākļos: 95 grādi 3 minūtes, pēc tam 40 cikli pa 10 s pie 95 grādiem, 30 s pie 55 grādiem un 10 s pie 55 grādiem – 95 grādiem pagarinājumam, kam sekoja viena fluorescences mērījums. . Galīgie rezultāti tika aprakstīti ar relatīvajām vērtībām (2-ΔΔCt). Aprēķinus un analīzi veica iQ5 reāllaika PCR noteikšanas sistēma.

Western blot analīze

Kolagēna I (Abcam, Kembridža, Apvienotā Karaliste, Art Nr.: ab34710) proteīna ekspresijas līmeņi tika noteikti ar Western blot metodi [ar -aktīnu (partija: 60008-1-lg; Proteintech, Ķīna) kā mājturības kontroli. Veselu šūnu ekstrakti tika sagatavoti, izmantojot radioimmunoprecipitācijas testu (RIPA) (Thermo Scientific, ASV) buferšķīdumu ar 1 procentu Halt proteāzes inhibitoru kokteili (Thermo Scientific, ASV) un 1 procentu Halt fosfatāzes inhibitoru kokteiļiem (Thermo Scientific, ASV). Olbaltumvielu koncentrācija tika mērīta un kvantitatīvi noteikta ar Bredfordas metodi [18]. Olbaltumvielas (10–50 ug) tika atdalītas uz 10 procentu SDS-PAGE gēla un pārnestas uz PVDF membrānām (Millipore, ASV). Membrānas tika bloķētas 1 stundu istabas temperatūrā ar 5% BSA, un primārās antivielas (Anti-Colla gen I antivielas, 1:200 atšķaidījums vai peles mAb no -aktīna, 1:5000 atšķaidījums) tika inkubētas 4 grādu temperatūrā nakti. Atbilstošais Alk-Phos. konjugētās sekundārās antivielas tika inkubētas istabas temperatūrā. Visbeidzot, membrānas trīs reizes nomazgāja ar 1 × Tris-HCl fizioloģisko šķīdumu ar 0, 1 procentu Tween 20, un signālus skenēja un vizualizēja ar GEL DOC XR attēlveidošanas sistēmu (Bio-Rad). Densitometriskā analīze tika veikta interesējošajiem proteīniem un normalizēta līdz aktīnam ar GEL DOC Image Studio programmatūru (Bio-Rad). - aktīns tika izmantots kā iekšējā kontrole.

Statistiskā analīze

Normalitātes pārbaudei tika izmantots Shapiro-Wilk normalitātes tests un Levēna dispersijas homogenitātes tests, un You et al. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences (2015) 23:52 4. lpp. no 13 dispersijas viendabīgums. Dispersijas analīze (ANOVA), kam sekoja Tukey's post hoc tests, tika izmantota, lai noteiktu statistiskās atšķirības nehomogēniem, normāli sadalītiem datiem. Kruskal-Wallis neparametrisko testu izmantoja, lai analizētu datus, kas nav normāli sadalīti vai viendabīgi. Rezultāti tika izteikti kā vidējais ± SD. Nozīme tika iestatīta uz P < 0.05.="" visi="" dati="" tika="" analizēti="" ar="" spss="" 16.0="" programmatūru="" (sjiņdzjanas="" medicīnas="">

Rezultāti

CPhG kvantitatīvā noteikšana

C. tubulosa CPhG satur divus feniletilspirta glikozīdus, ehinakozīdu un akteozīdu, un to saturs CPhG ar HPLC analīzi (1. att.) tika noteikts 42,71 ± 0,42 procenti un 14,27 ± {{7 }},18 procenti attiecīgi.

Aknu un liesas indeksi

Kā parādīts 1. tabulā, modeļu grupas aknu un liesas indeksi bija ievērojami paaugstināti [P < 0.01,="" p="">< 0,05].="" pozitīvo="" zāļu="" bjrg="" un="" cphg="" aknu="" un="" liesas="" indeksi="" dažādās="" devu="" grupās="" bija="" ievērojami="" samazināti,="" salīdzinot="" ar="" modeļa="" grupu="" [pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0." 004,="" pliver="0.005;" attiecīgi="" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024," pspleen="0.070]." aknu="" un="" liesas="" indeksi="" bija="" zemāki="" nekā="" modeļu="" grupas="">

CPhG ietekme uz ALAT, AST aktivitātēm un aknu fibrozes marķieriem

Šajā pētījumā aknu enzīmu AST un ALT līmenis serumā bija ievērojami paaugstināts modeļa grupā, atspoguļojot hepatocelulāros bojājumus BSA izraisītās aknu fibrozes žurkām. Tomēr eksperimenti.

parādīja, ka ārstēšana ar BJRG (600 mg/kg) un CPhG (125, 250 un 5{{10}}0 mg/kg) ievērojami samazināja AST [PAGĀDNE < 0.0{{60}}1,="" pagātne="">< 0,001,="" pagātne="">< 0,001,="" pagātne="">< 0,001="" ,="" attiecīgi]="" un="" alt="" [palt="0.117," palt="0.139," palt="0.189," palt="0.255," attiecīgi]="" līmenis="" aknu="" fibrozes="" žurkām="" .="" (2.="" tabula).="" žurku="" modeļu="" ha,="" ln,="" pc="" un="" iv-c="" līmenis="" bija="" ievērojami="" paaugstināts="" [attiecīgi="" pha="">< 0,001,="" pln="">< 0,001,="" ppciii="0,002," piv-c="">< 0,001].="" salīdzinot="" ar="" modeļu="" grupu,="" ha="" līmeņi="" [attiecīgi="" pha="0.009," pha="0.007," pha="0.009," pha="0.023]," ln="" [attiecīgi="" pln="0.011," p="" ln="0.004," p="" ln="0.026," p="" ln="0.069)," pc="" iii="" [p="" pciii="" {="" {47}}.006,="" p="" pciii="0.067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296," attiecīgi]="" un="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001]="" žurkām="" ievērojami="" samazināja="" bjrg="" (600="" mg/kg)="" un="" cphg="" dažādās="" devu="" grupās="" (125,="" 250="" un="" 500="" mg/kg)="" (3.="" tabula).hyp="" saturs="" un="" tgf-="" 1="" kolagēna="" saturs="" tika="" noteikts="" arī,="" mērot="" hyp="" līmeni="" aknu="" audos.="" kā="" parādīts="" 4.="" tabulā,="" vidējais="">līmenis modeļu grupā bija ievērojami augstāks nekā parastajā grupā, bet tas bija ievērojami samazināts BJRG grupā un dažādās CPhG devu grupās. Modeļa grupas TGF{{0}} aknu koncentrācija žurkām bija ievērojami palielināta [P < 0.001].="" salīdzinot="" ar="" modeļu="" grupu,="" pozitīvās="" zāles="" un="" dažādu="" cphg="" devu="" grupu="" tgf-="" 1="" līmenis="" bija="" ievērojami="" samazināts="" [p="" tgf-="" 1="">< 0.001,="" p="" tgf-="" 1="" attiecīgi="">< 0,001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0,001,="" ptgf-="" 1="">< 0,001].="" rezultāti="" ir="" apkopoti="" 4.="">

Histopatoloģiskā izmeklēšana

Normālu aknu audu sekciju novērojumos, kas iekrāsoti ar H&E un Masona trihromu, ir atšķirīgas aknu daivas un aknu sinusoīdi. Aknu audu struktūra modeļa žurkām bija traucēta, un aknu audi un aknu sinusoīdi tika aizstāti ar lielu daudzumu saistaudu. Tomēr ārstēšanas grupā tika konstatēta normālāka citoarhitektūra un mazāk saistaudu nekā modeļu grupā.

H&E krāsošana

Normālajā grupā tika novērota aknu daivu strukturālā integritāte bez patoloģiskām portāla zonām un aknu sinusoīdiem. Aknu saites bija sakārtotas, kodols bija apaļš un skaidrs. Kodoli atrodas šūnas centrā, ar bagātīgu citoplazmu. Tikai portāla zonā ir neliels daudzums šķiedru audu (2.a att.). Modeļu grupā tika nopietni bojāta lobulārā struktūra. Aknu šūnās bija viegla ūdeņaina deģenerācija, galvenokārt balonu deģenerācija un/vai tauku deģenerācija. Tika novērota arī iekaisuma šūnu infiltrācijas veidošanās, plaša šķiedru audu hiperplāzija, liela skaita šķiedru starpsienas veidošanās, sadalītas daivas un nozīmīga aknu šūnu proliferācija. Šie novērojumi apstiprināja žurku imūno bojājumu dzīvnieka aknu fibrozes modeļa izveides panākumus (2.b attēls). Salīdzinot ar modeļu grupu, dažādos CPhG tika samazināta iekaisuma šūnu infiltrācija. Tika novērota arī mazāka aknu šūnu nekroze un tauku deģenerācija, kā arī fibrozes mazināšanās. CPhG ievērojami mazināja BSA izraisītas aknu fibrozes patoloģiju žurkām, mazināja aknu šūnu pietūkumu un efektīvi novērsa hepatocītu nekrozi un iekaisuma šūnu infiltrāciju, kas liecina, ka CPhG ir aizsargājoša iedarbība uz BSA izraisītu žurku aknu fibrozi. (2.c–f att.). Masona trihroma krāsojums Normālajā grupā aknu audi bija normāli. Aknu vārtu zonā bija neliels skaits zilo kolagēna šķiedru, un aknu audi bija normāli strukturēti (3.a attēls). Salīdzinot ar parastās grupas aknu audiem, šķiedru audi izplatījās ar centrālo lapiņu un paplašinājās aknu parenhīmā. Kolagēna šķiedras pagarinātas un saistītas un

aptvēra visu daivu un apņēma centrālo vēnu. Šie efekti, kā arī hepatocītu fibroze, lobulārie strukturālie bojājumi, periportāla fibroze un pseidolobulu veidošanās (3.b attēls) pierādīja, ka modelis ir izveidots. Salīdzinot ar modeļu grupu, kolagēna šķiedras pozitīvās zāļu kontroles grupā bija nedaudz izstieptas uz āru no perifēro portāla zonas (3.c attēls). Salīdzinot ar modeļu grupu, kolagēna šķiedras dažādās CPhG devu grupās tika ievērojami samazinātas, šķiedru proliferācija tika kavēta un šķiedru audu proliferācija aknu parenhīmā ievērojami samazinājās. Šie rezultāti liecināja, ka CPhG pasargāja žurkas no BSA izraisītas aknu fibrozes (3.d–f att.).

Imūnhistoķīmiskā krāsošana

Svarīgi ir tas, ka I tipa kolagēna un III tipa kolagēna ekspresijai ir būtiska loma aknu fibrozes attīstībā, un to veidošanās un nogulsnēšanās aknu audos varētu kalpot kā svarīgs anti-aknu fibrozes efektivitātes noteicējs. Rezultāti ir apkopoti 5. tabulā

I tipa kolagēns

Normālā grupa izteica I tipa kolagēnu galvenokārt asinsvados un portāla zonā. Modeļu grupā ļoti izteikta I tipa kolagēna asinsvadu fibroze portāla zonās. Disse telpā I tipa kolagēna krāsojums tika novērots svītras vai kā nevienmērīgs sadalījums. Kolagēna apvalkā šķiedru starpsienas, lai veidotu pseidolobulu. Šajos eksperimentos BJRJ (600 mg/kg) un dažādām CPhGs s devu grupām (125, 250 un 500 mg/kg) tika izveidots mazāk šķiedru starpsienu [PCol I=0.002, PCol I {{ 6}}.001, PCol I=0.023 un P Col I=0.044, attiecīgi. Puskvantitatīvie rezultāti atklāja, ka to I tipa kolagēna ekspresija bija ievērojami zemāka salīdzinājumā ar modeļu grupu (4. att.).

III tipa kolagēns

III tipa kolagēns bija vāji izteikts normālajā grupā, un perifērajās zonās, kas ieskauj portālu un aknu vēnas, nepārtrauktu šķiedru vietā bija neliels daudzums smalkas dzeltenas krāsas (5.a attēls). Modeļu grupā kolagēna šķiedrām bija platas un biezas auklas, kas liecina par spēcīgu ekspresiju, kas galvenokārt atrodas portāla un šķiedru audu zonās (5.b att.). BJRJ kolagēna šķiedras (600 mg/kg) un dažādas CPhG devu grupas (125, 250 un 500 mg/kg) bija pavedienveida un izkliedētas ap centrālo vēnu un portāla zonām. Salīdzinot ar modeļu grupu, kolagēna šķiedras bija ievērojami samazinātas, krāsojums bija bāls un plāns, un imūnhistoķīmiskā krāsošana bija vāji pozitīva (5.c–f att.). Šie daļēji kvantitatīvie rezultāti liecina, ka pozitīvi izteiktās šūnas pozitīvajās un dažādās devu grupās [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PCol III=0.010, un P Col III=0.037, attiecīgi] atšķīrās no tiem, kas bija modeļu grupā.

TGF- 1

Normālās žurku aknu šūnās bija neliela TGIF{{0}} ekspresija. Ekspresija bija ierobežota ar nelielu skaitu intersticiālu šūnu (6.a attēls). Modeļu grupā TGF- 1 ekspresija bija plaši izplatīta portāla zonā, šķiedru telpās, aknu zvaigžņu šūnās, iekaisuma šūnās, sinusoidālajā sieniņā un citoplazmā. Konkrētā portāla zonā bija izteikti pozitīva izteiksme ar brūngani dzeltenu krāsojumu (6.b attēls). Bija neliels ekspresijas daudzums BJRJ portāla zonā un šķiedru starpsienās (600 mg/kg) un dažādās CPhG devu grupās (125, 250 un 500 mg/kg). Pozitīvās iekrāsošanās līmenis šajās grupās bija ievērojami samazināts, salīdzinot ar modeļa grupu. Iekrāsošanās intersticiālajās šūnās šķiedru starpsienās un iekaisuma šūnu citoplazmā tika samazināta (6.c–f att.). Daļēji kvantitatīvie rezultāti atklāja, ka BJRJ un dažādas CPhG devu grupas [P TGF- 1=0.001, P TGF- 1 < 0.001,="" p="" tgf-="" 1="0.009," ptgf-="" 1="0" 0,004,="" attiecīgi]="" bija="" nozīmīgi="" salīdzinājumā="" ar="" modeļa="" grupu.="" kā="" minēts="" iepriekš="" rakstā,="" tgf{20}}="" ir="" svarīgs="" citokīns="" aknu="">

fibroze, stimulējot ekstracelulārās matricas veidošanos [19]. Mēs parādījām, ka TGF- 1 līmenis modeļa grupā palielinājās tādā veidā, kas atbilst aknu fibrozes smagumam. TGF- 1 ekspresijas līmenis aknās atbilda TGF- 1 līmenim serumā. Tas norāda, ka CPhG var ievērojami samazināt aknu fibrozi TGF- 1 ekspresijas dēļ, piedaloties ECM sintēzē un degradācijā. I tipa kolagēna, III tipa kolagēna un TGF- 1 ekspresija var noteikt aknu fibrozes patoloģisko procesu. To ekspresijas līmenis ārstēšanas grupās tika ievērojami samazināts un ilustrēja, ka CPhG var uzlabot kolagenāzes aktivitāti, saglabājot aknu ECM sintēzes un degradācijas dinamisko līdzsvaru, tādējādi aizkavējot un novēršot aknu fibrozes veidošanos.