-Tubulīna, inversīna un tā mērķa izkliedēts-1 un primāro skropstu morfoloģija normālā cilvēka nieru attīstībā un slimībās

edmund.chen@wecistanche.com

Abstract:Attīstīšanas laikā tika analizēta ar Wnt-signalizācijas ceļu saistīto -tubulīna, inversijas un izspūrušo -1 (DVL-1) proteīnu spatiotemporālā ekspresija, kā arī primārā skropstu morfoloģija.nieres(14.–38. attīstības nedēļa), vesels pēcdzemdību (1.5- un 7-gadus vecs) un patoloģiski izmainīts cilvēksnieres,ieskaitot multicistisko displāzijunieres(MCDK), fokusa segmentālā glomeruloskleroze (FSGS) un somu tipa nefrotiskais sindroms (CNF). Analīze tika veikta ar dubultās imunofluorescences, elektronu mikroskopijas, semikvantitatīvās un statistiskās metodes. -tubulīna, inversijas un DVL-1 citoplazmas koekspresija tika novērota analizēto audu proksimālajās vītņotajās kanāliņos (pct), distālās vītņotajās kanāliņos (dct) un glomerulos (g). Laikānieresattīstība, kopējā -tubulīna, inversijas un DVL{1}} ekspresija samazinājās, bet pēcdzemdību periodā nedaudz palielinājās. Augstākās -tubulīna un inversijas izpausmes raksturoja dct un g, savukārt augstas DVL-1 raksturo pct. -tubulīna, inversijas un DVL{5}} izteiksmes modeļi MCDK, FSGS un CNFnieresbūtiski atšķīrās no veselās kontroles. Salīdzinot ar veselīgunieres, patoloģiski mainītsnieresbija dismorfiskas primārās skropstas. Atšķirīga -tubulīna, inversijas un DVL-1 izteiksmes dinamika laikānieresattīstība varētu norādīt, ka pāreja starp kanonisko un nekanonisko Wnt-signalizāciju ir būtiska normālai darbībainieresmorfoģenēze. Turpretim to traucētā izpausme patoloģiskānieresvar būt saistīta ar patoloģiskiem primārajiem cilijām, kas izraisa hroniskunieru slimības.

Atslēgvārdi:cilvēka nieru attīstība; -tubulīns; inversīns; DVL-1; MCDK; FSGS; CNF; nieres, nieres

CISTANCHE UZLABOS NIERU/NIeru SLIMĪBU

Ievads 

Galīgā jeb metanefriskā attīstībanieressākas piektajā gestācijas nedēļā (GW), kas pēc tam nepārtraukti diferencējas, veidojot pastāvīgas nieres [1,2]. Signalizācijas mijiedarbība starp metanefrisko mezenhīmu un urīnizvadkanālu nodrošina pareizunieresattīstība nefroģenēzes laikā. Īsumā, urīnizvadkanāla pumpuris metanefriskajā mezenhīmā inducē mezenhimālas-epitēlija pāreju (MET), kas kondensējas un veidojasnierupūslīši, kam seko komata formas un S formas ķermeņi un visbeidzot noved pie glomerulu veidošanās [3]. Savukārt mezenhīms izraisa turpmāku urīnizvadkanāla pumpuru sazarošanu. Metanefriskās nieres kļūst par funkcionālām ekskrēcijas vienībām cilvēka attīstības 11. nedēļā. Tomēr nefroģenēze tiek pabeigta 34. līdz 36. augļa attīstības nedēļā, kad beidzas vairāki sazarojumi, bet tālāka nieru diferenciācijas process turpinās pēcdzemdību periodā [4,5]. Šo sarežģīto mijiedarbību traucējumi izraisa dažādas iedzimtas nieru un urīnceļu anomālijas (CAKUT), tostarp displāziju, policistisku nieru slimību, multicistisku displāziju.nieru slimība(MCDK), tādējādi izraisot hroniskunieru slimība(CKD) [6].

Šajā pētījumā mēs koncentrējāmies uz primāro skropstu izskatu un Wnt-signalizācijas ceļu, kam ir svarīga loma normālas nefroģenēzes laikā unnieresatjaunošanas process pēc akūta vai hroniskanieru slimība[7]. Primāro skropstu esamība nefroģenēzes laikā un liels skaits attīstībasnieresdefekti, kas rodas pacientiem ar ciliāru slimību, norāda, ka normālai ciliāru darbībai ir nepieciešama patiesa primārā ciliāru funkcijanieresorganoģenēze [8,9]. Primārais cilijs ir uz mikrotubuliem balstīta organelle, kas ir svarīga audu homeostāzei, kur -tubulīns ir pamata sastāvdaļa [10]. Tubulīna acetilācijas zudums iemūžinātās šūnās izraisa pāreju no epitēlija uz mezenhimālu (EMT), tādējādi norādot, ka acetilētais tubulīns ir svarīgs mikrotubulu stabilizācijā [11]. Cilvēka attīstības laikā primārais ciliāru mediētais Wnt ceļš nodrošina šūnu proliferāciju, diferenciāciju un audu morfoģenēzi [12]. Ievērojamam skaitam bērnu ar traucētu primāro skropstu funkciju un traucētu Wnt-signalizācijas ceļu attīstās HNS, kur iedzimtanierutraucējumi ir vainojami gandrīz pusē gadījumu [13]. Visbiežāk sastopamā iedzimtā cistiskā slimība bērniem ir multicistiska displāzijanieru slimība(MCDK) [14]. Vairākas cistas, kas nesazinās [15] un kurām trūkst normālasnieruparenhīma ir raksturīgi MCDK mikroskopiski atradumi. Fokālā segmentālā glomeruloskleroze (FSGS) ir viena no visbiežāk sastopamajām glomerulārām slimībām, kas noved pie beigu stadijas.nieru slimība[16]. Sākumā FSGS ir raksturīgs fokusam, ietverot tikai nelielu daļu glomerulu un segmentālu, ietverot izmaiņas tikai glomerulārā apļa segmentā [17]. Somu tipa iedzimtais nefrotiskais sindroms (CNF) ir retāk sastopams autosomāli recesīvi pārmantotsnieru slimībako raksturo plaša proteīna zuduma pirmsdzemdību uzliesmojums [18], kas saistīts ar proksimālo kanāliņu cistoģenēzi [19]. Bojātas glomerulārās filtrācijas barjeras rezultātā daudzām primāro glomerulāro slimību formām attīstās proteīnūrija [20]. Ievērojams skaits pētījumu liecina, ka podocītu ievainojumiem un disfunkcijām ir būtiska loma CKD proteīnūrijas patoģenēzē [21]. Pētījums, ko veica Vukojevic et al. parāda palielinātu skropstu un slikti diferencētu podocītu skaitu CNF [22]. Iepriekšējie pētījumi norādīja, ka Wnt / -catenin signalizācijas ceļam ir būtiska loma podocītu disfunkcijas mazināšanā ar proteīnūriju [23]. Ir divi galvenie Wnt-signalizācijas ceļi, viens pazīstams kā kanonisks -katenīna atkarīgs un cits nekanonisks, -katenīna neatkarīgs. Peles laikānieresattīstība, kanoniskā Wnt-signalizācija ir aktīva urētera pumpuru galos un S formas ķermeņos [24]. Turklāt Wnt, izmantojot kanonisko signalizāciju, ir svarīga MET uzturēšanai nefroģenēzes laikā [25]. Proti, proteīna kompleksa, kas satur Dvl, saistīšanās ar membrānas receptoru ir obligāta Wnt ceļa aktivizēšanai, savukārt šī ceļa galveno komponentu atspējošana izraisa agrīnu perinatālo mirstību, jo nav nefrogēnas zonas.nieres[25]. 

Tika konstatēts, ka proteīns, kas ir ļoti svarīgs molekulārai pārslēgšanai starp kanoniskajiem un nekanoniskajiem Wnt signalizācijas ceļiem, ir inversija [26]. Lai gan ir konstatēta dažādu proteīnu mijiedarbība ar inversiju, tā precīza funkcija vēl nav pilnībā noskaidrota. Iekšnieruepitēlija šūnās, inversija atrodas primārajos ciliāros, darbojoties kā ciliārais proteīns [27]. Turklāt inversija veido vienmērīgu kompleksu ar tubulīnu kultūrāsnierušūnas, un tās kolokalizējas in vivo [27,28]. Šķiet, ka inversijai ir būtiska loma pronefriskās sistēmas agrīnā morfoģenēzē un kreisās-labās simetrijas noteikšanā attīstības laikā [29, 30]. Nozīmīgs notikums gan kanoniskiem, gan nekanoniskiem Wnt-signalizācijas ceļiem citoplazmatiskā Dvl piesaistīšanā šūnu membrānai. Tā kā iepriekšējie atklājumi parādīja, ka inversija un Dvl kolokalizējas nieru epitēlija šūnās, var domāt, ka inversijai varētu būt nozīme arī nekanoniskā signalizācijā. Wnt-signalizācijas disregulācija, ko izraisa inversija, izraisa novirzes proliferāciju kanāliņos [31]. Ģenētiskie testi atklāja DVL-1 mutāciju pacientiem ar autosomāli dominējošu Robinova sindromu, kas dažiem pacientiem rada neviendabīgus traucējumus, kas saistīti ar uroģenitālo unnieruanomālijas [32].

CISTANCHE UZLABOS NIeru/NIeru DIALĪZI

-tubulīna, inversijas un DVL-1 attīstības izpausmes modelis ir pētīts dažādos dzīvnieku modeļos. Tādējādi to ekspresija Xenopus laevis pronefrosā ir apstiprināta, izmantojot intravitālo mikroskopiju [31], savukārt tie tika atrasti šūnu līnijās, kas iegūtas no peles proksimālajām kanāliņu šūnām, izmantojot konfokālo mikroskopiju un masas spektrometriju [33]. Turklāt gaismas mikroskopija un dubultā imunofluorescence atklāja to klātbūtni peļu sekcijāsnieres[34]. Pētījumos ar inversijas nokautām pelēm ziņots par palielinātām, izkliedētām cistāmnierumedulla un garoza, kas saistītas ar situs viscerālo inversiju [35]. Cilvēkiem inversijas mutācija tika novērota ar zīdaiņu nefronoftizi, kas izraisīja grūtniecības pārtraukšanu [36]. Neskatoties uz daudziem pētījumiem parnieru-tubulīna, inversijas un DVL-1 ekspresijas modelis un funkcija, cik mums ir zināms, šo proteīnu ekspresijas modelis cilvēka augļa un pēcdzemdību cilvēka audos vēl nav pētīts un radīts korelācijai. Turklāt nav ziņots par pierādījumiem par inversijas un DVL-1 izpausmēm agrīnā cilvēka attīstībā. Tāpēc šī pētījuma mērķis bija analizēt -tubulīna, inversijas un DVL-1 telpiskās un laika izpausmes modeli vesela cilvēka augļa un pēcdzemdību stadijās.nieres, kā arī iekšānieresMCDK, FSGS un CNF audiniereslai izveidotu iespējamu trūkstošo saikni starp šīm struktūrām. Proti, mēs ierosinām, ka traucēti -tubulīna, inversijas un DVL-1 proteīnu ekspresijas modeļi varētu būt pamatā esošais cistoģenēzes process un primāro skropstu patoloģiska funkcija, kas izraisa hronisku attīstību.nieru slimības. 

Rezultāti

Attīstības un pēcdzemdību analīzenieresaudi tika veikti ar izteikti diferencētām struktūrāmnieres:proksimāli vītņoti kanāliņi (pct), distāli vītņoti kanāliņi (dct) un glomeruli (g). Analizētajos attīstības posmos un pēcdzemdību periodānieresaudi, -tubulīns, inversija un DVL-1 uzrādīja pozitīvus ekspresijas modeļus, taču ar atšķirībām intensitātē, sadalījumā un daudzumā. Patoloģijas analīzenieru audiMCDK, FSGS un CNF tika veikta ar pilnu pozitīvo šūnu attēlu skaitu, salīdzinot ar veselīgu nieru audu kontroli.

2.1. Veselu un patoloģiski izmainītu pēcdzemdību cilvēka nieru audu gaismas mikroskopija, elektronu mikroskopija un imūnhistoķīmija (-tubulīns)

2.1.1. Veselīga pēcdzemdību nieru gaisma

pēcdzemdību mikroskopijanieresaudi demonstrē labi definētusnieresstruktūras, ar izteiktu atšķirību starp smadzenēm un garozu un pct, dct un g veidošanos kortikālajā reģionā. Tubulīna imūnhistoķīmiskā krāsošana atklāj viena primārā ciliuma klātbūtni katras cauruļveida šūnas apikālās šūnas virsmas centrā un 0.018 procenti ± 0,00014 procenti SD uz glomerulāro šūnu virsmas. Elektronu mikroskopija parāda tikai viena primārā ciliuma klātbūtni, kas rodas no bazālā ķermeņa kanāliņu apikālās šūnas virsmā (1.a attēls).

2.1.2. CNF

Lielākā daļa analizēto g ir mazākas un lobētas (80 procenti), savukārt mazākums ir normāla izmēra vai hipertrofiski (20 procenti, n=100). Tiek konstatēta g segmentālā vai globālā skleroze, savukārt pct un dct ir daļēji paplašināti un pārklāti ar atrofisku epitēliju. Ultrastrukturāli tiek novērots mikrovillu zudums un šūnu augstuma samazināšanās ar kodolu multifragmentāciju. Podocītos pēdas procesi tiek difūzi zaudēti. Cauruļveida primārās skropstas ir dezorganizētas, īpaši proksimālo kanāliņu cistās, parādot garuma un citoplazmas stāvokļa izmaiņas (1.b attēls).

2.1.3. MCDK

Nieru audos var atrast sporādiski nenobriedušu un nobriedušu g.Nieresaudi ir piepildīti ar daudzām ovālām cistām. Kolonnveida epitēlija šūnas pārklāj cistas, un tās ieskauj irdeni saistaudi. Imūnhistoķīmiskā krāsošana ar -tubulīnu parāda vairākas garas un neorganizētas primārās skropstas uz epitēlija šūnu virsmas (1.c attēls).

2.1.4. FSGS

90 procentos g tiek konstatēta plaša segmentālā skleroze (n=100), kas saistīta ar intersticiālu fibrozi un kanāliņu bojājuma pazīmēm. Elektronu mikroskopā konstatē epitēlija šūnu augstuma samazināšanos ar mikrovillu zudumu, savukārt endotēlija šūnām un mezangiālajiem reģioniem ir regulāra ultrastruktūra. Elektronu mikroskopā uz distālās cauruļveida šūnas virsmas tiek novērots ārkārtīgi garš un dislokēts (decentralizēts) cilijs (1.e attēls). Podocīti parāda difūzu pēdu procesu zudumu ar plašiem mikrovillu audiem. Imūnhistoķīmiskā krāsošana ar a-tubulīnu parāda vairākas garas un neorganizētas primārās skropstas uz epitēlija šūnu virsmas (1.c attēls).

2.2. Imūnhistoķīmiskā krāsošana pret tubulīnu, inversiju un DVL-1- un attīstošu un veselīgu pēcdzemdību cilvēka nieru statistiskā analīze

14., 15. un 16. grūtniecības nedēļā,nieresaudi tiek prezentēti ar dažādām nefronu veidošanās attīstības stadijām: no metanefriskajiem kausiem,nierupūslīšu stadijas, lai vadītu S formas nefronus, tādējādi veidojot nefrogēno zonu ārējā garozā (2. attēls). Atšķirīgus pct, dct un g var novērot kortikālajos reģionos, kas ir tuvāknieresmedulla. 22. GW laikā medullas un garozas daļas kļuva skaidri atšķirīgas, savukārt 38. GW laikānieresstruktūras šķiet ļoti diferencētas, kas satur nobriedušas pct, dct un g formas

2.2.1. a-Tubulīns

Attīstības laikā a-tubulīns spēcīgi izpaužas visās jaunattīstības valstīsnieresstruktūras, galvenokārt vizualizējot primāro skropstu formu uz Boumena kapsulas parietālo epitēlija šūnu virsmām, g, pct un dct. Iekšānieresaudos 82–97 procenti pct šūnu ekspresē a-tubulīnu, savukārt dct ekspresija samazinās no 99 procentiem līdz 72 procentiem 38. GW (sk. 3. attēlu, 1. tabulu). Starp dažādām attīstības stadijām spēcīgākā a-tubulīna izpausme ir konstatēta 16. GW g.nieres, kas satur 93 procentus pozitīvo šūnu. elastīgs 14., 15. un 22. GW (sk. 3.a,b attēlu, 1. tabulu), aptuveni 70 procenti g šūnu ekspresē a-tubulīnu, savukārt vismazākā ekspresija tiek novērota 38. GW (p < 0,01)="" ar="" 34="" procentiem="" pozitīvo="" šūnu="" (3.c="" attēls).="" pēcdzemdību="">nieresaudi (1.5-gadus un 7-gadus vecinieres), spēcīgākā imūnreaktivitāte pret a-tubulīnu tiek novērota uz pct un dct apikālās šūnas virsmas (3.d-f attēls). A-tubulīna ekspresija ir arī dct perinukleārajā citoplazmā un Bowman kapsulas parietālajās epitēlija šūnās. a-tubulīns krāso visusnierustruktūras ar vidēji 50 procentiem pozitīvo šūnu pct, 94 procentiem dct un 85 procentiem gramos (3.f attēls). Dct traipi būtiski atšķiras no pct (p < 0,0001).="" visas="" pētītās="" struktūras="" krāsojas="" pozitīvi="" pret="" a-tubulīnu,="" 77="" procenti="" pozitīvo="" šūnu="" pct,="" 72="" procenti="" dct="" un="" 58="" procenti="" g="">

3. attēls. -tubulīna un DAPI imūnfluorescences krāsošana jaunattīstības un pēcdzemdību cilvēka nieru audos (a–e). 14., 15./16., 38. GW nieres (a–c);nieresno 1.5- un 7-gadus veciem bērniem (d, e). Pozitīva -tubulīna (bultiņas) iekrāsošanās ir parādīta katrā garozas struktūrā, izmantojot attīstības un pēcdzemdību fāzes (a – e), proksimālos vītņotos kanāliņus (pct), distālos vītņotos kanāliņus (dct) un glomerulus (g). Sīkāka informācija par primārajiem skropstiņiem pct (d) un dct (a–c, e) ir parādīta kā ielaidumi ar lielāku palielinājumu (baltā lodziņā). Palielinājums × 40, mēroga josla 100 µm. -Tubulīna pozitīvo šūnu sadalījums pa struktūrām dažādos attīstības posmos un pēcdzemdību periodā ir parādīts grafikā (f). Grafiks (g) (kopējais proteīnu pozitīvo šūnu skaits novērotajās struktūrās) parāda proteīna ekspresiju saistībā ar attīstības laiku (lineārā regresija) un -Tubulīna un DVL{10}} savstarpējo saistību attīstības un nobriešanas laikā (divvirzienu ANOVA, kam seko SIDAK posthoc tests). Dati tiek parādīti kā vidējais ± SD.

Tubulīna pozitīvo šūnu sadalījums pa struktūrām dažādos attīstības posmos un pēcdzemdību periodā ir parādīts grafikā (f). Grafiks (g) (kopējais proteīnu pozitīvo šūnu skaits novērotajās struktūrās) parāda proteīna ekspresiju, kas saistīta ar attīstības laiku (lineāra regresija) un -tubulīna savstarpējo saistību ar DVL-1 attīstības un nobriešanas laikā (divvirzienu ANOVA, kam seko Sidaka post hoc tests). Dati tiek parādīti kā vidējie ± SD.

2.2.2. Dubultā imunofluorescences krāsošana pret inversiju un DVL-1 un DAPI kodola traipu veidošanās un veselīgu pēcdzemdību nieru inversijas ekspresija jaunattīstības un pēcdzemdību nieru audos

14., 15. un 16. GW inversija uzrāda spēcīgu granulētu ekspresiju g un vieglu granulētu ekspresiju pct un dct citoplazmā (4.a, b attēls), savukārt 22. un 38. GW (sk. 4.c attēlu) izteikti. pozitīva izteiksme ir novērojama g (1. tabula). No 14. līdz 22. GW aptuveni 50 procenti šūnu izsaka versiju. 16. GW pct šūnas izsaka inversiju 73 procentos šūnu, savukārt 38. GW samazinās līdz 29 procentiem šūnu (p < 0,05)="" (sk.="" 4. gw).="" pozitīva="" inversijas="" izpausme="" ir="" konstatēta="" aptuveni="" 80–90="" procentos="" augļa="" dct="" un="" g="">nieres14. un 16. GW audos ar viszemāko ekspresiju dct 38. GW (attiecīgi p < 0.05,="" p="">< 0,0001),="" kur="" 66="" procenti="" šūnu="" bija="" pozitīvas.="" pēcdzemdību="">nieres, pct spēcīgi iekrāsojas pie apikālās šūnas membrānas, savukārt dct krāso galvenokārt bazālo šūnu membrānā un perinukleārajā citoplazmā (4.d, e attēls). Šajā posmā mēs atradām inversijas izpausmi visos pētītajosnierustruktūras, tostarp pct, dct un g, ar vidējo pozitīvo šūnu ekspresiju 92 procenti pct, 88 procenti dct un 90 procenti g (attēls 4f). Mēs nenovērojām būtisku atšķirību inversijas izteiksmes signāla stiprumā starp struktūrām. Augstākā inversijas izpausme ir g, ar vidējo 94 procentiem pozitīvo šūnu (4.f attēls). Būtiska atšķirība ir konstatēta, salīdzinot g krāsojumu (kur 94 procenti šūnu krāsojas pozitīvi) ar pct, kur 58 procenti šūnu krāsojas pozitīvi (p < 0.01)="" un="" dct,="" kur="" 49="" procenti="" šūnu="" ir="" pozitīvs="" (p="">< 0,0001,="" 4.f="">

DVL{0}} izpausme jaunattīstības un pēcdzemdību nieru audos

Viegla vai spēcīga DVL{{0}} ekspresija tiek novērota pct, dct un g citoplazmā augļa periodā (sk. 4.a–c attēlu, 1. tabulu). Procentuāli 76–86 procenti šūnu ekspresē DVL-1 14.–22. GW, savukārt 38. GW ir 57 procenti pozitīvo šūnu (4. g attēls). 14. un 15. GW dct 68–70 procenti šūnu ekspresē DVL-1, 16. un 22. GW pozitīvo šūnu skaits samazinās līdz 42–5{{41} } procenti , savukārt 38. GW izteiksmē (p < 0,001)="" tiek="" novērots="" 19="" procentos="" dct="" šūnu.="" dvl-1="" ekspresija="" palielinās="" g="" visās="" augļa="" stadijās:="" 14. gw="" tas="" ir="" 6="" procenti,="" savukārt="" 15.,="" 16.="" un="" 22. gw="" palielinās="" līdz="" 10 procentiem="" (p="">< 0,01).="" 38 gw="" 14="" procenti="" g="" šūnu="" ekspresē="" dvl-1="" (4. attēls g).="" pēcdzemdību="" periodā="" dvl-1="" imūnreaktivitāte="" ir="" izkliedēta="" gan="" pct,="" gan="" dct="" citoplazmā="" (1.="" tabula)="" (4.d,="" e="" attēls).="" signāls="" ir="" atrodams="" visās="" pētītajās="" struktūrās,="" bet="" galvenokārt="" perinukleārajā="" citoplazmā.="" dvl-1="" izteiksmes="" intensitāte="" ir="" ievērojami="" augstāka="" pct,="" salīdzinot="" ar="" dct="" un="" g="" (p="">< 0,01).="" 39–45="" procenti="" šūnu="" pct="" un="" dct="" izsaka="" dvl-1,="" savukārt="" g,="" 21="" procents="" šūnu="" ir="" pozitīvas="" (4. attēls g).="" mēs="" neatradām="" būtisku="" atšķirību="" starp="" imūnreaktīvo="" šūnu="" procentuālo="" daudzumu="">nierustruktūras. DVL-1 imūnreaktīvo šūnu procentuālais daudzums ir attiecīgi 34 procenti pct, 36 procenti dct un 27 procenti gramos (4.g attēls).

4. attēls. Inversijas (zaļa), DVL-1 (sarkana) un DAPI (zila) dubultā imunofluorescences krāsošana jaunattīstības un pēcdzemdību nieru audos (14.–38. GW, 1.5- un {{6 }}gadus veci nieru audi). Pozitīva krāsošana (bultiņas) ir parādīta katrā struktūrā visās attīstības fāzēs (a – c) un pēcdzemdību periodā (d, e). Apvienoti mikrofoni kopā ar interesējošām struktūrām garozā: proksimāli izliekti kanāliņi (pct), distāli izliekti kanāliņi (dct) un glomeruli (g). Apvienotajās mikrofotogrāfijās ir parādīta inversijas/DVL-1 (bultiņas galviņa) kolokalizācija. Negatīvās kontroles krāsojumi tiek parādīti kā ielaidumi inversijā un DVL-1 (a). Eritrocītus var redzēt kā stipri iekrāsotas šūnas dct tuvumā. Sīkāka informācija tiek parādīta kā ielaidumi ar lielāku palielinājumu. Palielinājums × 40, mēroga josla 100 µm. Inversijas un DVL-1 dinamiskais pozitīvais šūnu sadalījums nieru struktūrās (pct, dct, g) attīstības un pēcdzemdību stadijās ir parādīts grafikos (f,g). Diagrammā (h) parādīta proteīna ekspresija (kopējais pozitīvo šūnu skaits struktūrās), kas saistīta ar attīstības laiku (lineārā regresija) un DVL{13}} inversijas savstarpējo saistību ar attīstību un nobriešanu (divvirzienu ANOVA, kam seko Sidaka post hoc tests ). Dati tiek parādīti kā vidējie ± SD.

Inversijas un DVL-1 koekspresija tiek novērota nieru g, dct un pct citoplazmā attīstības laikā (sk. 4.a–c attēlu, saplūšana). Pēcdzemdību periodā inversijas un DVL-1 koekspresija raksturo dažādus cauruļveida šūnu šūnu nodalījumus pct un dct, savukārt koekspresiju g raksturo spēcīga inversijas ekspresijas izplatība (sk. 4.d attēlu, sapludināšana ). 7-gadu pēcdzemdību nierēs inversijas un DVL-1 koekspresija tiek novērota dct un pct kanāliņu šūnās un g, kur inversijas ekspresija nedaudz dominē salīdzinājumā ar DVL{10}} (4.e attēls, sapludināšana).

2.2.3. Tubulīna, inversijas un DVL-1 izpausmes atšķirības starp dažādām nieru attīstības stadijām un pēcdzemdību nierēm

Tubulīna pozitīvo šūnu skaits augļa nieres audu procentos bija statistiski nozīmīgi lielāks, salīdzinot ar 7-gadus veca bērna nieru audiem (13. (p < 0).0{)="" {11}}1),="" 15.="" (p="">< 0.0001)="" un="" 16.="" (p="">< 0.00001)="" gw).="" agrīnās="" augļa="" stadijas="" dct="" (13.,="" 15.,="" 16.="" un="" 22. gw)="" bija="" vairāk="" pozitīvu="" šūnu,="" salīdzinot="" ar="" 38. gw="" un="" 1.{19}}gadu="" vecu="" bērnu="" nieru="" audiem="" (attiecīgi="" p="">< 0,0001,="" 3.f="" attēls).="" salīdzinot="" dažādas="" attīstības="" stadijas,="" mēs="" konstatējām="" zemākus="" inversijas="" izteiksmes="" līmeņus="" 13.="" (p="">< 0,0001),="" 15.="" (p="">< 0,00001),="" 22.="" (p="">< 0,001)="" un="" 38.="" (p="">< 0,0001)="" gw="" pct,="" salīdzinot="" ar="">nieruaudi no 1.{1}}gadu vecā bērna. Dct tika konstatēta statistiski nozīmīga zemāka inversijas izpausme, salīdzinot 16. GW ar 38. GW nieru audus (p < 0.0001).="" turklāt="" zemāka="" inversijas="" ekspresija="" dct="" tika="" novērota="" 7-gadus="" veca="" bērna="" nieru="" audos;="" salīdzinot="" 13.,="" 15.="" (p="">< 0,001,="" abi),="" 16.="" un="" 1.{15}}gadus="" vecus="" nieru="" audus="" ar="" 7-gadus="" vecu="" nieru="" audu="" dct="" (attiecīgi="" p="">< 0,00001,="" 4.f="" attēls).="" novērotais="" dvl-1="" izteiksmes="" signāls="" dažādos="" posmos="" atklāja,="" ka="" 13.="" (p="">< 0,01),="" 15.,="" 16.="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">

2.2.4. Saistība starp -tubulīna un inversijas DVL izteiksmēm-1 attīstošajos un pēcdzemdību nieres audos

-Tubulīna un inversijas izpausmes tika salīdzinātas ar DVL-1 ekspresiju visos attīstības posmos un pēcdzemdību nieru audos. -tubulīnam bija statistiski augstāka ekspresija visos novērotajos posmos, salīdzinot ar DVL-1 ekspresiju (p < 0.001,="" 3.g="" attēls).="" visos="" novērotajos="" posmos="" inversijai="" bija="" augstāka="" izteiksme,="" salīdzinot="" ar="" dvl-1="" (p="">< 0,0001,="" 4.h="">

2.2.5. Imūnhistoķīmiskās krāsošanas salīdzinājums ar -tubulīnu, versiju un DVL-1- un patoloģiski izmainītu nieru audu statistiskā analīze (MCDK, CNF, FSGS) - tubulīns. Tubulīna krāsošanas atšķirība MCDK, FSGS un CNF bija statistiski nozīmīga salīdzinājumā veseliem pēcdzemdību nieru audiem kā kontroles grupai (attiecīgi p < 0,0001).="" displastiskiem="" nieru="" audiem="" bija="" ievērojami="" augstāka="" ekspresija,="" salīdzinot="" ar="" kontroles="" grupu,="" savukārt="" fsgs="" un="" cnf="" uzrādīja="" ievērojami="" zemāku="" tubulīna="" ekspresiju,="" salīdzinot="" ar="" veselīgu="" kontroli="" (5.f="">

Inversija

Inversija tiek izteikta dezorganizēto epitēlija šūnu un MCDK kanāliņu citoplazmā (5.a attēls). CNF gadījumā inversijas ekspresija raksturo g un dct, savukārt pct cistās tā izpaužas mazāk intensīvi (5.b attēls). FSGS inversija ir izteikti izteikta g un dct, bet mazāk intensīva pct cistās (5.c attēls). Inversijas telpiskā izteiksme uzrādīja statistiski nozīmīgi augstāku iekrāsošanās ātrumu veselos nieru audos (5.g attēls), salīdzinot ar MCDK, FSGS un CNF (attiecīgi p <>

5. attēls. Inversijas (zaļa), DVL-1 (sarkana) un DAPI (zila) dubultā imunofluorescences krāsošana patoloģiskos nieru audos MCDK (a), CNF (b) un FSGS (c): kanāliņi (t) , glomeruli (g), pct cista (c), pct epitēlija šūnu augstums (*). Inversijas un DVL-1 (bultiņu galviņas) struktūra un šūnu koplokalizācija ir parādīta apvienotajās sadaļās ar detalizētu informāciju lielāka palielinājuma ielaidumos. Negatīvās kontroles krāsojumi tiek parādīti kā ielaidumi inversijā un DVL-1 (a). Palielinājums ×40, mēroga josla 10{{20}} µm. -tubulīna (d) un inversijas (e) saistība ar DVL-1 izteiksmi MCDK, FSGS un CNF (divvirzienu ANOVA, kam seko SIDAK post hoc tests). FSGS, CNF un MCDK pct epitēlija šūnu augstuma (f) atšķirība salīdzinājumā ar veselīgu kontroli (vienvirziena ANOVA, kam seko Tukey post hoc tests, n=50). Atšķirība starp -tubulīna, inversijas un DVL{13}} kopējo pozitīvo šūnu procentuālo daudzumu MCDK, CNF un FSGS, salīdzinot ar veselīgu kontroli (g–i), vienvirziena ANOVA, kam seko Tukey post hoc tests). Dati tiek parādīti kā vidējie ± SD. Būtiskas atšķirības norāda p-vērtība (* p < 0,05,="" **="" p="">< 0,01,="" ****="" p="">< 0,0001).="" dvl-1="" dvl-1="" ļoti="" vāji="" izpaužas="" tikai="" neorganizētos="" mcdk="" kanāliņos,="" savukārt="" cnf="" tā="" izteiksme="" raksturo="" dct="" un="" g="" (5.a,b="" attēls).="" fsgs="" dvl-1="" tiek="" novērota="" kā="" viegla="" reaktivitāte="" g,="" dct="" un="" pct="" (5.c="" attēls).="" veseliem="" nieru="" audiem,="" kas="" krāsoti="" ar="" dvl-1,="" bija="" ievērojami="" augstāks="" iekrāsošanās="" ātrums="" (5. attēls),="" atšķirībā="" no="" mcdk="" un="" fsgs="" (abos="" gadījumos="" p="">< 0,0001),="" savukārt="" attiecībā="" uz="" cnf="" netika="" konstatēta="" būtiska="">

2.2.6. Saikne starp -tubulīna izpausmēm un inversiju DVL-1 patoloģiski mainītos nieres audos (MCDK, CNF, FSGS)MCDK, FSGS un CNF gadījumā -tubulīns iekrāsojas ievērojami augstāk nekā DVL-1 (p < 0.0001,="" attiecīgi,="" 5.d="" attēls).="" inversija="" bija="" ievērojami="" augstāka,="" salīdzinot="" ar="" dvl-1="" mdck="" (p="">< 0,0001)="" un="" fsgs="" (p="">< 0,01,="" 5.e="">

2.2.7. Proksimālo vītņu kanāliņu epitēlija šūnu augstuma atšķirības starp veselīgu kontroli un patoloģiski mainītiem nieru audiem (MCDK, CNF, FSGS)PCt epitēlija šūnu augstums (n {0}} katrā grupā) tika salīdzināts starp kanāliņu šūnām veselos nieru audos un patoloģiski izmainītos nieru audos (5b, c, f attēls). Vidējais epitēlija šūnu augstums HC bija 12,91 µm ± 1,847 µm un bija ievērojami augstāks, salīdzinot ar CNF un FSGS (attiecīgi p < 0,0001).="" vidējais="" šūnu="" augstums="" cnf="" pct="" bija="" 9,011="" µm="" ±="" 1,453="" µm,="" savukārt="" fsgs="" bija="" 8,114="" µm="" ±="" 0,9248="" µm.="" mcdk="" pct="" epitēlija="" šūnas="" neuzrādīja="" būtiskas="" auguma="" izmaiņas="" (12,17="" µm="" ±="" 1,476="" µm),="" salīdzinot="" ar="">

2.2.8. Primāro skropstu garuma atšķirības starp veselīgu kontroli un patoloģiski mainītiem nieres audiem (MCDK, CNF, FSGS)

Primārās cilmes garums (n= 50 katrā grupā) tika salīdzināts starp HC un patoloģiski izmainītiem nieru audiem (6.c attēls). Veselīgi nieru audi un MCDK tika iekrāsoti ar -tubulīnu, lai pārliecinātu par -tubulīna ciliuma krāsošanas specifiku (6.a, b attēls). Veselos nieru audos primārais cilijs bija 5,065 µm ± 1,229 µm garš, savukārt MCDK gadījumā CNF un FSGS bija ievērojami garāks (p<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>

Diskusija

Mūsu pētījuma mērķis bija izpētīt atubulīna, inversijas un DVL-1 imūnhistoķīmisko ekspresiju auglim.nieruaudu un pēcdzemdību nieru audu. Turklāt mēs vēlējāmies izpētīt, vai a-tubulīna, inversijas un DVL-1 ekspresija un krāsošanas modelis ir traucēts dažādās nieru slimībās, salīdzinot ar veselīgu kontroli. Proti, neskatoties uz citu pētnieku plašo interesi par a-tubulīna, inversijas un DVL-1 lomu nieru attīstībā, lielākajā daļā iepriekšējo pētījumu ir izmantoti dzīvnieku vai in vitro eksperimentālie modeļi. Cik mums zināms, šis ir pirmais pētījums, kas parādīja a-tubulīna ekspresiju un lokalizāciju kopā ar inversiju un DVL-1 augļa un pēcdzemdību cilvēka nierēs, un kurā tika pētīta minēto proteīnu ekspresija nierēs. slimības, piemēram, MCDK, FSGS un CNF. Mēs arī analizējām skropstu garuma un izskata izmaiņas ar gaismas un elektronu mikroskopiju, jo mūsu iepriekšējais pētījums jau norādīja, ka ciliāru traucējumi var būt saistīti ar cistoģenēzi FSGF un CNF [19].

Kanoniskajā Wnt-signalizācijas ceļā Wnt ligandu saistīšanās ar receptoriem piesaista Dvl [37]. MET un plakanās šūnu polaritātes ceļa procesus nieru morfoģenēzes sākumposmā kontrolē Wnt signalizācija. Veicot Wnt ceļu, primārās skropstas kontrolē šūnu proliferāciju, diferenciāciju un audu morfoģenēzi [12], organizējot šūnu citoskeletu un šūnu orientāciju, kā arī cauruļveida struktūras pagarinājumu [2,38]. Mūsu pētījumā -tubulīns, inversija un DVL-1 bija sastopami nieru struktūrās, un tie visi tika kolokalizēti ne tikai augļa nieru attīstības laikā, bet arī nieru audos no 1.5- un {{9 }}gadus veciem bērniem. Šie atklājumi saskan ar Wnt-signalizācijas ceļa aktivizēšanu, kas tika pierādīts jau tubuloģenēzes laikā [39]. Turklāt mūsu rezultāti atklāja, ka -tubulīna un inversijas izpausme ir savstarpēji saistītas ar DVL-1 un ka tie uzrāda statistiski nozīmīgu atšķirību starp to izteiksmes modeļiem. Tas ir saistīts ar eksperimentāliem modeļiem, jo ​​pilnas Dvl proteīnu saimes mutācijas pelēm izraisa gastrulācijas procesa trūkumu, savukārt mutācijas, kas neietver visu proteīnu saimi, uzrāda mezglu skropstu izvietojuma defektus un orgānu defektus [40] . Iepriekšējie atklājumi liecināja, ka inversijai ir nozīme šūnu migrācijā Xenopus pronephros. Tā kā šis segments korelē ar zīdītāju Henles cilpu un distālajiem kanāliņiem, tas varētu norādīt uz inversijas nozīmi nieru attīstības laikā arī cilvēkiem [41]. Saskaņā ar šo pieņēmumu iepriekšējie pētījumi atklāja, ka inversijas gēna mutācija var izraisīt 2. tipa nefronoftizi, ko izraisa patoloģiska DVL-1 ekspresija [42]. Neskatoties uz to, ka primārā ciliuma loma Wnt-signalizācijas ceļa regulēšanā ir pretrunīga, mēs atklājām, ka analizētajos nieru paraugos -tubulīns kolokalizējas ar inversiju un DVL -1. Turklāt iepriekšējie pētījumi norādīja, ka primārais cilijs kopā ar inversiju regulē Dvl degradāciju, ietekmējot Wnt-signalizācijas ceļu [43]. Cilvēka nieru slimībās, kas saistītas ar cistu attīstību, ir novērota primāro skropstu patoloģiska lokalizācija un funkcija [19]. Tāpat šis pētījums apstiprināja arī primāro skropstu veidošanās morfoloģiskās izmaiņas patoloģiskos apstākļos, piemēram, CNF, FSGS un MCDK. Iepriekšējie atklājumi atzina, ka kanoniskā Wnt ceļa pārmērīga aktivizēšana pēc nieru bojājumiem izraisa neatgriezeniskas nieru audu struktūras izmaiņas [44]. Gluži pretēji, primārajam cilijam tika piešķirta loma pārslēgties no kanoniskā uz nekanonisko Wnt ceļu, palīdzotnieruremonts. Turklāt tika konstatēts, ka kanoniskā Wnt ceļa pārmērīgai aktivizēšanai transplantētos nieru audos ir pozitīva paredzamā vērtība attiecībā uz nieru fibrozi [45]. Ja kanoniskais Wnt ceļš dominē uz nekanoniskā rēķina, tas atbalsta nieru fibrozes teoriju kā rezultātu. Mūsu konstatējumi par pazeminātu tubulīna un inversijas ekspresiju CNF un FSGS nozīmē nekanoniskā Wnt ceļa neaktivitāti, jo īpaši tāpēc, ka abi apstākļi mēdz izraisīt beigu stadiju.nieru slimība.Proti, tiek uzskatīts, ka primārā ciliuma normāla lokalizācija un funkcija varētu būt faktors regulāra Wnt ceļa uzturēšanai un līdz ar to normālas attīstības priekšnoteikums. Turpretim, ja tiek uzlabots Wnt ceļš, tas var izraisīt neregulētu šūnu proliferāciju un diferenciāciju, kas izraisa kanceroģenēzi [46]. Kā aprakstīts iepriekš, kanoniskais Wnt ceļš ir obligāts MET ierosināšanai un nefrona veidošanai, savukārt tā traucējumi var izraisītnieruhipoplāzija [47]. Mūsu rezultāti atbalsta šo ideju, atklājot zemāko DVL-1 ekspresiju ar augstāko -tubulīna ekspresiju MCDK, salīdzinot ar veselīgu kontroli. Šie rezultāti var norādīt uz zemāko kanoniskā Wnt ceļa aktivizāciju, kas varētu būt nefronu veidošanās trūkuma iemesls. Turpretim augstākā -tubulīna ekspresija ar zemāko DVL-1 izteiksmi varētu izskaidrot vairāku cistu konstatējumus, jo nav organizētas pagarinājuma un šūnu polarizācijas, ko vada nekanoniskais Wnt ceļš. Iepriekšējie pētījumi arī parādīja, ka inversija kavē kanonisko Wnt signalizācijas ceļu, mērķējot uz Dvl degradācijai [26]. Tika konstatēts, ka šis to mijiedarbības solis ir nepieciešams, lai kavētu kanonisko Wnt-signalizāciju, lai uzturētu normālu cauruļveida pagarinājumu un pozicionēšanu. Inversijas mutācijas rezultātā tiek regulēta kanoniskā Wnt signalizācija, kas pēc tam izraisīja patoloģisku proliferāciju cauruļveida šūnās. Ir pierādīts, ka šis solis ir izšķirošs cistoģenēzē [42], savukārt inversijas izslēgšana pelēm izraisa policistisku nieru slimību [48]. Saskaņā ar teoriju parnierucistoģenēzē, inversija tiek uzskatīta par "mikoproteīnu", jo tā lokalizējas primārajās ciliānierucauruļveida šūnas. Mūsu pētījumā primārās skropstas atradās uz tubulāro šūnu apikālo šūnu virsmas visos analizētajos posmos, savukārt augļa stadijās -tubulīna ekspresija bija spēcīgāka nekā pēcdzemdību periodā.

CISTANČE UZLABOS NIERU/NIeru SĀPES

Iepriekšējie pētījumi liecina, ka primāro skropstu funkciju var ietekmēt -tubulīna disregulācija attīstības laikā, kas var izraisīt cistoģenēzi, patoloģisku nieru attīstību un iespējamu hronisku nieru slimību bērnībā [31,49]. Tas ir saskaņā ar mūsu konstatējumiem par saīsinātām un dismorfiskām primārajām skropstiņām, kas novērotas MCDK, vai ar vairākām un ārkārtīgi iegarenām vai izmežģītām cilijām, kas konstatētas paplašinātās CNF un FSGS kanāliņos, salīdzinot ar veselīgu kontroli. Lai apstiprinātu faktu, ka primāro skropstu regulētie kanoniskie un nekanoniskie Wnt-signalizācijas ceļi tiek uzskatīti par obligātiem normālai nieru attīstībai, mēs konstatējām ievērojami zemāku inversijas un DVL-1 iekrāsošanos MCDK, salīdzinot ar veselīgu kontroli. [31,49]. Atšķirīga -tubulīna, inversijas un DVL-1 ekspresijas modeļa dinamika dažādās nieru attīstības fāzēs var liecināt par pārslēgšanos starp kanonisko un nekanonisko Wnt-signalizācijas ceļu normālas nieru morfoģenēzes laikā. Mēs iesakām, ka to apmaiņa nosaka transkripciju kanoniskā ceļā vai šūnu migrācijas un polarizācijas secību nieru attīstības laikā nekanoniskā signalizācijas ceļā. To līdzsvars un izpausme visās pētītajās nieru struktūrās nozīmē to svarīgo lomu normālā nieru attīstībā. Normālas nieru attīstības laikā (no 13. GW līdz 38. GW) kopējā -tubulīna, inversijas un DVL-1 ekspresija samazinās, jo nieru audi iegūst nobriedušu morfoloģiju. 1.{15}} un 7-gadu vecos nieru audos -tubulīns un inversija uzrādīja nelielu ekspresijas pieaugumu, kas apstiprina faktu, ka nekanoniskais Wnt ceļš paliek aktīvs pēc piedzimšanas. Gluži pretēji, DVL-1 saglabājas ar samazinātu ekspresijas modeli, kas varētu pievienot secinājumu, ka kanoniskais Wnt ceļš ir apklusināts veselos nieru audos. Patoloģisku nieru stāvokļu rezultātā nieres epitēlija šūnas var reaģēt ar EMT un fibrozes [50] atkārtotu parādīšanos, kas saistīta ar kanoniskā Wnt ceļa reaktivāciju [44]. Tāpēc slimajās nierēs konstatētie -tubulīna, inversijas un DVL-1 traucējumi var būt pamatā esošais patoloģiskais mehānisms un rezultāts pārejai no nekanoniskā uz kanonisko Wnt ceļu jaunattīstības nierēs, kas norāda uz pāreju no atgriezeniskas uz neatgriezenisku nieri. bojājumu. Turklāt izmaiņas to pirmsdzemdību un pēcdzemdību periodānieruekspresijas modelis var būt saistīts ar nieru darbības traucējumiem pieaugušā vecumā, izraisot iedzimtas slimības un hronisku nieru mazspēju.

4. Materiāli un metodes

4.1. Cilvēku paraugi

Augļa nieru audu paraugi tika savākti pēc grūtniecības pārtraukšanas 14., 15., 16., 22. un 38. GW Splitas Universitātes slimnīcas centra Ginekoloģijas un dzemdniecības nodaļā. Visu iegūto augļa materiālu pārbaudīja patologs, un pētījumam tika izmantoti tikai audi bez anomāliju, macerācijas vai intrauterīnās nāves pazīmēm un ar normālu kariogrammu. Pirms paraugu ņemšanas tika pārbaudīti māšu medicīniskie dokumenti, un veselības problēmu gadījumā, kas varētu ietekmēt grūtniecības iznākumu, nieru audi tika izslēgti no pētījuma. Briedumu noteica galvas apkārtmērs, vēdera apkārtmērs un augšstilba kaula garums [51] korelācijā ar pacientu menstruāciju kalendāriem. 15- un 7-gadu vecu nieru audu paraugi tika savākti pēc nejaušas nāves. Paraugi tika iegūti Splitas Universitātes slimnīcas centra patoloģijas nodaļā. Multicistisko displāzisko nieru audu (MCDK) paraugi tika iegūti pēc grūtniecības pārtraukšanas, fokusa segmentālā glomeruloskleroze (FSGS) un somu tipa nefrotiskais sindroms (CNF) tika iegūti nefrektomijas dēļ. Visu iegūto materiālu pārbaudīja un novērtēja patologs, kurš klasificēja diagnozes. Pētījuma protokolu apstiprināja Splitas Medicīnas skolas universitātes Ētikas komiteja (2016. gada 20. maijā) saskaņā ar Helsinku deklarāciju un tās atjauninājumiem (klasifikācijas Nr.: 003-08/16-03/0001, reģistra Nr.: 2181-198-03-04-16-0024, 2016. gada 20. maijs) [52].

4.2. Imūnhistoķīmija

Savāktā audu parauga fiksācija tika apstrādāta ar 4% paraformaldehīdu fosfātu buferšķīdumā (PBS) 24 stundas 22 ◦C temperatūrā. Pēc dehidratācijas 100% etanolā paraugi tika iestrādāti parafīnā, kā aprakstīts iepriekš [53]. Paraugi tika sagriezti 5 µm biezās daļās, izmantojot mikrotomu, un pēc tam uzstādīti uz mikroskopa priekšmetstikliņiem. Lai pārbaudītu audu saglabāšanos, katra 10. sekcija tika iekrāsota ar hematoksilīnu un eozīnu [54]. Departfeminizācija un imūnhistoķīmija tika veikta, kā aprakstīts iepriekš [2, 55, 56]. Pēc skalošanas PBS mikroskopa priekšmetstikliņus nakti inkubēja ar primārajām antivielām mitrā kamerā 22 ◦ C temperatūrā (StainTray priekšmetstikliņu krāsošanas sistēma; Sigma-Aldrich, Sentluisa, MO, ASV). Primārās izmantotās antivielas bija truša monoklonālā anti-alfa tubulīna antiviela (atšķaidījums 1:1000; ab179484, Abcam, Kembridža, Apvienotā Karaliste), Rabbit Polyclonal Anti-inversion antiviela (atšķaidījums 1:100; ab65187, Abcam, MoVL, Kembridža, UK). -1 antiviela (1:150 atšķaidījums; sc-8025, Santa Cruz Biotechnology, Dalasa, Teksasa, ASV) un trušu poliklonāla anti-gamma tubulīna antiviela (lai pārbaudītu primāro skropstiņu specifisko krāsojumu ar alfa- tubulīns, atšķaidījums 1:500; ab11321, Abcam, Kembridža, Apvienotā Karaliste). Pēc skalošanas PBS, stundu tika ievadītas sekundārās antivielas, kā norādīts: ēzeļa anti-trušu IgG H&L, Alexa Fluor 488 (atšķaidījums 1:400; ab150073, Abcam, Kembridža, Apvienotā Karaliste) un kazu anti-peļu IgG H&L, TRITC (atšķaidījums). 1:400; ab6786, Abcam, Cambridge, UK) 4',6-diamidino-2-fenilindola dihidrohlorīds (DAPI) tika izmantots kodolu iekrāsošanai un pēc 2-minūtes inkubācijas priekšmetstikliņus tika mazgāti PBS un pārklāti ar montāžas līdzekli un pārklājumiem. Nespecifiska krāsošana tika novērsta, izmantojot proteīna bloku (ab64226; Abcam, Kembridža, Apvienotā Karaliste) pirms primārās antivielu lietošanas. Kā negatīva kontrole tika veikts iepriekšējas adsorbcijas tests, savukārt sekundāro antivielu specifika tika pārbaudīta, krāsošanas procedūrās izlaižot primārās antivielas.

4.3. Elektronu mikroskopija

Fiksācija nonieresaudi tika veikti 4% paraformaldehīdā 24 stundas, kam sekoja pēcfiksācija 1% osmija tetroksīdā 1 stundu. Dehidratācijas process tika veikts ar etanola sēriju un pabeigts ar iestrādāšanu LX 112 sveķos [22]. Viena mikrometra plānas sekcijas tika iekrāsotas, izmantojot toluidīna zilo krāsu, un pētītas, lai atlasītu īpaši plānas sekcijas. Pēc iekrāsošanas ar uranilacetātu un svina citrātu tika pārbaudītas īpaši plānas sekcijas, kuru biezums bija 0,05 mikrometri. Mikrofotogrāfiju iegūšanai tika izmantots JEOL 1200 EX mikroskops.

4.4. Ģenētiskā analīze

Kā aprakstīts iepriekš [19], izmantojot leikocītus no perifērajām asinīm, tika ekstrahēta genoma DNS. Tika konstatēta homozigota missense mutācija NPHS1 gēnā (c.1096A > C; p.Ser366Arg), kas apstiprināja somu tipa iedzimta nefrotiskā sindroma (CNF) diagnozi [57].

CISTANČE UZLABOS NIeru/NIeru INFEKCIJU

4.5. Datu analīze

Sekcijas analīze tika veikta ar FL fluorescences mikroskopu, izmantojot 3 FL fluorescences kanālus (Olympus BX51, Tokija, Japāna). Attēli tika uzņemti ar digitālo kameru DP71 (Olympus, Tokija, Japāna) ar lieljaudas (×40) palielinājumu. Tikainieruinteresi raisīja garoza, kas satur proksimālus vītņotus kanāliņus (pct), distālos vītņotus kanāliņus (dct) un glomerulus (g). Pēc tam attēlus apstrādāja ImageJ programmatūra (Rasband, WS, ImageJ, ASV Nacionālie veselības institūti, Bethesda, MD, ASV, https://imagej.nih.gov/ij/ (piekļuve 2018. gada 15. oktobrī), 1997–2021. ) un Adobe Photoshop (Adobe Inc., Sanhosē, Kalifornija, ASV), lai veiktu turpmāku novērtēšanu. Pirms šūnu skaitīšanas tika izmantots sadalīto kanālu ImageJ rīks. Pēc tam sākotnējais imunofluorescences mikroskopiskais fotoattēls tika atņemts ar sarkano vai zaļo kanālu (atkarībā no tā, kāds bija sākotnējais kanāls), izmantojot attēla kalkulatora ImageJ rīku, lai novērstu signāla noplūdi. Vērtības zem sliekšņa līmeņa 50 tika uzskatītas par negatīvām. Mēs saskaitījām imūnreaktīvos signālus šūnās ar vismaz 20 struktūrām (pct, dct vai g) katrā stadijā vai kopējo pozitīvo šūnu skaitu uz multicistiskas displastikas mikrofoto.nieresaudu, FSGS un CNF. Mēs klasificējām šūnas kā pozitīvas, ja imunofluorescences signāls uzkrājas jebkurā membrānas, citoplazmas vai kodola līmenī virs vērtības 50, ko mēra ImageJ programmatūrā, izmantojot sliekšņa komandu. Negatīvās šūnas tika klasificētas kā šūnas, kurām nebija imūnreaktivitātes. Divi neatkarīgi izmeklētāji analizēja datus.

4.6. Puskvantitatīvā analīze

Tubulīna, inversijas un DVL-1 krāsošanas signāla intensitāti novērtēja divi neatkarīgi pētnieki, izmantojot ImageJ programmatūru. Kopējā signāla intensitāte tika mērīta pēc tam, kad attēls tika iestatīts 8-bitu veidā; pēc tam marķiera iekrāsošanās intensitāte tika novērtēta 20 %, dct un g, mērot struktūras kontūras laukumu. Ja rezultāti starp vērtētājiem bija atšķirīgi, šaubas noskaidroja trešais neatkarīgais pētnieks. Maksimālā signāla intensitāte tubulīnam bija 84,125 ± 3,214 SD, inversijai bija 71,50 ± 2,715 SD un DVL-1 80,916 ± 1,875 SD. Augstākais signāla krāsu piesātinājums mikroskopa fotogrāfijās tika atzīmēts kā 3 (66,66–99,99 procenti no kopējā signāla attēla intensitātes), kam sekoja 2 (33,33–66,66 procenti) vidējai signāla intensitātei un 1 (0,33–33,33 procenti). zemai signāla intensitātei (1. tabula).

4.7. Statistiskā analīze

Lai noteiktu atšķirības starp posmiem un konstrukcijām, tika veikts Kruskal-Wallis tests, kam sekoja Danna post hoc, izmantojot GraphPad Prism programmatūru (Graphpad Software Inc., Sandjego Kalifornija, ASV, www.graphpad.com (apskatīts 15. oktobrī). 2018.)). Pozitīvo šūnu skaits tika izteikts procentos kā vidējā vērtība ± standartnovirze (SD), bet statistiskais nozīmīgums tika atzīts pie p < 0,05.="" analizēto="" struktūru="" skaits="" bija="" 4200="" 35="" paraugos,="" un="" kopējais="" saskaitīto="" šūnu="" skaits="" bija="" 135="" 256.="" mēs="" izmantojām="" 2-way="" anova="" ar="" sidaka="" post="" hoc="" testu,="" lai="" pārbaudītu="" atšķirības="" -tubulīna,="" inversijas="" un="" dvl{10}}="" izteiksmē="" dažādos="" attīstības="" posmos.="" lai="" pētītu="" olbaltumvielu="" ekspresiju="" attiecībā="" uz="" attīstības="" laiku,="" mēs="" izmantojām="" lineāro="" regresiju.="" tika="" izmantota="" vienvirziena="" anova,="" kam="" sekoja="" tukey="" post="" hoc="" tests,="" lai="" izpētītu="" atšķirības="" -tubulīna,="" inversijas="" un="" dvl-1="" izteiksmē="" veseliem="">nieresaudu, salīdzinot ar MCDK, FSGS un CNF audiem. Atšķirības proteīnu ekspresijā starp MCDK, FSGS un CNF tika pētītas ar 2-way ANOVA, kam sekoja Sidaka post hoc tests. Vienvirziena ANOVA, kam sekoja Tukey post hoc tests, tika izmantota, lai novērtētu atšķirības skropstu garumā un epitēlija šūnu augstumā pct starp veselīgu kontroli un patoloģisku.nieresaudus. Dati tika parādīti kā vidējā vērtība ± standartnovirze (SD) ar statistisko atšķirību, kas apstiprināta pie p <>