Farneziltransferāzes inhibitors LNK{0}} mazina aksonu distrofiju un mazina amiloīda patoloģiju pelēm, 3. daļa

Rezultāti

Samazināta amiloīda aplikuma slodze un tau hiperfosforilācija LNK-754 hroniski ārstētu 5XFAD peļu smadzenēs

LNK-754 un lonafarnibs ir mazmolekulāri FTI, kas iepriekš ir pārbaudīti ar cilvēkiem vēža klīniskajos pētījumos un, kā zināms, šķērso hematoencefālisko barjeru [8, 9, 41, 42]. -sinukleīnu [8] un tau ieslēgumus [9] samazina attiecīgi LNK-754 un lonafarnibs, taču tie vēl nav novērtēti attiecībā pret AD amiloīda fenotipu. Šajā pētījumā mēs pētījām to ietekmi uz amiloido patoloģiju 5XFAD peles modelī. 5XFAD pelēm A nogulsnes attīstās, sākot no 2 mēnešu vecuma [36, 37], un distrofiski neirīti tiek novēroti amiloīda nogulsnēšanās agrīnākajās stadijās [39, 43].

Asins-smadzeņu barjera un imunitāte ir divas ļoti svarīgas cilvēka ķermeņa daļas, un tās ir nesaraujami saistītas. Asins-smadzeņu barjera ir aizsargbarjera starp smadzenēm un asinīm, kas aizsargā smadzenes no kaitīgām vielām no ārpuses. Imunitāte ir svarīgs mehānisms, lai cilvēka ķermenis varētu pretoties slimībām. Tātad, kāda ir īpašā saistība starp hematoencefālisko barjeru un imunitāti?

Pirmkārt, asins-smadzeņu barjera var novērst dažu kaitīgu baktēriju un vīrusu iekļūšanu smadzenēs, tādējādi pasargājot smadzenes no bojājumiem. Turklāt asins-smadzeņu barjera var arī kontrolēt noteiktu vielu caurlaidību, ļaujot tām tikai ierobežotā mērā iekļūt smadzenēs. Tas ir ļoti svarīgi, lai aizsargātu nervu sistēmas veselību, jo pārāk daudz noteiktu iekšējo vielu, kas nonāk smadzenēs, var izraisīt nervu šūnu bojājumus.

Tajā pašā laikā imunitātei var būt arī nozīme smadzeņu aizsardzībā. Cilvēka ķermeņa imūnsistēma var atpazīt patogēnus un kaitīgas vielas un pēc tam ražot atbilstošas ​​antivielas, lai pretotos to invāzijai, tādējādi pasargājot organismu no slimībām. Tomēr, kad daži patogēni vai vielas šķērso hematoencefālisko barjeru un nonāk smadzenēs, imūnsistēma ātri reaģē un ražo antivielas, lai tās uzbruktu un iznīcinātu.

Tāpēc asins-smadzeņu barjerai un imunitātei ir ļoti liela nozīme cilvēka veselības uzturēšanā. Hematoencefālisko barjera novērš kaitīgo vielu iekļūšanu smadzenēs, savukārt imunitāte izvada patogēnus un citas kaitīgas vielas, kas apiet hematoencefālo barjeru un nonāk smadzenēs. Abi strādā kopā, lai nodrošinātu veselīgu smadzeņu darbību.

Rezumējot, asins-smadzeņu barjera un imunitāte sadarbojas, izmantojot savus attiecīgos mehānismus, lai spēlētu svarīgu lomu cilvēku veselībā. Mums jākoncentrējas uz viņu veselības aizsardzību, lai nodrošinātu ķermeņa vispārējo veselību. Var redzēt, ka mums jāuzlabo atmiņa. Cistanche deserticola var ievērojami uzlabot atmiņu, jo Cistanche deserticola ir tradicionāls ķīniešu ārstniecības materiāls ar daudziem unikāliem efektiem, no kuriem viens ir atmiņas uzlabošana. Maltās gaļas iedarbīgumu nodrošina daudzas tajā esošās aktīvās sastāvdaļas, tostarp skābe, polisaharīdi, flavonoīdi utt. Šīs sastāvdaļas var veicināt smadzeņu veselību dažādos veidos.

Noklikšķiniet uz zināt bagātinātājiem, lai uzlabotu atmiņu

Tāpēc, lai tas sakristu ar amiloīda patoloģijas attīstību 5XFAD pelēm, mēs peles 3 mēnešus hroniski ārstējām ar nesēju LNK-754 un lonafarnibu, sākot no 2 mēnešu vecuma. LNK-754 un lonafarnibs tika izšķīdināti nesējā, kurā bija 0,5% nātrija karboksimetilcelulozes, un katru dienu ip injicēja ar 1 mg/kg devu [8, 44].

Vispirms mēs centāmies noteikt hroniskas ārstēšanas ar LNK-754 un lonafarnibu ietekmi uz A aplikuma slogu 5XFAD pelēm, izmantojot imūnfluorescences mikroskopiju attiecībā uz A 42, kas nosaka gan difūzo, gan agregēto amiloīdu un Tiazine Red (TR), kas nosaka tikai fibrilāro aplikumu. serdeņi (1.A att.; S1. att.). Mēs atklājām būtisku pārklājuma samazināšanos smadzeņu garozas reģionos ar LNK754- ārstētām pelēm, salīdzinot ar kontrolierīcēm, kas apstrādātas ar nesēju (1.B attēls). Hipokampā segtais laukums bija ievērojami samazināts pelēm, kas ārstētas ar LNK-754-, salīdzinot ar pelēm, kuras ārstētas ar lonafarnibu, un bija tendence samazināties ar LNK-754 ārstētām pelēm, salīdzinot ar ārstēšanu ar nesēju (att. 1C).

Ar lonafarnibu ārstētām pelēm 42 platība būtiski neatšķīrās no pelēm, kas ārstētas ar nesēju, ne garozā, ne hipokampā (1. A, B att.). Aplikuma lielums tika samazināts garozas un hipokampu smadzeņu reģionos ar LNK-754 ārstēšanu, salīdzinot ar ārstēšanu ar nesēju; šī atšķirība bija statistiski nozīmīga hipokampā (att. 1D, E; att. S2A, B). Būtiska aplikuma lieluma atšķirība starp ārstēšanu ar lonafarnibu un LNK-754 tika novērota arī hipokampā (1. D, E att.; S2A, B att.).

Plāksnes izmērs nemainījās pelēm, kas ārstētas ar lonafarnibu, salīdzinot ar pelēm, kas ārstētas ar nesēju garozas vai hipokampu smadzeņu reģionos (att. 1D, E; att. S2A, B). Plāksnes iesēšana tika kvantitatīvi noteikta, analizējot plāksnes skaitu ar TR krāsošanu. Plāksnīšu skaits ievērojami samazinājās LNK-754 garozā, bet ne hipokampā, salīdzinot ar pelēm, kas ārstētas ar nesēju (S2C, D att.). Aplikuma samazināšanās tika apstiprināta, mērot A 42 ar ELISA metodi PBS un guanidīnā šķīstošos pussmadzeņu homogenātos (1. F, G att.). Līdzīgi kā mūsu imūnfluorescences mikroskopijas rezultātos, ar lonafarnibu ārstētām pelēm bija tendence samazināt A 42 guanidīna un PBS frakcijās, savukārt ar LNK-754 ārstēšanu tika sasniegts ievērojami zemāks A 42 līmenis guanidīna frakcijās (att. 1. F, G).

Tā kā 5XFAD peles modelī ir ziņots par ietekmi uz dzimumu attiecībā uz līdzsvara stāvokļa APP līmeni un aplikuma slodzi [45, 46], mēs veicām imunoblotus peļu tēviņiem un mātītēm, kas tika ārstētas ar nesēju, LNK-754 vai lonafarnibu atsevišķi. transgēnai APP ekspresijai (S3A att.). Transgēnu APP līmeņi tika mērīti ar imūnblotu ar APP 6E10 antivielu, kas atpazīst tikai cilvēka APP, un tas nemainījās peļu tēviņiem vai mātītēm, kas tika ārstētas ar LNK-754, lonafarnibu vai nesēju (S3B-D att.). Otra AD raksturojošā iezīme ir hiperfosforilētu tau ieslēgumu klātbūtne smadzenēs, un kopā ar aplikuma nogulsnēšanos endogēnā peles tau tiek hiperfosforilēta 5XFAD pelēm [47, 48].

Lai noteiktu, vai tau hiperfosforilāciju ietekmēja FTI apstrāde amiloīda peles modelī, tika veikta imūnblota analīze fosfo-tau serīnam 404 (1H att.; S3E att.), epitopam, par kuru zināms, ka AD smadzenēs un 5XFAD pelēs ir hiperfosforilēts [ 47, 49]. Šeit mēs atklājām samazinātu fosfo-tau ser404 līmeni ar lonafarnibu un LNK{9}} ārstēto peļu smadzenēs (1. att. I), bet kopējais tau līmenis nemainījās (1. att. J; S3F att.). Kopumā mūsu rezultāti atklāj, ka 5XFAD peles modelī amiloīda aplikuma slodze un patogēnās tau fosforilēšanās tiek samazināta, veicot farmakoloģisku ārstēšanu ar FTI, lai gan ārstēšana ar LNK-754 bija ievērojami spēcīgāka nekā ar lonafarnibu.

Hroniska ārstēšana ar LNK-754 inhibē proteīnu farnezilāciju 5XFAD peļu smadzenēs

Lai apstiprinātu, ka FTāzes mērķēšana ar LNK-754 un lonafarnibu ar ip injekciju inhibēja proteīnu farnezilāciju 5XFAD peļu smadzenēs, mēs novērtējām dažādus FTāzes substrātus un pakārtotos FTāzes inhibīcijas marķierus pussmadzeņu homogenātos 5XFAD pelēm, kuras hroniski ārstētas ar nesēju LNK. -754 vai lonafarnibu, izmantojot imūnblota analīzi. Vispirms mēs analizējām prelamīnu A, kas uzkrājas, kad tiek inhibēta FTase [50]. Prelamīna A palielināšanās tika novērota ar LNK-754 ārstēto peļu smadzenēs, salīdzinot ar nesēju, bet ar lonafarnibu ārstētām pelēm izmaiņas nenotika (S4A, D att.). Pēc tam mēs apskatījām HDJ-2 — šaperona proteīnu, kas pēc FTI terapijas izmainās uz augšu un tiek plaši izmantots kā FTāzes inhibīcijas marķieris [50]. Saskaņā ar prelamīnu A lēnāk migrējošā HDJ-2 forma bija sastopama pelēm, kas tika ārstētas ar LNK-754-, bet ne ar lonafarnibu ārstētām pelēm (S4B, E att.). LNK754 pelēm tika konstatēts ievērojams lēnāk migrējošo HDJ-2 sugu pieaugums, salīdzinot ar pelēm, kas ārstētas ar nesēju vai lonafarnibu (S4E att.).

Turklāt farnezilēšana aktivizē Ras, tāpēc mēs arī izmērījām tās pakārtotās efektora molekulas ERK1 (P44/P42) fosforilāciju (S4C att.). Lai gan HDJ-2 un prelamīns A netika mainīti, ārstējot ar lonafarnibu, tika novērota tendence samazināt pERK1 (S4F att.). pERK1 tika samazināts arī pelēm, kas tika ārstētas ar LNK-754 (S4F att.). Mūsu rezultāti liecina, ka 1 mg/kg LNK-754 inhibēja FTāzi smadzenēs, tomēr lonafarnibs bija mazāk efektīvs. Tas varētu būt saistīts ar lonafarniba zemāku iedarbību un IC50, kā parādīts iepriekš [41, 51], vai, iespējams, samazinātu smadzeņu iedarbību.

Samazināta LAMP1 uzkrāšanās distrofiskajos neirītos LNK-754 hroniski ārstētām 5XFAD pelēm

Veselos neironos lizosomu komponenti tiek nogādāti endosomās un autofagiskajās organellās distālos neirītos, kas kļūst paskābināti un nobriest retrogrādās pārvietošanās laikā uz neironu somu [52, 53]. Amiloīda plāksnes izjauc šo procesu, kā rezultātā rodas distrofiski neirīti, kas iesprosto disfunkcionālos autofagiskos un endolizosomālos organellus.

Distrofiskie neirīti bloķē BACE1 aksonālo transportu, izraisot A paaudzi distrofiskajos neirītos un ārpusšūnu aplikuma nogulsnēšanos [16–18]. Ir zināms, ka FTI uzlabo lizosomu funkciju un mikrotubulu stabilitāti, tāpēc, lai turpinātu pētīt, kā FTI samazina aplikuma slodzi, mēs īpaši koncentrējāmies uz distrofiskiem neirītiem 5XFAD pelēm.

Lai kvantitatīvi noteiktu distrofisko neirītu uzkrāšanos ap plāksnēm, mēs novērtējām ar lizosomu saistīto membrānas proteīnu 1 (LAMP1), kas ir heterogēnu endolizosomu un autofagisku organellu marķieris. Hipokampu un kortikālos smadzeņu audus no 5XFAD pelēm, kas tika ārstētas ar nesēju, LNK-754 un lonafarnibu, vienlaikus iekrāsoja LAMP1 un A 42, un tika veikta konfokālā imunofluorescences mikroskopija (2.A, B att.).
Tika iestatīts slieksnis, lai likvidētu LAMP1 fluorescences signālus no vezikulām veselos neirītos un somās, lai īpaši analizētu distrofiskos neirītus. LAMP1 aptvertais laukums bija ievērojami samazināts ar LNK-754 ārstētām pelēm garozas un hipokampu smadzeņu reģionos (2. att. C, D), turpretim ar lonafarnibu ārstētām pelēm atšķirības netika novērotas, salīdzinot ar transportlīdzekļa ārstēšanu (2. att. C, D). . Amiloīda plāksnīšu nogulsnēšanās ierosina distrofiju attīstību tuvējos neirītos, galvenokārt aksonos un presinaptiskajos terminālos.

Attiecīgi LNK-754 un lonafarniba ietekme uz distrofiskiem neirītiem atbilst to ietekmei uz aplikuma slodzi (1. att.). Papildu analīze par FTI ārstēšanas ietekmi uz distrofiskiem neirītiem tika veikta, kvantitatīvi nosakot LAMP1 pārklātās platības attiecību pret A 42 zonu, lai noteiktu, vai FTI ierobežo distrofijas lielumu ap plāksnēm. LAMP1:A 42 attiecības samazināšanās tika novērota pelēm, kas ārstētas ar LNK-754, salīdzinot ar pelēm, kas tika ārstētas ar nesējvielu, un LNK-754 un lonafarniba terapija ievērojami atšķīrās (2. E, F att.), norādot, ka LNK -754 peles, kas saistītas ar mazāku distrofisku neirītu skaitu.
Paaugstināts LAMP1 līmenis tika konstatēts peļu pussmadzeņu homogenātos, kas tika ārstēti ar LNK-754 vai lonafarnibu (S5A, B att.), atbilstoši iepriekšējiem pētījumiem, kas liecina, ka lonafarnibs un LNK-754 palielina autolizosomu skaitu un lizosomu membrānas proteīnu un hidrolāžu līmenis [8, 9]. Atbilstoši LAMP1 imūnblota analīzes rezultātiem (S5A, B att.), kopējā LAMP1 imūnkrāsojuma vidējā fluorescences intensitāte bija ievērojami palielināta ar LNK-754 un lonafarnibu ārstēto peļu smadzenēs, salīdzinot ar pelēm, kas ārstētas ar nesēju (att. S5C, D).

Atšķirībā no kopējā LAMP1 fluorescences līmeņa vidējā LAMP1 fluorescences intensitāte distrofiskajos neirītos starp transportlīdzekli, LNK-754 un ar lonafarnibu ārstētajām pelēm nemainījās (S5E, F att.). Ar LNK-754 ārstēto peļu garozā LAMP1 fluorescences intensitāte distrofiju un aplikuma daudzuma gadījumā bija ļoti korelēta, savukārt korelācija starp LAMP1 intensitāti distrofijā un aplikuma slogu netika konstatēta pelēm, kas ārstētas ar nesēju (2. G. attēls). H), atklājot saistību starp distrofiskā neirīta LAMP1 uzkrāšanos un aplikuma slodzi LNK-754 pelēm. Hipokampā tika novērota tendence uz korelāciju starp LAMP1 intensitāti distrofijās un aplikuma slodzi. Kopā mūsu rezultāti parāda, ka ārstēšana ar LNK-754 palielina kopējo LAMP1 līmeni, tomēr mazina LAMP1 patoloģisko uzkrāšanos distrofiskajos neirītos, kas parasti ir 5XFAD pelēm.

Samazināta BACE1 uzkrāšanās distrofiskajos neirītos LNK-754 hroniski ārstētām 5XFAD pelēm

LAMP1 ir atrodams uz endolizosomu organellu membrānām, kuru mērķis ir aksonālais BACE1, lai nobriest lizosomas, lai tās noārdās. Tāpēc FTI varētu kavēt A paaudzes un ekstracelulāro aplikuma nogulsnēšanos, samazinot aksonu distrofijas veidošanos un BACE1 uzkrāšanos ap plāksnēm. Lai pamatotu šo hipotēzi, distrofiskā neirīta LAMP1 līmenis un aplikuma slodze LNK-754 pelēm kortikālajos smadzeņu reģionos bija ļoti korelēta.

Mūsu veiktā LAMP1 imūnkrāsojuma analīze atklāja, ka, salīdzinot ar ārstēšanu ar nesēju vai lonafarnibu, plāksnes ar LNK-754 ārstētām 5XFAD pelēm bija saistītas ar mazāku distrofisku neirītu skaitu (2. attēls). Lai noteiktu, vai BACE1 līmenis distrofiskajos neirītos ir līdzīgi samazinājies uz vienu plāksni, papildus LAMP1 un A 42 veicām transportlīdzekļa, LNK-754 un lonafarnibu ārstēto peļu kortikālo un hipokampu smadzeņu audu konfokālo imunofluorescences mikroskopiju BACE1 noteikšanai. (3.A, B att.).

Šeit ar LNK-754 ārstēto peļu garozas smadzeņu apgabalos tika ievērojami samazināts BACE1 pārklājuma laukums, un ar lonafarnibu ārstētām pelēm tika novērota tendence (3. C attēls). BACE1 aptvertās zonas analīzi distrofiskajos neirītos hipokampā kavēja augstais BACE1 ekspresijas līmenis CA3 hipokampu sūnu šķiedru ceļa presinaptiskajos galos [17]. Mēs papildus analizējām, vai mazāk BACE1 lokalizējas endolizosomās distrofiskajos neirītos, mērot Pīrsona korelācijas koeficientu BACE1 un LAMP1 distrofiju gadījumā. Ievērojams BACE1 un LAMP1 koplokalizācijas samazinājums uz vienu plāksni tika konstatēts smadzeņu garozas reģionos ar LNK-754- ārstētām pelēm, salīdzinot ar ārstēšanu ar nesēju (3. att.).

Hipokampā tika konstatēts būtisks BACE1 un LAMP1 līdzlokalizācijas samazinājums uz plāksni LNK-754, salīdzinot ar lonafarnibu, un samazināšanās tendence tika novērota LNK-754 ārstēšanai, salīdzinot ar nesēju (att. 3E). Šie rezultāti atbilst mūsu konstatējumiem par aplikuma slogu un LAMP1 aptverto zonu un vēl vairāk apstiprina domu, ka ārstēšana ar LNK-754 mazināja distrofisku neirītu veidošanos, samazinot bojātu endolizosomu organellu veidošanos, kuru mērķis ir BACE1 noārdīšanās.

Akūta ārstēšana ar LNK-754 samazina vēlu endosomu un lizosomu uzkrāšanos distrofiskajos neirītos 5XFAD pelēm dzīvās smadzeņu šķēlēs

Pēc tam mēs pārbaudījām LNK{0}} un lonafarniba akūto ietekmi uz distrofiskiem neirītiem, veicot dzīvu smadzeņu audu konfokālo attēlveidošanu. Šajā eksperimentā 5-mēnešus vecām 5XFAD pelēm katru dienu 3 nedēļas injicēja nesēju, LNK-754 vai lonafarnibu. Mēs krāsojām audus ar LysoTracker-Green (LT), zondi, ko parasti izmanto, lai izsekotu un selektīvi identificētu paskābinātās vēlīnās endosomas un lizosomas dzīvās šūnās [53]. LT un tiazīna sarkanās krāsošanas modelis atbilda mūsu imūnās krāsošanas rezultātiem distrofiski neirīta marķieriem 5XFAD pelēm (att. 2A, B; att. 3A, B); LT-pozitīvās vēlīnās endosomas un lizosomas bija ļoti koncentrētas distrofiskajos neirītos, kas ir cieši saistīti ar amiloīda plāksnēm dzīvajos smadzeņu audos (4.A att.).

Akūta 3-nedēļas ārstēšana 5-mēnesi vecām 5XFAD pelēm ar LNK-754 vai lonafarnibu nebija pietiekama, lai samazinātu aplikuma izmēru (4.B att.), lai gan ārstēšana ar LNK-754 izraisīja ievērojams LT:TR attiecības samazinājums uz aplikumu un distrofiskā neirīta lielumu (4.C, D att.). Interesanti, ka atšķirībā no mūsu konstatējumiem attiecībā uz LAMP1 vai BACE1, akūtā lonafarniba terapija samazināja arī distrofijas lielumu un LT:TR attiecību uz plāksni (4. C, D att.). Distrofiskā neirīta izmērs un aplikuma lielums ļoti korelēja ar LNK-754 ārstētām 5XFAD pelēm (4. att. F), un nozīmīga korelācija tika novērota arī ar lonafarnibu ārstētām pelēm (4. G. attēls). Ar nesēju ārstētām pelēm korelācijas nepastāvēja (4.E att.). Mūsu rezultāti apstiprina, ka LNK-754 samazināja aksonu distrofiju un liecina, ka FTI var vājināt vēlu endosomu un lizosomu uzkrāšanos ap plāksnēm pat pēc plašas aplikuma nogulsnēšanās un aksonu deģenerācijas.

Mācīšanās un atmiņas deficīta uzlabošana hAPP/PS1 pelēm pēc īslaicīgas ārstēšanas ar LNK-754

LNK-754 novērsa LAMP1, BACE1 un LT uzkrāšanos distrofiskajos neirītos 5XFAD pelēm, kas liecina, ka ārstēšana ar LNK-754 aizsargā pret ar A saistītu sinaptisko disfunkciju. Lai novērtētu, vai LNK-754 terapijai bija labvēlīga ietekme uz kognitīvo funkciju, mēs novērtējām perorālās LNK{8}} terapijas īstermiņa efektivitāti telpiskās mācīšanās un atmiņas jomā hAPP/PS1 AD peles modelī [40] . HAPP/PS1 peļu telpiskā atmiņa uzlabojās pēc 12 dienu ilgas perorālas ārstēšanas ar LNK-754, kā to novērtēja Morisa ūdens labirints (MWM).

Slēptās platformas apmācības sesiju laikā ar LNK{0}} apstrādātās hAPP/PS1 peles iemācījās atrast platformu ātrāk nekā ar transportlīdzekli apstrādātās hAPP/PS1 peles, kā rezultātā tika iegūta mācīšanās līkne, kas ievērojami atšķiras no hAPP, kas apstrādāta ar transportlīdzekli. /PS1 kontroles peles (5.A att.). Ar transportlīdzekli apstrādātām hAPP/PS1 pelēm bija nepieciešams ievērojami vairāk laika, lai atrastu platformu, salīdzinot ar transportlīdzekļiem apstrādātām savvaļas tipa kontrolgrupām apmācību izmēģinājumu 4. un 7. dienā, turpretim būtiskas atšķirības starp ar LNK-754 ārstētām hAPP/ netika konstatētas. PS1 peles un ar nesēju apstrādātas savvaļas tipa peles (5.A-C att.).

Zondes testa laikā ar LNK-754-ārstētajiem hAPP/PS1 dzīvniekiem tika novērots palielināts laiks, kas pavadīts mērķa kvadrantā (5. D att.) un palielināts platformas šķērsošanas biežums (5. E att.), kas ir salīdzināms ar transportlīdzekli ārstētiem savvaļas dzīvniekiem. . A 42 līmeņi tika izmērīti ar ELISA metodi, un tie nemainījās šķīstošajos un nešķīstošajos smadzeņu homogenātos no hAPP/PS1 pelēm, kas apstrādātas ar nesēju vai LNK{8}} (5.F, G att.), kas liecina, ka uzlabota atmiņa un telpiskā mācīšanās nav samazināta amiloīda slodzes rezultāts ar LNK{11}} ārstētām hAPP/PS1 pelēm.

For more information:1950477648nn@gmail.com