Feniletanoīdu glikozīdu ekstrakcija no Cistanche Tubulosa ar ātrgaitas homogenizācijas ekstrakciju ar bīdes palīdzību

Kontaktpersona: Odrija Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pasts:audrey.hu@wecistanche.com

Wenjing Pei un Ruili Guo

Fons:

Cistanche tubulosair plaši pazīstama tradicionālā ķīniešu medicīna, kuras izcelsme ir Sjiņdzjanā. Tas ir plaši izplatīts Ziemeļāfrikā, Indijā uc Mērķis: Galvenā bioaktīvā sastāvdaļaC. tubulosair feniletanoīdu glikozīdi (PhG). Ehinakozīds un akteozīds ir indikatīvie komponenti PhG noteikšanai, un tos galvenokārt izmanto aknu aizsardzībai, imūnaizsardzībai utt. Tāpēc ir ļoti svarīgi iegūt PhG no C. tubulosa. Metodes: šajā pētījumā tika salīdzinātas ekstrakcijas ar ultraskaņas palīdzību (AAE), ekstrakcijas ar mikroviļņu palīdzību (MAE) un ātrgaitas bīdes homogenizācijas ekstrakcijas (HSHE) metodes. Turklāt tika optimizēti HSHE metodes ekstrakcijas apstākļi. Rezultāti: Rezultāti parādīja, ka HSHE metode bija labāka par AAE un MAE metodēm, un optimālie HSHE ekstrakcijas parametri bija etanola koncentrācija 50 procenti, ekstrakcijas temperatūra 70 grādi, rotācijas ātrums 16 000 apgr./min., ekstrakcijas laiks 2 min, cietās vielas un šķidruma attiecība 1:9 un viens ekstrakcijas cikls. Ehinakozīda un akteozīda iznākums bija attiecīgi 1,366 un 0,519 procenti, un ehinakozīda un akteozīda pārneses ātrums sasniedza attiecīgi 87 un 94 procentus. Secinājumi: Var secināt, ka HSHE metode ir vienkārša, ātra un efektīva metode PhG ekstrakcijai no C. tubulosa. Galvenās iezīmes: ir izpētīta efektīva un videi draudzīga HSHE metode PhG ekstrakcijai no C. tubulosa. Tika iegūti HSHE metodes optimālie apstākļi PhG ekstrakcijai no C. tubulosa. Šis pētījums nodrošina jaunu metodi PhG rūpnieciskai ekstrakcijai noC. tubulosa.

Cistanche tubulosa

Cistanche tubulosair izplatīta tradicionālā ķīniešu medicīna, kuras izcelsme ir Sjiņdzjanā. Tas ir plaši izplatīts Āfrikas ziemeļos, Arābijas pussalā, Pakistānā un Indijā, un 2010. gadā oficiāli tika reģistrēts Ķīnas farmakopejā. Galvenā bioaktīvā sastāvdaļaC. tubulosair feniletanoīdu glikozīdi (PhG), ūdenī šķīstošu dabisko produktu klase, tostarp ehinakozīds, akteozīds, izoakteozīds un 2-acetilakteozīds (1, 2). PhG struktūra sastāv no kanēļskābes un hidroksifeniletilgrupām, kuras abas ir pievienotas glikopiranozei, izmantojot attiecīgi esteru un glikozīdu saites (3). Farmakoloģiskie pētījumi ir parādījuši, ka C. tubulosa PhG ir daudzas ārstnieciskas funkcijas, piemēram, pretnoguruma (4), neiroprotektīva (5–7), aknu aizsargājoša (8–10) un imūnaizsargājoša iedarbība (11). Tāpēc efektīvai PhG ekstrakcijai no C. tubulosa ir liela nozīme dabisko produktu attīstībā un izmantošanā.

Pašreizējās tradicionālās PhG ekstrakcijas metodes ir ekstrakcija ar karsto atteci, ekstrakcija ar ultraskaņu (AAE) un ekstrakcija ar mikroviļņu palīdzību (MAE; 12–16). Šīm metodēm ir dažādi trūkumi, piemēram, zema efektivitāte, ilgs ekstrakcijas laiks un augstas izmaksas. Salīdzinot ar tradicionālajām metodēm, ātrgaitas bīdes homogenizācijas ekstrakcijas (HSHE) metode ir jauna, jauna ekstrakcijas metode, un tās priekšrocības ir ātrāks ekstrakcijas laiks, mazāk šķīdinātāju atkritumu, lielāka ražība, vienkāršāka ierīce un vieglāka darbība (17). HSHE metodes darbības princips ir balstīts uz rotējošu iekšējo griezēju, ko darbina ātrgaitas motors. Iekšējie un ārējie griezēji rada spēcīgu bīdes spēku, lai izjauktu un sajauktu paraugus. Tikmēr griezējs ar ātrgaitas rotāciju izraisa spiediena atšķirības starp griezēja iekšējo un ārējo dobumu, kā rezultātā notiek masas pārnese starp paraugiem un šķīdinātājiem. Kombinējot lielu bīdes spēku, sadursmes spēku, spiedienu un citus spēkus, var ātri panākt šķīstošu līdzsvaru starp cietajiem paraugiem un šķīdinātājiem (18). Tādējādi HSHE ekstrakcijas procesu var pabeigt dažās minūtēs un pat tik ātri kā desmitiem sekunžu (19–22).

Nesen HSHE ir pētīta bioaktīvo komponentu ieguvē no dažādiem dabīgiem produktiem (23–25). Cheng et al. izmantoja HSHE, lai no Schisandra Chinensis (26) augļiem iegūtu piecus lignānus. Rezultāti parādīja, ka optimālie apstākļi bija etanola koncentrācija 75 procenti, ekstrakcijas laiks 1 minūte, cietās vielas un šķidruma attiecība 1:19, ekstrakcijas spriegums 180 V un parauga daļiņa. 120 acu izmērs. Piecu lignānu kopējā iznākums optimizētajos apstākļos bija 13,89 ± 0,014 mg/g. Tang et al. izmantoja HSHE, lai iegūtu bioaktīvu eļļu no perillas sēklām (27). Optimālie apstākļi bija ekstrakcijas laiks 2 min, cietās vielas un šķidruma attiecība 1:10, ekstrakcijas spriegums 150 V un divi ekstrakcijas cikli. Perillas sēklu eļļas raža sasniedza 59,3 procentus. Iepriekš minētie rezultāti liecina, ka HSHE priekšrocības ir īss ekstrakcijas laiks, zemas izmaksas un augsta raža. Tomēr trūkst pētījumu par PhG ieguvi, ko veic HSHE.

Šajā pētījumā HSHE tika izmantots, lai izpētītu tā iespējamo pielietojumu PhG ekstrakcijā noC. tubulosa. PhG iznākums tika noteikts ar HPLC. Trīs ekstrakcijas metodes, HSHE, AAE un MAE, tika salīdzinātas tādos pašos apstākļos. Tika pētīta etanola koncentrācijas, ekstrakcijas temperatūras, rotācijas ātruma, ekstrakcijas laika, cietās un šķidruma attiecības un ieguves ekstrakcijas ciklu skaita ietekme. Tiek salīdzinātas un apspriestas šī darba priekšrocības un trūkumi, kā arī izmantotās atsauces.

Materiāli un metodes

Materiāli un ķīmiskie reaģenti

C. tubulosatika iegādāts no Xinjiang Congrongtang Biological Technology Co., Ltd (Sjiņdzjana, Ķīna). Ehinakozīda (tīrības pakāpe ir lielāka par vai vienāda ar 98 procentiem) un akteozīda (tīrības pakāpe, kas lielāka vai vienāda ar 98 procentiem) standarti tika iegādāti no Shanghai Standard Biological Technology Co., Ltd (Šanhaja, Ķīna). Acetonitrils, metanols un etiķskābe bija HPLC kvalitātes (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). Analītiskās kvalitātes etanols tika iegādāts no Tianjin Yongsheng Fine Chemical Co., Ltd (Tianjin, Ķīna). Visā eksperimentā tika izmantots dejonizēts ūdens.

HPLC analīze

HPLC analīze tika veikta ar Waters e2695 šķidruma hromatogrāfiju (Waters, Milford, MA), kas aprīkota ar 2489 UV/redzamo detektoru un Symmetry C18 kolonnu (Waters), 250 × 4,6 mm, 5 μm daļiņu izmērs. Ehinakozīda un akteozīda koncentrācijas tika analizētas ar HPLC metodi. Mobilā fāze sastāvēja no (1) acetonitrila un (2) 2% ledus etiķskābes ūdens šķīduma. Gradienta eluēšanas programma ir parādīta 1. tabulā.

Noteiktais viļņa garums bija 330 nm, plūsmas ātrums bija 1 ml/min, injekcijas tilpums bija 10 μL, un krāsns temperatūra tika iestatīta uz 30 grādiem. Analīta hromatogrāfisko maksimumu apstiprināja, salīdzinot tās aiztures laiku ar standartu aiztures laiku. Kvantitatīvā noteikšana tika veikta, integrējot maksimumu, izmantojot ārēju standarta metodi.

Precizitātes tests tika veikts, injicējot tos pašus ekstrakcijas paraugus piecas reizes. Stabilitātes testā tie paši paraugi tika analizēti ar soli 0, 1, 2, 4, 12, 24 un 48 h. Ehinakozīda un akteozīda reģenerācijas testi tika veikti, ekstrakcijas paraugiem pievienojot standartus. Tika reģistrēti visi ehinakozīda un akteozīda pīķa laukumi un aiztures laiki. Ehinakozīda un akteozīda kalibrēšanas līkņu rezultāti ir norādīti 2. tabulā.

Ienesīguma aprēķins

Ehinakozīds un akteozīds tika izmantoti kā indikatīvie komponenti PhG noteikšanai. Ehinakozīda vai akteozīda iznākums tika aprēķināts, izmantojot šādu vienādojumu:

J=CV/W × 100 procenti (1)

kur Y=ehinakozīda vai akteozīda iznākums (procentos); C=ehinakozīda vai akteozīda koncentrācija (mg/ml); V=ekstrakcijas šķīduma tilpums (ml); un W=C. tubulosa pulvera svars (mg).

PhG ekstrakcijas metodes

C. tubulosa stublāji vispirms tika slīpēti ar elektrisko dzirnaviņām (JC-500g; Yongkang Kaiyuan Industry & Trade Co., Ltd, Yongkang, Ķīna) un filtrēti ar filtra sietu (aptuveni 380 μm). Pēc tam C. tubulosa pulveri žāvēja cepeškrāsnī 70 grādu temperatūrā, līdz svars kļuva nemainīgs. Piecus gramus C. tubulosa pulvera sajauca ar ekstrakcijas šķīdinātāju un ievietoja ekstrakcijas pudelē. Pēc tam šķidrais maisījums tika uzkarsēts (30–80 grādi) 5 minūtes nemainīgas temperatūras ūdens vannā (DF-101S; Jintan Analytical Instrument Co., Ltd, Jintan, Ķīna).

(a) HSHE metode. HSHE tika veikta ar FA25 sistēmu (FLUKO Co., Ltd, Šanhaja, Ķīna), kas sastāvēja no rotējoša griezēja, ātrgaitas motora un kontrollera. Iekšējā griezēja griešanās ātrums tika regulēts diapazonā no 10 000 līdz 28 000 apgr./min, un ekstrakcijas laiki tika regulēti diapazonā no 2 līdz 15 minūtēm.

(b) AAE metode. Pieci grami žāvēta parauga un 300 ml metanola tika precīzi nosvērti un pievienoti ekstrakcijas pudelē. Ekstrakcijas pudele tika iegremdēta ultraskaņas vannā un tika veikta ar ultraskaņas jaudu 300 W 10 minūtes. Ekstrakcijas temperatūra tika iestatīta uz 30 grādiem.

c) MAE metode. Pieci grami žāvēta parauga un 300 ml metanola tika precīzi nosvērti un pievienoti ekstrakcijas pudelē. Ekstrakcijas pudele tika ievietota mikroviļņu reaktorā un veikta ar 180 W 10 minūtes. Ekstrakcijas temperatūra tika iestatīta uz 30 grādiem.

HSHE metode tika salīdzināta ar AAE un MAE metodēm ar vienādu ekstrakcijas šķīdinātāju, ekstrakcijas laiku, ekstrakcijas temperatūru, cietās vielas un šķidruma attiecību un ekstrakcijas cikla numuru. Ekstrakcijas šķīdumu filtrēja ar 0,22 μm membrānu un analizēja ar HPLC, lai noteiktu ehinakozīda un akteozīda koncentrāciju. Visi ekstrakcijas procesi tika atkārtoti trīs reizes

Pārskaitījuma kursu noteikšana

Pamatojoties uz standarta metodi 2015 Ķīnas farmakopejā, tika noteikts ehinakozīda un akteozīda saturs C. tubulosa pulverī (28). Precīzi nosvēra vienu gramu C. tubulosa pulvera un 50 ml 50 procentu metanola un pievienoja 50 ml brūnā mērkolbā. Šķidrais maisījums tika nosvērts un iemērc 30 minūtes. Pēc tam brūno mērkolbu iegremdēja ultraskaņas vannā un veica ar ultraskaņas jaudu 250 W un frekvenci 35 kHz 40 minūtes. Šķidrais maisījums tika atkārtoti nosvērts un pievienots 50% metanols, lai nodrošinātu šķīdinātāja zudumu. Ekstrakcijas šķīdumu filtrēja ar 0, 22 μm membrānu un analizēja, izmantojot HPLC, lai noteiktu ehinakozīda un akteozīda koncentrāciju. Ekstrakcijas procesus atkārtoja trīs reizes.

Ehinakozīda vai akteozīda pārneses ātrums tika aprēķināts, izmantojot šādu vienādojumu:

X= M1/M2 × 100 procenti (2)

kur X=ehinakozīda vai akteozīda pārneses ātrums (procentos); M1=ehinakozīda vai akteozīda kvalitāte ekstraktā (mg); un ehinakozīda vai akteozīda M2=kvalitāte C. tubulosa pulverī (mg).

Rezultāti un diskusija

HPLC metodes validācija

Ehinakozīda un akteozīda HPLC profili no C. tubulosa, izmantojot HSHE, ir parādīti 1. attēlā. Ehinakozīda un akteozīda pīķu laukumu RSD bija attiecīgi 1,89 un 1,4 0 procenti. Rezultāti parādīja, ka HPLC metodei ir laba ehinakozīda un akteozīda kvantitatīvās analīzes precizitāte. Dažādos laikos (0–48 h) ehinakozīda un akteozīda pīķa apgabalu RSD bija attiecīgi 1,71 un 1,70 procenti, kas norāda, ka paraugs bija stabils 48 stundās. Ehinakozīda un akteozīda atgūšana bija attiecīgi 99,3 un 99,1 procenti, un to RSD bija attiecīgi 0,70 un 0,67 procenti, kas apstiprināja HPLC metodes uzticamību.

Dažādu ekstrakcijas metožu salīdzinājums

Tika veikts HSHE metodes salīdzinājums ar MAE un AAE metodēm attiecībā uz ehinakozīda un akteozīda iznākumu, kura rezultāti parādīti 2. attēlā. Tika novērots, ka ehinakozīda un akteozīda ražas, kas iegūtas ar HSHE, bija augstākas nekā iegūtās. gan MAE, gan AAE. Salīdzinot ar MAE, ehinakozīda un akteozīda raža, ko ieguva HSHE, bija attiecīgi par 20,5 un 20,8 procentiem lielāka. Un, salīdzinot ar AAE, ehinakozīda un akteozīda raža, ko ieguva HSHE, bija attiecīgi par 6,6 un 7,4 procentiem lielāka. Šie rezultāti liecina, ka HSHE var ievērojami palielināt PhG ražu.

HSHE metodes optimizācija

PhG ekstrakcijas parametri, izmantojot HSHE, ietver etanola koncentrāciju, ekstrakcijas temperatūru, rotācijas ātrumu, ekstrakcijas laiku, cietās vielas un šķidruma attiecību un ekstrakcijas ciklu skaitu (26, 29).

Etanola koncentrācijas ietekme uz PhG ekstrakciju

Etanola koncentrācija ir svarīgs faktors, kas ietekmē PhG iznākumu. Kā parādīts 3. attēlā, tika pētīta ehinakozīda un akteozīda iznākums no C. tubulosa dažādās etanola koncentrācijās. Tas atklāja, ka ehinakozīda iznākums palielinājās no 0 līdz 30 procentiem un pēc tam samazinājās no 30 līdz 90 procentiem, palielinoties etanola koncentrācijai. Akteozīda iznākums palielinājās no 0 līdz 70 procentiem un pēc tam samazinājās no 70 līdz 90 procentiem, palielinoties etanola koncentrācijai. Kad etanola koncentrācija bija 50 procenti, ehinakozīda un akteozīda iznākumu summa bija maksimālā. Dažādām etanola koncentrācijām ir atšķirīga polaritāte, kas izraisa atšķirīgu ehinakozīda un akteozīda šķīdību. Tādējādi optimālā etanola koncentrācija bija 50 procenti.

Rotācijas ātruma ietekme uz PhG ekstrakciju

5. attēlā parādīta dažādu rotācijas ātrumu ietekme uz PhG ražu. Ehinakozīda un akteozīda raža palielinājās, palielinoties rotācijas ātrumam. Rotācijas ātruma palielināšana var palielināt iekšējā un ārējā griezēja bīdes spēku, tādējādi palielinot PhG iznākumu. Optimālais griešanās ātrums bija 16000 apgr./min.

Ekstrakcijas laika ietekme uz PhG ekstrakciju

Ehinakozīda un akteozīda iznākums dažādos ekstrakcijas laikos ir parādīts 6. attēlā. Ehinakozīda un akteozīda iznākums bija stabils, palielinoties ekstrakcijas laikam. Tāpēc var secināt, ka PhGs var pilnībā ekstrahēt no C. tubulosa 2 minūtēs, un optimālais ekstrakcijas laiks bija 2 minūtes.

Cietās vielas un šķidruma attiecības ietekme uz PhG ekstrakciju

Kā parādīts 7. attēlā, tika apspriesta ehinakozīda un akteozīda iznākums dažādās cietās vielas un šķidruma attiecībās. Ehinakozīda un akteozīda raža palielinājās no 1:3 līdz 1:9 un kļuva stabila no 1:9 līdz 1:24. Tā kā neliels ekstrakcijas šķīdinātāja daudzums nevar pilnībā izšķīdināt ehinakozīdu un akteozīdu, masas pārneses ātrums tika samazināts. Pārmērīga šķīdinātāju ekstrakcija radīja nevajadzīgus atkritumus. Tāpēc optimālā cietās un šķidruma attiecība bija 1:9.

Ekstrakcijas ciklu skaita ietekme uz PhG ekstrakciju

8. attēlā parādīts, ka vairāku ekstrakcijas ciklu ietekme uz PhG ražu. Ehinakozīda un akteozīda raža palielinājās, palielinoties ekstrakcijas ciklu skaitam. Tomēr ekstrakcijas laiki ievērojami palielinājās, palielinoties ekstrakcijas cikliem, un tika patērēts vairāk enerģijas. Optimālais ekstrakcijas ciklu skaits bija viens.

HSHE metodes salīdzināšana ar citām ekstrakcijas metodēm PhG ekstrakcijai

HSHE metodes rezultāti salīdzinājumā ar citām ekstrakcijas metodēm PhG ekstrakcijai no C. tubulosa ir uzskaitīti 3. tabulā. HSHE ir vienkāršāka un vienkāršāka nekā savienošanas metodes, piemēram, ar ultraskaņas palīdzību ūdens divfāžu ekstrakcija un ultraskaņas mikroviļņu ekstrakcijas tehnoloģija. metodes. Turklāt HSHE ekstrakcijas spiediens ir zemāks nekā spiediena šķidruma ekstrakcijas metode, un pirmās darbības apstākļi ir drošāki. Vēl svarīgāk ir tas, ka no 3. tabulas var redzēt, ka HSHE parāda īsāko ekstrakcijas laiku un vismazāko šķīdinātāja patēriņu starp visām ekstrakcijas metodēm. Var secināt, ka HSHE metodei ir daudz priekšrocību, piemēram, augsta efektivitāte, viegli ekspluatācijas apstākļi, zems patēriņa līmenis, vienkāršs aprīkojums un viegla darbība dabisko produktu ieguvei.

Secinājumi

Šajā pētījumā tika pētīta efektīva un videi draudzīga HSHE metode PhG ekstrakcijai no C. tubulosa. Salīdzinot ar AAE un MAE metodēm, jaunā HSHE metode tādos pašos apstākļos rada lielāku PhG ražu. Salīdzinot ar MAE metodi, ehinakozīda un akteozīda iznākums tika palielināts attiecīgi par 20,5 un 20,8 procentiem. Un, salīdzinot ar AAE, ehinakozīda un akteozīda raža tika palielināta attiecīgi par 6,6 un 7,4 procentiem. Tika optimizēti C. tubulosa PhG HSHE ekstrakcijas parametri. Saskaņā ar optimizētajiem parametriem ehinakozīda un akteozīda iznākums sasniedza attiecīgi 1,366 un 0,519 procentus, un ehinakozīda un akteozīda pārneses ātrums sasniedza attiecīgi 87 un 94 procentus. HSHE metodes priekšrocības ir augsta efektivitāte, viegli darbības apstākļi, zems patēriņa līmenis, vienkāršs aprīkojums, vienkārša darbība un zemas izmaksas. Šis pētījums sniedz jaunu metodi PhG rūpnieciskai ekstrakcijai no C. tubulosa.