FOXO regulē pretmikrobu peptīdu ekspresiju un veicina hemocītu fagocitozi garneļu antibakteriālajā imunitātē

Abstrakts

Lai pretotos patogēnām infekcijām, bezmugurkaulnieki paļaujas uz iedzimtu imunitāti, tostarp humorālo un šūnu imunitāti. Iepriekšējie pētījumi parādīja, ka forkhead box transkripcijas faktors O (FOXO) piedalās zīdītāju gļotādas imūnreakcijās un bezmugurkaulnieku zarnu humorālajā imūnregulācijā. Tomēr joprojām nav zināms, vai FOXO ir iesaistīts sistēmiskās un šūnu imunitātes regulēšanā bezmugurkaulniekiem. Šajā pētījumā mēs identificējām FOXO no garnelēm (Marsupenaeus japonicus) un atklājām, ka normālām garnelēm tas tika izteikts relatīvi bazālā līmenī, bet garnelēm, kuras apdraud Vibrio anguillarum, tas tika ievērojami paaugstināts. FOXO bija izšķiroša loma hemolimfas un zarnu mikrobiotas homeostāzes uzturēšanā, veicinot Relish ekspresiju, kas ir imūndeficīta (IMD) transkripcijas faktors pretmikrobu peptīdu (AMP) ekspresijai garnelēs. Mēs arī atklājām, ka patogēna infekcija aktivizēja FOXO un izraisīja tā kodola translokāciju, samazinot serīna / treonīna kināzes AKT aktivitāti. Kodolā aktivētais FOXO tieši regulēja tā mērķa Amp un Relish gēnu ekspresiju pret bakteriālu infekciju. Turklāt tika identificēts, ka FOXO ir iesaistīts šūnu imunitātē, veicinot hemocītu fagocitozi, paaugstinot fagocitotisko receptoru iznīcinātāja receptora C (Src) un divu mazu GTPāžu Rab5 un Rab7 ekspresiju, kas ir saistītas ar fagosomu pārvietošanos uz lizosomu. citoplazmā. Kopumā mūsu rezultāti liecināja, ka FOXO iedarbojas uz hemolimfas un zarnu mikrobiotas homeostāzi, aktivizējot IMD ceļu normālās garnelēs un tieši vai netieši veicinot AMP ekspresiju un uzlabojot hemocītu fagocitozi pret patogēniem baktērijām inficētās garnelēs. Šis pētījums atklāja dažādās FOXO funkcijas bezmugurkaulnieku gļotādas (lokālajā) un sistēmiskajā antibakteriālajā imunitātē.

Cistanche papildinājuma priekšrocības — kā stiprināt imūnsistēmu

Noklikšķiniet šeit, lai skatītu Cistanche Enhance Immunity produktus

【Jautājiet vairāk】 E-pasts:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Ievads

Forkhead box transkripcijas faktora O ģimenes proteīni (FOXO) ir iesaistīti dažādos kritiskos organismu bioloģiskos procesos, tostarp šūnu cikla regulēšanā, bojātas DNS labošanā, pretvēža imunitātē un dzīves ilguma regulēšanā [1, 2]. Zīdītājiem ir četri dažādi FOXO proteīni (FOXO1, FOXO3, FOXO4 un FOXO6); tomēr bezmugurkaulniekiem ir tikai viens FOXO, kas pazīstams arī kā Daf-16 Caenorhabditis elegans [3]. FOXO transkripcijas aktivitāti regulē vairāku veidu pēctranslācijas modifikācijas, piemēram, fosforilēšana, acetilēšana, metilēšana un ubikvitinācija [4]. Šīs modifikācijas ietekmē FOXO kodola translokāciju vai izeju no kodola un tā mijiedarbību ar līdzrepresoriem un koaktivatoriem, kas var veicināt vai samazināt FOXO aktivitāti un mediēt tās dažādās bioloģiskās funkcijas [5, 6]. Pēc aktivizēšanas FOXO piedalās daudzās fizioloģiskās funkcijās, regulējot dažādu mērķa gēnu transkripciju [7]. FOXO aktivizē dažādi ārpusšūnu stimuli, tostarp augšanas faktori, citokīni un hormoni [8]. Augšanas signāli, piemēram, insulīns vai insulīnam līdzīgais augšanas faktors 1 (IGF-1), mijiedarbojas ar insulīna ceļa receptoriem un aktivizē fosfatidilinozitola 3-kināzes (PI3K) signālu pārraidi, izraisot FOXO fosforilēšanos, ko veic serīna/treonīna kināze, proteīnkināze B (AKT) [9]. Fosforilēts FOXO pārvietojas no kodola uz citozolu vai novērš tā pārvietošanos no citozola uz kodolu, kur tas kļūst ubikvitinēts, izraisot tā degradāciju proteasomā [10]. Turpretim, ja nav ārēju augšanas signālu, PI3K-AKT signalizācijas ceļš ir neaktīvs, un nefosforilēts FOXO pārvēršas kodolā, lai veicinātu mērķa gēna transkripciju [11]. FOXO piedalās arī bezmugurkaulnieku iedzimtajās antibakteriālajās un pretvīrusu imūnreakcijās [12,13]. Hroniska FOXO aktivācija Drosophila novecojošajās zarnās nomāc peptidoglikāna atpazīšanas proteīna SC2 ekspresiju (negatīvs imūndeficīta (IMD) ceļa regulators) un pārtrauc zarnu imūnās homeostāzi [14]. FOXO tieši regulē pretmikrobu peptīdu (AMP) gēnus neinficētas Drosophila epitēlija audos, reaģējot uz bada stresu, kas nav atkarīgs no patogēniem reaģējošiem iedzimtas imunitātes ceļiem [15]. Tomēr patogēna infekcija var arī izraisīt enterocītu FOXO iekļūšanu kodolā no citoplazmas tieši Drosophila zarnās [12]. No FOXO atkarīgā AMP regulēšana notiek arī zīdītāju epitēlija audos, kas liecina, ka tas ir evolucionāri saglabājies dzīvniekiem [16]. Vairāki pētījumi parādīja, ka FOXO aktivizē patogēni vai citokīnu stimulācija gļotādas imūnreakcijās [17]. To pārvietošanos uz kodolu un saistīšanos ar mērķa gēnu promotoriem stimulē mitogēna aktivētā proteīna (MAP) kināzes ceļš un inhibē PI3K/AKT ceļš. FOXO mērķa gēni ietver pro-iekaisuma signālu molekulas, adhēzijas molekulas un ķemokīna receptorus [17]. Joprojām nav skaidrs, vai FOXO ir iesaistīti sistēmiskajā imūnreakcijā pret patogēniem. AMP ekspresijas veicināšana pret patogēniem ir svarīgs humorālās iedzimtas imunitātes mehānisms bezmugurkaulniekiem [18]. Drosophila iedzimtajā imunitātē Toll un IMD ceļi ir iesaistīti AMP ekspresijas regulēšanā, un AMP ir svarīga loma iebrukušo patogēnu iznīcināšanā [19–21]. Līdzīgi kā kukaiņu imunitāte, Toll, IMD un Janus kināzes (JAK)/signālu pārveidotājs un transkripcijas (STAT) ceļu aktivators ir iesaistīti AMP ekspresijas regulēšanā vēžveidīgajiem [22,23]. Ir jāprecizē, vai FOXO var regulēt AMP ekspresiju neatkarīgi no Toll, IMD un JAK / STAT ceļiem pret patogēnu infekciju vēžveidīgajiem. Papildus humorālajai imunitātei bezmugurkaulnieki paļaujas arī uz šūnu imunitāti, lai veiktu iedzimtas imunitātes funkcijas pret patogēnu infekciju. Hemocītu izraisītā fagocitoze ir viens no svarīgākajiem mehānismiem šūnu imunitātei pret patogēnu infekciju [24]. Iepriekšējie pētījumi atklāja, ka FOXO{50}}mediētā autofagija ir nepieciešama dabisko killer (NK) šūnu attīstībai [25]. Turklāt FOXO ir iesaistīts neitrofilu baktēriju fagocitozes veicināšanā [26]. Lai gan vēžveidīgajiem nav specializētu imūno šūnu, piemēram, NK šūnu vai neitrofilu, garneļu hemocīti var radīt sistēmisku iedzimtu imunitāti pret patogēno baktēriju infekciju ar fagocitozes palīdzību [27]. Tomēr nav skaidrs, vai FOXO piedalās garneļu hemocītu patogēnu fagocitozē. Garneļu akvakultūra ir viena no pasaulē visstraujāk augošajām dzīvnieku olbaltumvielu ražošanas nozarēm, un tā ir devusi nozīmīgu ieguldījumu pasaulē pieaugošā pieprasījuma apmierināšanā pēc dzīvnieku olbaltumvielām. Pašlaik pasaulē tiek saražots aptuveni 4,88 miljoni tonnu garneļu, kuru vērtība ir aptuveni 39 miljardi USD [28]. Tomēr liela dzīvnieku skaita kopīgā audzēšana rada ievērojamu dzīvnieku stresu, kas veicina patogēnu, tostarp baktēriju un vīrusu, vairošanos un klīniskas slimības, kas rada lielus ekonomiskus zaudējumus nozarei [29]. Garneļu imūno mehānismu pētījumi varētu sniegt jaunas stratēģijas slimību profilaksei un kontrolei [30]. Šajā pētījumā mēs identificējām FOXO kurumas garnelēs (Marsupenaeus japonicus). Pēc Foxo ekspresijas notriekšanas un Vibrio anguillarum izaicinājuma mēs atklājām, ka baktēriju izvadīšanas spēja un garneļu izdzīvošanas līmenis ievērojami samazinājās. Turpmākais pētījums norādīja, ka FOXO tieši vai netieši veicināja AMP ekspresiju un uzlaboja baktēriju fagocitozi garnelēs. Tika analizēti iespējamie mehānismi FOXO iedarbībai pret patogēnu infekciju garnelēs.

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

Rezultāti

FOXO tiek ekspresēts bazālajā līmenī neinficētās garnelēs un tiek paaugstināts regulēts garnelēs, kas inficētas ar V. anguillarum

No M. japonicus hemocītu transkripta sekvencēšanas mēs ieguvām Foxo pilna garuma cDNS secību (GenBank pievienošanās numurs: MW080526). Domēnu salīdzinājums parādīja, ka prognozētajam FOXO proteīnam ir Forkhead (FH) domēns, kas ir līdzīgs Homosapiens FOXOs, ieskaitot FOXO1, FOXO3, FOXO4 un FOXO6, un tam ir līdzīga AKT fosforilācija (S1A attēls). Filoģenētiskās analīzes rezultāti parādīja, ka FOXO tika sadalīti divās kopās, ieskaitot mugurkaulnieku un bezmugurkaulnieku FOXO, un garneles FOXO tika sagrupētas filoģenētiskā koka bezmugurkaulnieku zarā (S1B attēls). Līdzīgi kā cilvēka FOXO [31], garneļu FOXO ir ārpusšūnu regulētas kināzes (ERK) fosforilācijas modifikācijas vietas un CREB saistošā proteīna (CBP) acetilēšanas modifikācijas vietas, bet tai nav sir tuin 1 (SIRT1) deacetilācijas modifikācijas vietu un c-JUN N-termināla. kināzes (JNK) fosforilācijas modifikācijas vietas (S2 att.). Poliklonālās antivielas, kas atpazīst garneles FOXO, tika sagatavotas, izmantojot FOXO rekombinanto FH domēnu, kas ekspresēts Escherichia coli (1.A attēls). FOXO audu sadalījuma analīze mRNS un olbaltumvielu līmenī atklāja, ka tas tika ekspresēts visos pārbaudītajos audos (1B attēls). FOXO ekspresijas laika gaita ar V. anguillarum inficēto garneļu hemocītos un zarnās tika analizēta, izmantojot qPCR un Western blotēšanu. Rezultāti parādīja, ka FOXO tika pārregulēts hemocītos un zarnās mRNS līmenī (1. C un 1. D attēls) un olbaltumvielu līmenī (1. E un 1. F attēls). Šie rezultāti liecināja, ka FOXO ir iesaistīts reakcijā uz V. anguillarum infekciju un mudināja mūs izpētīt FOXO funkciju garneļu imunitātē.

FOXO piedalās hemolimfas un zarnu mikrofloras homeostāzes regulēšanā veselām garnelēm

Lai izpētītu FOXO funkciju hemolimfā un zarnu mikrofloras homeostāzē garnelēm, tika veikta RNS iejaukšanās un analizēta baktēriju slodze. Rezultāti parādīja, ka Foxo ekspresija ievērojami samazinājās Foxo-RNAi garnelēm (2.A un 2.B attēls). Tika analizēti arī Foxo RNAi ārpusmērķa efekti, nosakot citu Fox ģimenes gēnu (ieskaitot Foxk2 un Foxn3) ekspresiju. Rezultāti parādīja, ka Foxo notriekšana nesamazināja Foxk2 vai Foxn3 ekspresijas līmeni (S3A – S3C attēls). Izmantojot Western blotēšanu un fluorescējošus imūncitoķīmijas testus, mēs tālāk novērojām FOXO subcelulāro izplatību garneļu zarnās un hemocītos, kuras pēc Foxo apklusināšanas izraisīja baktērijas. Rezultāti parādīja, ka salīdzinājumā ar dsGfp grupu FOXO līmenis kodolā ievērojami samazinājās Foxo-RNAi garnelēm, pat ja garneles bija inficētas ar V. anguillarum (S3D–S4E' zīm.). Visi iepriekš minētie rezultāti liecināja, ka mūsu Foxo RNAi tests var īpaši apklusināt Foxo hemocītos un zarnās (tostarp citoplazmā un kodolā). Pēc tam mēs analizējām baktēriju slodzi hemolimfā un zarnās pēc Foxo notriekšanas garnelēs normālos apstākļos (bez baktēriju iedarbības). Rezultāti parādīja, ka baktēriju skaits hemolimfā un zarnās ievērojami palielinājās pēc tam, kad Foxo ekspresija tika veiksmīgi notriekta (attēls 2C un 2D). Tālāk mēs analizējām Foxo-RNAi garneļu izdzīvošanas līmeni bez baktēriju iedarbības, un rezultāti parādīja, ka Foxo-knockdown garneļu izdzīvošanas līmenis ievērojami samazinājās, salīdzinot ar kontroles līmeni (2. E attēls). Lai vēl vairāk pārbaudītu šos rezultātus, mēs analizējām ar antibiotikām apstrādātu Foxo-RNAi garneļu izdzīvošanas līmeni, un rezultāti parādīja, ka, salīdzinot ar dsGfp grupu, dīgļu nesaturošo garneļu izdzīvošanas rādītājs nav būtiski samazinājies (attēls 2F). Visi rezultāti liecināja, ka FOXO ir loma garneļu in vivo mikrobiotas (tostarp hemolimfas un enterālās mikrobiotas) homeostāzē normālos apstākļos.

cistanche papildinājuma priekšrocības - paaugstina imunitāti

FOXO piedalās hemolimfas un zarnu mikrofloras homeostāzes regulēšanā, veicinot Relish un Amp ekspresiju veselās garnelēs

Iepriekšējie pētījumi liecina, ka veselīgas garneles satur zemu, bet stabilu baktēriju skaitu cirkulējošajā hemolimfā un lielu, lai arī nemainīgu baktēriju daudzumu kuņģa-zarnu traktā, kā arī imūnefektorus, piemēram, antimikrobiālos peptīdus (AMP), ko regulē kodolfaktors kappa B (NF). -κB) ceļam un reaktīvajām skābekļa sugām (ROS), ko regulē duālās oksidāzes (DUOX) ceļš, ir būtiska loma homeostāzes hemolimfā un zarnu mikrobiotā [32–34]. Lai izpētītu FOXO iesaistīšanās mehānismu hemolimfas un zarnu mikrofloras homeostāzes regulēšanā normālos apstākļos, mēs vispirms noteicām FOXO subcelulāro sadalījumu hemocītos un zarnās normālos apstākļos. Rezultāti parādīja vāju FOXO signālu garneļu hemocītu kodolos un zarnu šūnās normālos apstākļos (3.A un 3.B attēls), kas liecina, ka normālos apstākļos garneļu in vivo mikrobiota aktivizēja nedaudz FOXO. AMP ekspresiju regulē IMD ceļš Drosophila zarnās [35]. Tāpēc mēs pieņēmām, ka transkripcijas faktors Relish varētu būt FOXO mērķa gēns. Mēs atklājām Relish mRNS ekspresiju, kas ir IMD ceļa transkripcijas faktors, garneļu hemocītos un zarnās pēc Foxo notriekšanas. Rezultāti parādīja, ka Foxo-knockdown garnelēm Relish ekspresija ievērojami samazinājās (3C un 3D attēls), un līdzīgi rezultāti tika iegūti olbaltumvielu līmenī (3E un 3E att.). Rezultāti liecināja, ka FOXO varētu veicināt Relish izpausmi un aktivizēt IMD ceļu. Lai apstiprinātu, ka FOXO piedalās hemo limfas un kuņģa-zarnu trakta homeostāzē, izmantojot IMD signālus, tika iegūtas dīgļu nesaturošas garneles (3F attēls) un tika noteikta RELISH aktivācija un AMP ekspresija. Salīdzinot ar kontroli, FOXO un RELISH daudzums zarnu šūnu un hemocītu kodolos ievērojami samazinājās (3G un 3H attēls). Tikmēr AMP, tostarp Crustins (CrusI-2 līdz 5) un antilipopolisaharīdu faktoru (Alf A1, B1, C1, D1 un E1), ko, iespējams, regulē FOXO un/vai RELISH, ekspresija tika pārbaudīta dīglī. Garneles, kas nesatur garneles, un rezultāti parādīja, ka CrusI-3, Alf-B1 un Alf-C1 ekspresija ievērojami samazinājās garneļu hemocītos un zarnās (3I un 3J attēls). Ņemot vērā, ka Alf-B1 un Alf C1 ekspresiju regulēja IMD ceļš [36], šie rezultāti liecināja, ka FOXO piedalās hemolimfas un kuņģa-zarnu trakta homeostāzes regulēšanā normālos apstākļos caur IMD ceļu, lai veicinātu AMP.

1. attēls. FOXO tika paaugstināts regulēts garnelēm, kuras apstrīdēja V. anguillarum. (A) FOXO FH domēna rekombinantā ekspresija E. coli un Western blotēšana, lai noteiktu FOXO, izmantojot poliklonālas antivielas pret FOXO, kas sagatavotas trušiem. 1. josla, E. coli kopējie proteīni ar Foxo-pGEX4T-1. 2. josla, baktēriju kopējie proteīni pēc IPTG indukcijas. 3. josla, attīrīts rekombinants FOXO. 4. josla, FOXO neapstrādātu garneļu zarnās tika konstatēta, izmantojot Western blotēšanu. M, olbaltumvielu molekulmasas marķieri. (B) Foxo audu sadalījums mRNS (augšējais panelis) un proteīna (apakšējais panelis) līmenī tika noteikts attiecīgi ar RT-PCR un Western blotēšanu. ACTB ir -actin saīsinājums. (C, D) Foxo mRNS ekspresijas modeļi hemocītos (C) un zarnās (D) tika analizēti ar qPCR, izmantojot -aktīna un Ef-1 ģeometrisko vidējo ekspresiju kā endogēnos kontroles gēnus. (E, F) FOXO olbaltumvielu ekspresijas modeļi hemocītos (E) un zarnās (F) tika noteikti ar Western blotēšanu. Trīs atkārtojumu statistiskās analīzes rezultāti tika parādīti apakšējos paneļos. Western blot joslas tika digitalizētas, izmantojot ImageJ programmatūru, skenējot joslas no trim neatkarīgiem atkārtojumiem. FOXO/-aktīna relatīvie ekspresijas līmeņi tika izteikti kā vidējais ± SD, un kontroles garneļu vērtība tika iestatīta kā viena. Kļūdu joslas attēlā norāda SD (trīs atkārtojumi).

FOXO tiek aktivizēts garnelēs ar V. anguillarum izaicinājumu un piedalās hemolimfas un zarnu patogēnu klīrensā.

Tiek ziņots, ka FOXO var aktivizēt ar baktēriju vai citokīnu stimulāciju, un tas tiek pārvietots uz kodolu, lai regulētu noteiktu mērķa gēnu ekspresiju zīdītājiem [17]. Lai noteiktu, vai FOXO tika aktivizēts garnelēs, kuras inficējušas baktērijas, FOXO subcelulārais sadalījums garneļu zarnās tika analizēts, izmantojot Western blotēšanu. Rezultāti parādīja, ka FOXO daudzums zarnu šūnu citoplazmā pakāpeniski samazinājās no 2 līdz 4 stundām pēc V. anguillarum inficēšanās (4.A attēls). Turpretim FOXO daudzums zarnu šūnu kodolā ievērojami palielinājās pēc inficēšanās ar V. anguillarum (4.B attēls). Lai analizētu FOXO lomu sistēmiskajā imunitātē, tika izmantots fluorescējošs imūncitoķīmisks tests, lai novērotu FOXO kodoltranslokāciju garneļu hemocītos 2 stundas pēc V. ikgadējās larum stimulācijas. Mēs noskaidrojām, ka baktēriju izraisīta FOXO translokācija kodolā ievērojami palielinājās, bet ar PBS ietekmētajām garnelēm nebija acīmredzamu izmaiņu (4C un 4C attēls). Lai izpētītu, vai kodolā pārvietotais FOXO ir iesaistīts patogēna klīrensā, mēs analizējām baktēriju slodzi hemolimfā un zarnās Foxo-knockdown garnelēm 6 stundas pēc baktēriju iedarbības. Mēs noskaidrojām, ka pēc Foxo notriekšanas baktēriju slodze hemolimfā un zarnās ievērojami palielinājās, salīdzinot ar kontroles grupām (4D attēls). Turklāt ar V. anguillarum inficēto Foxo-knockdown garneļu izdzīvošanas rādītājs ievērojami samazinājās salīdzinājumā ar kontroles līmeni (4. E attēls). Šie rezultāti liecināja, ka FOXO tika aktivizēts zarnu šūnās un hemocītos, un liecināja, ka FOXO piedalās vietējās un sistēmiskās imūnās atbildes reakcijās pret bakteriālu infekciju.

2. attēls. FOXO piedalās zarnu (lokālajā) un sistēmiskajā antibakteriālajā imūnreakcijā. (A, B) Foxo-RNAi efektivitāte garneļu hemocītos (A) un zarnās (B), kas noteikta, izmantojot qPCR (A) un Western blotēšanu (B). qPCR datuma analīze, izmantojot -aktīna un Ef-1 ģeometrisko vidējo ekspresiju kā endogēnos kontroles gēnus. Kļūdu joslas parāda SD. (C) Foxo-knockdown garneļu hemolimfas baktēriju noteikšana ar cieto LB kultūru (trīs atkārtojumi); Kā kontrole tika izmantota dsGfp injekcija. Atšķaidīšanas attiecība bija 1:10. (D). Baktēriju skaits hemolimfā un zarnās Foxo knockdown garnelēm un dsGfp-injekcijas garnelēm bez baktēriju iedarbības. (E). Foxo-RNAi garneļu izdzīvošanas līmenis bez baktēriju izaicinājuma. Kā kontrole tika izmantota dsGfp injekcija. (F). Ar antibiotikām apstrādātu Foxo-RNAi garneļu izdzīvošanas līmenis. dsGfp injekcija tika izmantota kā kontrole. Normāls: savvaļas garneles nav apstrādātas ar antibiotikām.

3. attēls. Bāzes daudzums FOXO pārvietojas hemocītu un zarnu šūnu kodolos, veicina Relish ekspresiju un pēc tam aktivizē IMD ceļu, lai normālos apstākļos regulētu hemolimfu un zarnu mikrobiotas homeostāzi. (A) Lai noteiktu FOXO subcelulāro sadalījumu normālu garneļu hemocītos, tika izmantota imūncitoķīmija. Mēroga josla=20 μm. Cy: citoplazma; Nu: Kodols. (B) Western blotēšana tika izmantota, lai noteiktu FOXO subcelulāro sadalījumu zarnu šūnās no normālām garnelēm un ar V. anguillarum inficētām garnelēm. (C) Relish ekspresija mRNS līmenī tika konstatēta garneļu hemocītos pēc Foxo iznīcināšanas ar qPCR, izmantojot -aktīna un Ef-1 ģeometrisko vidējo ekspresiju kā endogēnos kontroles gēnus. (D) Relish ekspresija mRNS līmenī garneļu zarnās pēc Foxo notriekšanas tika noteikta ar qPCR, izmantojot -aktīna un Ef-1 ģeometrisko vidējo ekspresiju kā endogēnos kontroles gēnus. (E) RELISH līmenis tika noteikts, izmantojot Western blotēšanu garnelēm pēc Foxo notriekšanas. (E') Trīs paneļa E atkārtojumi tika digitalizēti, izmantojot ImageJ programmatūru. (F) Hemolimfas un zarnu baktēriju slodze garnelēs 24 stundas pēc ārstēšanas ar antibiotikām. (G) FOXO kodolā tika atklāts, izmantojot Western blotēšanu garneļu hemocītos un zarnās 24 stundas pēc ārstēšanas ar antibiotikām. (H) RELISH kodolā tika atklāts, izmantojot Western blotēšanu garneļu hemocītos un zarnās 24 stundas pēc ārstēšanas ar antibiotikām. (I, J) Amps ekspresija bezdīgļu garneļu hemocītos (I) un zarnās (J) tika noteikta ar qPCR, izmantojot -aktīnu un Ef-1 kā iekšējos atsauces gēnus. Par kontroli tika izmantotas parastās garneles (H2O injekcija).

Iepriekšējie pētījumi liecināja, ka FOXO transkripcijas aktivitāti regulē fosforilācijas modifikācija un ka serīna / treonīna kināzes AKT regulē Forkhead transkripcijas faktoru aktivitāti, tos fosforilējot un kavējot to neskaidro translokāciju [9, 37]. Lai izpētītu, vai AKT ietekmē FOXO palielināšanos kodolā pēc patogēno baktēriju infekcijas, mēs vispirms atklājām FOXO saturu citoplazmā un kodolā ar Western blotēšanu pēc garneļu Akt notriekšanas. Rezultāti parādīja, ka FOXO daudzums hemocītu kodolā un zarnu šūnās ievērojami palielinājās pēc Akt ekspresijas pārtraukšanas (5A un 5B att.) garnelēm 2 stundas pēc inficēšanās ar V. anguillarum (5C un 5C' attēls). Lai pārbaudītu eksperimentālos rezultātus, mēs izmantojām arī imūncitoķīmijas testu, lai novērotu FOXO subcelulāro sadalījumu garneļu hemocītos pēc Akt notriekšanas. Rezultāti parādīja, ka FOXO bija ievērojami palielināts hemocītu kodolā, kad Akt ir samazinājies 2 stundas pēc inficēšanās ar V. anguillarum (5D un 5D' attēls). Lai noskaidrotu, vai patogēna infekcija ietekmē AKT aktivitāti, mēs atklājām AKT fosforilācijas izmaiņas pēc patogēna infekcijas, izmantojot cilvēka p-AKT (Ser473) antivielu (garneļu AKT fosforilācijas vieta ir Ser486), un konstatējām, ka fosforilētā AKT līmenis ievērojami samazinājās garneļu hemocīti un zarnas pēc 30 minūtēm pēc V. anguillarum infekcijas (5E un 5F attēls). Šie rezultāti liecināja, ka patogēna infekcija var samazināt fosforilētā AKT līmeni, kas kavē enzīmu aktivitāti un samazina AKT spēju fosforilēt FOXO. Nefosforilētais FOXO iekļūst kodolā un inducē tā mērķa gēnu ekspresiju. attēlā norādīti SD.

cistanche ekstrakts

Patogēna infekcija samazina AKT aktivitāti un izraisa FOXO kodola translokāciju

FOXO ievieš imūno aizsardzību pret invazīvām baktērijām, regulējot pretmikrobu peptīdu ekspresiju ar baktērijām inficētās garnelēs

Lai izpētītu mehānismu, ar kuru FOXO ietekmē reakciju pret garneļu bakteriālu infekciju, mēs vispirms identificējām imūnsistēmas efektora gēnus, ko regulē FOXO. Pēc veiksmīgas Foxo iznīcināšanas garneļu hemocītos un zarnās ar vai bez V. anguillarum provokācijas, CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 un Alf-E1 ekspresijas līmeņi ievērojami samazinājās apklusinātajās garnelēs, salīdzinot ar tām. ar tiem, kas ir kontroles grupā (6.A un 6.B attēls). Lai vēl vairāk pārbaudītu rezultātus, mēs arī atklājām četru AMP izteiksmi pēc Akt notriekšanas. Rezultāti parādīja, ka četru AMP ekspresija ievērojami palielinājās 6 stundas pēc V. anguil larum infekcijas, salīdzinot ar kontroles grupu (6.C un 6.D attēls). Salīdzinājumā ar paaugstināti regulētajiem AMP (tostarp Alf-B1 un Alf-C1) normālos apstākļos (3I un 3J attēls), ar V inficētajās garnelēs tika pārregulēts arī papildu AMP gēns (CrusI-3, Alf-E1). anguillarum (6.A un 6.B attēls). Mūsu iepriekšējais pētījums norādīja, ka RELISH veicināja Alf-B1 un Alf-C1 ekspresiju garnelēs [36]. Šie rezultāti liecina, ka FOXO var tieši regulēt AMP izteiksmi, piemēram, CrusI-3 un Alf-E1, neatkarīgi no IMD signalizācijas ceļa. Lai apstiprinātu hipotēzi, tika veikts ChIP tests, lai noteiktu, vai FOXO var saistīties ar Alf-E1 promotoru. Tika iegūta Alf-E1 promotora secība (S4 attēls) un tika prognozētas FOXO saistīšanās vietas (6E attēls). ChIP rezultāts parādīja, ka FOXO var saistīties ar Alf-E1 promotoru (6.F attēls). Šie rezultāti liecināja, ka FOXO piedalās arī antibakteriālajā imunitātē, tieši regulējot AMP ekspresiju garnelēs.

4. attēls. FOXO, kas pārvietots garneļu kodolā, ko inficē V. anguillarum. (A, B) FOXO izplatības modeļi garneļu zarnu šūnu citoplazmā (A) un kodolā (B), ko apdraud baktērijas, analizējot, izmantojot Western blot metodi (A un B apakšējie paneļi). Western blot joslas tika digitalizētas, izmantojot ImageJ programmatūru, skenējot joslas no trim atkārtojumiem. FOXO/-aktīna vai FOXO/Histone 3 relatīvie ekspresijas līmeņi tika izteikti kā vidējais ± SD, un kontroles garneļu vērtība tika iestatīta kā viena. (C) FOXO kodola translokācija garneļu hemocītos 2 stundas pēc V. anguillarum izaicinājums tika atklāts, izmantojot fluorescējošus imūncitoķīmiskos testus. PBS injekcija tika izmantota kā kontrole. Mēroga josla=20 μm. (C') C paneļa statistiskā analīze FOXO un DAPI iekrāsoto kodolu kolokalizācija hemocītos tika analizēta ar WCIF ImageJ programmatūru. (D) Foxo-knockdown garneļu hemolimfā un zarnās baktēriju skaits pēc V. anguillarum injekcijas; Kontrolei tika izmantota dsGfp injekcija garnelēs pēc baktēriju injekcijas. (E) ar V. anguillarum inficēto Foxo-RNAi garneļu izdzīvošanas rādītājs. Kā kontrole tika izmantota dsGfp injekcija.

FOXO veicina hemocītu fagocitozi pret baktērijām, veicinot SRC ekspresiju

Iepriekšējie pētījumi ir ziņojuši, ka FOXO tieši mijiedarbojas ar CXCR2 un CD11b promotora reģioniem, lai regulētu neitrofilu fagocitozi zīdītājiem [26]. Lai pārbaudītu, vai FOXO ir saistīts ar hemocītu fagocitozi garneļu antibakteriālajā imunitātē, mēs pārbaudījām fagocītu ātrumu pēc iejaukšanās ar Foxo, izmantojot dažādas metodes. Pēc Foxo notriekšanas Foxo-knockdown grupas fagocītu ātrums un fagocītu indekss bija ievērojami zemāki nekā kontroles grupai (dsGfp) (7.A un 7.A attēls). Mēs izmantojām arī plūsmas citometriju, lai kvantitatīvi noteiktu hemocītu fagocītu ātrumu pēc Foxo klusēšanas. Rezultāti parādīja, ka arī Foxo-RNAi grupas fāgu citozes ātrums ievērojami samazinājās, salīdzinot ar dsGfp grupu (7.B un 7.B att.). Lai vēl vairāk apstiprinātu šos rezultātus, mēs pārbaudījām arī fagocītu ātrumu pēc Akt notriekšanas. Rezultāti parādīja, ka, salīdzinot ar kontroles grupu, fagocītu ātrums un fagocītu indekss ievērojami palielinājās (7.C un 7.C attēls). Šie rezultāti liecināja, ka FOXO veicina garneļu hemocītu fagocitozi. Lai izpētītu, kā FOXO uzlabo garneļu hemocītu fagocitozi, mēs atklājām iepriekš ziņoto gēnu ekspresiju, kas iesaistīti garneļu fagocitozē. Tiek ziņots, ka hemocītu fagocitozē ir iesaistīti B klases (SRB) un C klases (SRC) uztvērēju receptori [38, 39]. Mēs noskaidrojām, ka Src, nevis Srb mRNS ekspresijas līmenis ievērojami samazinājās pēc Foxo apklusināšanas hemocītos un zarnās (7D un 7E attēls), savukārt Src ekspresija ievērojami palielinājās pēc Akt iznīcināšanas garnelēs (7.F attēls). Līdzīgi rezultāti tika iegūti olbaltumvielu līmenī (7.G un 7.G attēls). Šie rezultāti liecināja, ka FOXO veicina garneļu patogēnu hemocītu fagocitozi, veicinot SRC ekspresiju.

FOXO veicina RAB5 un RAB7 ekspresiju garneļu fagocitozes laikā

Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka mazās GTPāzes RAB5 un RAB7 ir galvenie regulatori tikko endocitētu pūslīšu transportēšanai uz agrīnām un vēlīnām endosomām [40]. RAB5 ir galvenais sākotnējo saplūšanas notikumu regulators un agrīno endosomu marķieris [41,42]. RAB7 ir nepieciešams vēlīnai fagosomu-lizosomu saplūšanai, un tas ir vēlu endosomu marķieris [43]. Lai noskaidrotu, vai RAB5 un RAB7 ir iesaistīti patogēnu izvadīšanā garnelēs, mēs vispirms analizējām Rab5 un Rab7 ekspresijas modeļus un atklājām, ka abas mazās GTPāzes tika pārregulētas garnelēs, kuras bija inficētas ar baktērijām (S5A – S5D attēls). Mēs tālāk analizējām Rab5-RNAi un Rab7-RNAi garneļu izdzīvošanas līmeni pēc baktēriju iedarbības, un rezultāti parādīja, ka Rab5 un Rab7 nokautu garneļu izdzīvošanas rādītājs ievērojami samazinājās, salīdzinot ar kontroles līmeni ( S5E un S5F att.). Šie rezultāti liecināja, ka RAB5 un RAB7 ir svarīgas funkcijas rezistencē pret baktēriju patogēniem. Lai izpētītu, vai RAB5 un RAB7 ir iesaistīti FOXO mediētā fagocitozē, mēs pārbaudījām Rab5 un Rab7 mRNS ekspresijas līmeņus pēc traucējumiem Foxo ekspresijā garnelēs. Rezultāti parādīja, ka Rab5 un Rab7 ekspresijas līmeņi ievērojami samazinājās hemocītos un zarnās (8.A un S6A attēls). tā kā Rab5 un Rab7 ekspresija ievērojami palielinājās pēc Akt notriekšanas garnelēs (8.B attēls). Lai vēl vairāk apstiprinātu iepriekš minētos rezultātus, tika konstatēts arī RAB5 un RAB7 proteīna līmenis Foxo vai Akt knockdown garnelēs. Salīdzinot ar dsGfp injekciju grupu, RAB5 un RAB7 līmenis arī ievērojami samazinājās hemocītos un zarnās Foxo-knockdown garnelēm, bet ievērojami palielinājās Akt-knockdown garnelēm 2 stundas pēc V. anguillarum stimulācijas (8.C–8D. att.; S6B). un S6B'). Šie rezultāti liecināja, ka RAB5 un RAB7 piedalās garneļu hemocītu FOXO mediētā fāgu citozē. Mēs arī atklājām, ka garneļu hemocītos RAB5 un RAB7 tika lokalizēti kopā ar V. anguillarum (9. attēls). Kopumā rezultāti liecināja, ka RAB5 un RAB7 ir iesaistīti garneļu FOXO mediētā fagocitozē.

5. attēls. Patogēna infekcija samazināja AKT aktivitāti, kas veicināja FOXO kodola translokāciju garneļu hemocītos un zarnu šūnās. (A, B) Akt-RNSi efektivitāte garneļu hemocītos un zarnās, kas noteikta ar qPCR, izmantojot -aktīna un Ef-1 ģeometrisko vidējo ekspresiju kā endogēnos kontroles gēnus (A) un Western blotēšanu (B). (C) FOXO daudzums citoplazmā un zarnu kodolā no Akt-knockdown garnelēm tika analizēts ar Western blotēšanu. dsGfp tika izmantots kā kontrole. (C') paneļa (C) statistiskā analīze. Programmatūra ImageJ tika izmantota, lai digitalizētu joslas, skenējot trīs atkārtojumus. (D) FOXO kodola translokācija Akt-knockdown garneļu hemocītos tika noteikta 2 stundas pēc V. anguillarum iedarbības, izmantojot fluorescējošu imūncitoķīmisko testu. dsGfp tika izmantots kā kontrole. Mēroga josla=20 μm. (D') (D) statistiskā analīze. WCIF ImageJ programmatūra tika izmantota, lai analizētu līdzlokalizāciju pēc anti-FOXO (zaļa) un DAPI iekrāsotā kodola (zilā) fluorescences intensitātes attiecības hemocītos pēc ekspozīcijas vērtības fiksēšanas. (E, F) Fosforilētā AKT (p-AKT) satura izmaiņas garneļu hemocītos (E) un zarnās (F), kuras ir inficētas ar V. anguillarum. Apakšējie paneļi ir digitalizēti (E) un (F) skaitļi, kuru pamatā ir attiecīgi Western blotēšanas un statistiskās analīzes joslas.

Cistanche tēja

Diskusija

FOXO kā ļoti svarīgs transkripcijas faktors piedalās daudzās fizioloģiskās un vielmaiņas funkcijās [44,45]. Šajā pētījumā mēs identificējām FOXO no garnelēm (M. japonicus) un atklājām, ka tas piedalās hemolimfas un enterālās mikrobiotas homeostāzes regulēšanā, regulējot AMP ekspresiju normālos apstākļos. FOXO var aktivizēt ar bakteriālu infekciju garnelēs un pārvietot uz kodolu, kur tas tieši un netieši (ar IMD ceļu) regulē AMP ekspresiju. FOXO regulēja ar fagocitozi saistīto gēnu, piemēram, SRC un mazo GTPāzes, RAB5 un RAB7, ekspresiju, lai veicinātu hemocītu fagocitozi pret patogēniem. Tāpēc garneļu FOXO ir dažādas lomas sistēmiskā un lokālā (zarnu trakta) imūnreakcijā pret patogēniem (10. attēls). Salīdzinot ar cilvēka FOXO, garneļu FOXO ir relatīvi konservēta aminoskābju secība un AKT fosforilācijas vietas; tomēr otrā garneļu FOXO AKT fosforilācijas vieta ir treonīns serīna vietā. FOXO AKT fosforilēšana kontrolē FOXO kodola un citoplazmas transportu [9]. Šajā pētījumā mēs noskaidrojām, ka AKT ir saistīts ar FOXO kodolieroču iekļūšanas kontroli. Pēc V. anguillarum infekcijas fosforilētā AKT līmenis tika ievērojami samazināts, kas liecināja, ka AKT aktivitāte ir samazināta ar patogēnu inficētām garnelēm, tādējādi palielinot FOXO kodola aizturi vai kodola translokāciju un pēc tam inducējot mērķa gēnu ekspresiju, piemēram, Relish un Amp, lai izturētu pret patogēnu infekciju. Iepriekšējie pētījumi ir atklājuši, ka FOXO piedalās Drosophila zarnu mikrofloras homeostāzē, nomācot peptidoglikāna atpazīšanas proteīna SC2 (IMD ceļa negatīvā regulatora) ekspresiju, lai aktivizētu AMP ekspresijas ceļu [14]. Tika ziņots, ka RELISH ir galvenais FOXO mērķa gēns hipoksijas tolerances kontrolē Drosophila [46]. Tāpat kā citiem dzīvniekiem, arī garneļu kuņģa-zarnu traktā ir salīdzinoši augsta un nemainīga mikrobiota. Arvien vairāk pierādījumu arī atklāj, ka dažu veselīgu ūdens bezmugurkaulnieku, tostarp garneļu, hemolimfā ir arī stabils baktēriju daudzums [47]. Mūsu iepriekšējais pētījums atklāja, ka C tipa lektīns piedalās hemolimfas mikrobiotas homeostāzes regulēšanā, uzturot AMP ekspresiju [34], taču mēs nezinām, kādi signālu ceļi ir iesaistīti AMP ekspresijas regulēšanā. Šeit mūsu rezultāti liecināja, ka FOXO ir iesaistīts hemolimfas un enterālās mikrofloras homeostāzes regulēšanā, izmantojot IMD signālus normālos apstākļos. Neinficētām garnelēm Foxo iznīcināšanas rezultātā ievērojami samazinājās Relish ekspresija, un garneļu izdzīvošanas rādītājs ievērojami samazinājās pat bez bakteriālas infekcijas. Mēs arī atradām nelielu daudzumu FOXO normālu garneļu šūnu kodolā. Tāpēc mēs domājam, ka FOXO piedalās hemolimfas un enterālās floras homeostāzes regulēšanā normālos apstākļos, veicinot Relish ekspresiju un pēc tam uzlabojot AMP ekspresiju ar IMD ceļu. Šie rezultāti liecināja, ka FOXO piedalās vietējā un sistēmiskā imunitātē, lai veicinātu garneļu hemolimfas un kuņģa-zarnu trakta mikrobiotas homeostāzi. Humorālajai imunitātei ir izšķiroša loma rezistencē pret patogēnu infekciju apgrieztā ātrumā, ražojot AMP akumulatoru [21,48]. Humorālā reakcija ietver inducējamu AMP sintēzi un sekrēciju, kas izdalās hemolimfā kā sistēmiska reakcija vai izdalās uz epidermas virsmu vai kuņģa-zarnu trakta dobumu kā lokāla reakcija [19]. AMP ekspresiju galvenokārt regulē Toll/Dif un IMD/Relish signalizācijas ceļi augļu mušās [49]. Pašlaik garnelēs ir identificētas vairākas AMP ģimenes, tostarp crustins, anti-lipopolisacharide faktori (Alfs) un penaeidīni [50]. Šis pētījums parādīja, ka FOXO var tieši vai netieši (izmantojot IMD/Relish signalizāciju) regulēt AMP, tostarp CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 un Alf-E1, ekspresiju. Mēs domājām, ka zema FOXO aktivācija garneļu hemocītos un zarnās normālos apstākļos varētu regulēt galveno Foxo mērķa gēnu, ti, Relish, lai uzturētu in vivo mikrobiotas homeostāzi. Infekcijas laikā iebrūkošie patogēni aktivizē FOXO, no kura lielākā daļa tiek pārvietota uz kodolu, kur tas regulē vairāk mērķa gēnu, tostarp dažus AMP, piemēram, Alf-E1 un CrusI-3, papildus Relish. Kopumā FOXO piedalās hemolimfas un zarnu mikrobiotas homeostāzes regulēšanā veselām garnelēm, aktivizējot IMD signālu bazālo līmeni hemolimfā un kuņģa-zarnu traktā. Patogēna infekcija aktivizē FOXO, samazinot AKT aktivitāti, un tieši un netieši veicina AMP ekspresiju sistēmiskajā imunitātē un vietējā (zarnu) imunitātē. Fagocitoze ir receptoru mediēta, no aktīna un ATP atkarīga parādība, ko izraisa daļiņu vai patogēnu saistīšanās ar specifiskiem citomembrānas receptoriem, un tā ir svarīgs imūnprocess, ar kura palīdzību saimnieks var pasargāt sevi no patogēniem [24]. Mazas GTPāzes, piemēram, RAB5 un RAB7, ir iesaistītas nepārtrauktā membrānas pārveidošanā un vezikulu satiksmē fagocitozes gadījumā. Mūsu iepriekšējais pētījums ziņoja, ka savācēju receptori SRB un SRC ir iesaistīti hemocītu fagocitozē kā garneļu receptori [38, 39]. Šajā pētījumā mēs noskaidrojām, ka pēc Foxo iznīcināšanas Src ekspresija ievērojami samazinājās un hemocītu fagocitozes ātrums ievērojami samazinājās, kas liecina, ka Src ir FOXO mērķa gēns un ka FOXO ir iesaistīts SRC mediētā patogēno baktēriju fagocitozē. FOXO varētu arī veicināt divu mazu GTPāžu, RAB5 un RAB7, ekspresiju. Šīs mazās GTPāzes ir iesaistītas secīgā agrīno un vēlo fagosomu transportēšanā un ir galvenie noteicošie faktori [51]. Fagosomas migrē no šūnas perifērijas uz intracelulāro reģionu, transportēšanas laikā RAB5 tiek aizstāts ar RAB7, un gala preces tiek transportētas uz lizosomu degradācijai [52,53]. Mēs arī noskaidrojām, ka RAB5 un RAB7 var lokalizēties kopā ar patogēniem hemocītos, kas norādīja, ka patogēnus fagocitizēja garneļu hemocīti, izejot cauri agrīnām un vēlīnām fagosomām, pirms tie beidzot tika noārdīti lizosomās. Tāpēc FOXO ir iesaistīts šūnu imūnreakcijā, veicinot hemocītu fagocitozi. Visbeidzot, mūsu rezultāti liecina, ka FOXO ne tikai piedalās mikrobiotas homeostāzes regulēšanā normālos apstākļos, bet arī patogēno baktēriju attīrīšanā inficētās garnelēs, veicinot AMP ekspresiju un hemocītu fagocitozi.

6. attēls. FOXO pilda savas antibakteriālās funkcijas garnelēs, regulējot AMP ekspresiju. (A, B) Amps ekspresija Foxo-knockdown garneļu hemocītos (A) un zarnās (B), kas noteikta ar qPCR, izmantojot -aktīna un Ef-1 ģeometrisko vidējo ekspresiju kā endogēnos kontroles gēnus; Kā kontrole tika izmantota dsGfp injekcija garnelēs. Dati tika statistiski analizēti, izmantojot Mann-Whiteny U testu. (C, D) Amps ekspresija Akt knockdown garneļu hemocītos (C) un zarnās (D) tika analizēta ar qPCR, izmantojot -aktīna un Ef-1 ģeometrisko vidējo ekspresiju kā endogēnos kontroles gēnus; Kā kontrole tika izmantota dsGfp injekcija garnelēs. Būtiskas atšķirības tika analizētas, izmantojot vienvirziena ANOVA. (E) Paredzēto FOXO saistīšanās vietu shematiskā diagramma uz Alf-E1 promotora. (F) ChIP un RT-PCR tika izmantoti, lai noteiktu FOXO saistīšanos ar Alf-E1 promotora secību, izmantojot primerus (Alf-E1-F un Alf-E1-R, 1. tabula). RT-PCR tika izmantots arī, lai pastiprinātu Alf-E1 kodējošo reģionu ar RT-PCR primeriem (Alf-E1-RT-F un Alf-E1-RT-R. 1. tabula), izmantojot ChIP. ieguva DNS kā veidni. Kā kontrole tika izmantota IgG antiviela, un mērķa joslas apstiprināšanai tika izmantots normāls genoma DNS pastiprinātais fragments.

7. att. FOXO uzlabo garneļu patogēnu hemocītu fagocitozi, veicinot SRC ekspresiju. (A) V. anguillarum hemocītu fagocitoze, kas novērota, izmantojot fluorescējošu imūncitoķīmisko testu fluorescences mikroskopā. V. anguillarum tika marķēts ar FITC (zaļš), un šūnu kodoli tika iekrāsoti ar DAPI (zilu). Sarkanā bultiņa norāda fagocītos hemocītus. Mēroga josla=20 μm. (A') Foxo-knockdown garneļu fagocītu ātruma un fagocītu indeksa statistiskā analīze. Kā kontrole tika izmantota dsGfp injekcijas grupa. Katrā eksperimentā fluorescences mikroskopā tika skaitīti pieci simti hemocītu. Dati tika statistiski analizēti, izmantojot Stjudenta t-testu. (B) Baktēriju fagocitoze ar hemocītiem, kas analizēta, izmantojot plūsmas citometriju. Fagocitētie hemocīti, kas satur baktērijas (R2), tika atdalīti no nefagocitētiem hemocītiem (R3), pamatojoties uz iezīmēto baktēriju fluorescences signālu hemocītos, izmantojot programmatūru IDEAS Application v6.{8}}. (B') Hemocītu fagocītiskais ātrums, pamatojoties uz plūsmas citometrijas datiem. Katrai analīzei tika saskaitīti trīs tūkstoši hemocītu un tika veikti trīs atkārtojumi. Kā kontrole tika izmantota dsGfp grupa. (C) V. anguillarum hemocītu fagocitozi Akt knockdown garnelēm novērojiet fluorescences mikroskopā. Mēroga josla=10 μm. (C') Fagocītu ātruma un fagocītu indeksa statistiskā analīze, pamatojoties uz datiem panelī (C). (D) Srb un Src mRNS ekspresijas līmenis Foxo knockdown garneļu hemocītos, kas analizēts ar qPCR, izmantojot -aktīna un Ef-1 ģeometrisko vidējo ekspresiju kā endogēnos kontroles gēnus. Kā kontrole tika izmantota dsGfp injekcija. (E) Srb un Src mRNS ekspresija Foxo-RNAi garneļu zarnās, kas analizēta ar qPCR, izmantojot -aktīna un Ef-1 ģeometrisko vidējo ekspresiju kā endogēnos kontroles gēnus. (F) Src mRNS ekspresija Akt-RNAi garneļu hemocītos, kas analizēta ar qPCR, izmantojot -aktīna un Ef-1 ģeometrisko vidējo ekspresiju kā endogēnos kontroles gēnus. (G) SRC proteīna līmenis Foxo-RNAi vai Akt-RNAi garneļu hemocītos, analizēts, izmantojot Western blotēšanu. dsGfp injekcija, ko izmanto kā kontroli. (G') Statistiskā analīze, kuras pamatā ir trīs paneļa (G) atkārtojumu dati.

materiāli un metodes

Ētikas paziņojums

Visi eksperimenti ar dzīvniekiem tika veikti saskaņā ar Ķīnas nacionālajām direktīvām (GB 14922.2–2011 un GB 14925–2010). Eksperimenti ar trušiem antivielu sagatavošanai pētījumā tika veikti saskaņā ar protokoliem, ko apstiprinājusi Šaņdunas Universitātes Dzīvības zinātņu skolas (SYDWLL-2021-54) Dzīvnieku kopšanas un labturības komiteja. Apstiprinājums saskaņā ar noteikumiem par garneļu izmantošanu mūsu pētījumā nebija nepieciešams, jo mūsu pētījumā tika izmantots ierobežots skaits parasto garneļu, ko bieži patērē plašāka sabiedrība.

Dzīvnieki

Veselīgas garneles (Marsupenaeus japonicus), kas katra sver aptuveni 6–10 g, tika iegūtas no ūdens produktu tirgus Qingdao, Shandong provincē, Ķīnā. Pirms eksperimenta garneles kultivēja vismaz 1 dienu garneļu kultivēšanas sistēmā ar gāzētu jūras ūdeni 23–25˚C, lai aklimatizētu jaunajā vidē.

8. attēls. RAB5 un RAB7 ir iesaistīti FOXO mediētā garneļu hemocītu fagocitozē. (A, B) qPCR tika izmantots, lai analizētu Rab5 un Rab7 mRNS ekspresijas līmeņus Foxo-knockdown garneļu (A) un Akt-knockdown garneļu (B) hemocītos ar un bez bakteriālas infekcijas. qPCR izmantoja -aktīna un Ef-1 ģeometrisko vidējo ekspresiju kā endogēnos kontroles gēnus. (C) RAB5 un RAB7 proteīna līmenis Foxo-knockdown garneļu hemocītos 2 stundas pēc V. anguillarum iedarbības, kas noteikts, izmantojot Western blot metodi. (C') Statistiskā analīze, kuras pamatā ir trīs paneļa (C) atkārtojumu dati. (D) RAB5 un RAB7 proteīna līmenis Akt-knockdown garneļu hemocītos 2 stundas pēc V. anguillarum iedarbības, kas noteikts, izmantojot Western blotēšanu. (D') Statistiskā analīze, kuras pamatā ir trīs paneļa (D) atkārtojumu dati.

Bioinformātiskā analīze

Foxo pilna garuma cDNS secība tika iegūta no M. japonicus (BGI, Shenzhen, Ķīna) hemocītu un zarnu transkripcijas toma sekvencēšanas. Foxo atvērtais nolasīšanas rāmis (ORF) tika pastiprināts, izmantojot primeru pāri (Foxo-EX-F un Foxo-EX-R; 1. tabula), lai apstiprinātu secību. Atbilstošā cDNS tika konceptuāli tulkota, lai iegūtu izsecināto olbaltumvielu secību, izmantojot ExPASy-Translation rīku (//cn.expasy.org/). Līdzības analīze tika veikta, izmantojot BLAST (//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/), un domēna arhitektūras prognozēšana tika veikta, izmantojot SMART (//smart.emblheidelberg.de). Izmantojot MEGA 6.0 programmu [54], tika izveidots dažādu sugu FOXO filogenētiskais koks.

9. att. RAB5 un RAB7 lokalizējas kopā ar V. anguillarum. RAB5 un RAB7 līdzās lokalizācija ar FITC marķējumu-V. anguillarum garneļu hemocītos, analizējot, izmantojot fluorescējošu imūncitoķīmisko testu. Baktērijas tika marķētas ar FITC (zaļš) un injicētas garnelēs. Hemocīti tika savākti no piecām garnelēm 30 minūtes un 1 stundu pēc baktēriju injekcijas un inkubēti ar anti-RAB5 vai anti-RAB7 antivielām. Sekundārā antiviela bija anti-trušu IgG Alexa-546 (sarkana). Kodoli tika iekrāsoti ar DAPI (zilu). Koplokalizācija hemocītos ir norādīta ar baltām bultiņām. Mēroga josla=10 μm.

10. attēls. Shematisks attēlojums par FOXO iesaistīšanos garneļu lokālajā un sistēmiskajā iedzimtajā imunitātē. (A) Neinficētos apstākļos FOXO uztur hemolimfas un zarnu mikrobiotas homeostāzi, veicinot Relish un pēc tam AMP ekspresiju. (B) Inficētos apstākļos patogēna infekcija samazina AKT fosforilāciju, kā rezultātā palielinās FOXO saturs kodolā. FOXO tieši veicina Relish un AMP izpausmi, lai likvidētu invazīvos patogēnus; no otras puses, FOXO veicina patogēnu fagocitozi, izmantojot SRC mediēto fagocitozes ceļu.

Baktēriju izaicinājums un paraugu ņemšana

Vibrio anguillarum (ATCC 43305), kas iegūts Šaņdunas Universitātes Jūras koledžā (Wei hai, Ķīna) un tagad tiek saglabāts mūsu laboratorijā. V. anguillarum kultivēja nakti 37 ˚C LB barotnē un atkārtoti kultivēja 4 stundas ar 1:100 inokulāciju otrajā dienā. Baktērijas logaritmiskās augšanas fāzē tika savāktas, centrifugējot ar ātrumu 5000 x g 5 minūtes 4 °C temperatūrā un divas reizes mazgātas ar fosfātu buferšķīdumu (PBS: 10 mM Na2HPO4, 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl un 1,8 mM KH2PO4). pH 7,4). V. anguillarum atkārtoti suspendēts fosfātu buferšķīdumā garneļu iedarbībai. Katras garneles vēderā, izmantojot mikrošļirci, tika ievadītas aptuveni 2 × 107 koloniju veidojošās vienības (CFU) / garneles. Kontroles grupai injicēja tādu pašu daudzumu PBS. Hemocīti, sirds, aknu aizkuņģa dziedzeris, žaunas, kuņģis un zarnas tika savākti no vismaz trim garnelēm RNS un olbaltumvielu ekstrakcijai. Hemocītu savākšanai hemolimfa tika ekstrahēta no ventrālā sinusa, izmantojot šļirci, kas iepriekš iepildīta ar 0, 8 ml antikoagulanta buferšķīduma (10% nātrija citrāta), un pēc tam ātri centrifugēja ar ātrumu 700 × g 8 minūtes 4 ° C temperatūrā hemocītu izolēšanai.

RNS un olbaltumvielu ekstrakcija un cDNS sintēze

Kopējā RNS tika ekstrahēta no hemocītiem un dažādiem garneļu orgāniem, izmantojot TRIzol (ET101, Transgen, Pekina, Ķīna). Olbaltumvielas no dažādiem orgāniem tika ekstrahētas, izmantojot radioimmunoprecipitācijas testu (RIPA) līzes buferi (P0013B, Beyotime, Jiangsu, Ķīna). Pirmās ķēdes cDNS sintēze tika veikta, izmantojot cDNS sintēzes komplektu (5x All-in-One RT MasterMix; Applied Biological Materials-abm, Vankūvera, Kanāda), ievērojot ražotāja norādījumus.

1. tabula. Šajā pētījumā izmantoto praimeru secības.

MasterMix; Applied Biological Materials-abm, Vankūvera, Kanāda), ievērojot ražotāja norādījumus.

Rekombinantā ekspresija un antivielu sagatavošana

Foxo cDNS secība tika pastiprināta ar reversās transkripcijas polimerāzes ķēdes reakciju (RT-PCR), izmantojot praimerus Foxo-EX-F un Foxo-EX-R (1. tabula). Pēc tam attīrītie PCR produkti tika sagremoti, izmantojot restrikcijas enzīmus, un ligēti plazmīdā pGEX-4T-1 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, ASV). un konstruētās plazmīdas tika pārveidotas Escher ichia coli Rosseta (DE3) šūnās. Olbaltumvielu ekspresija tika ierosināta, izmantojot 1 mM izopropil- - D-tio-galaktopiranozīdu 37 °C temperatūrā. Rekombinantie proteīni tika pakļauti afinitātes hromatogrāfijai, izmantojot glutationa (GST) sveķus (C600031, BBI, Šanhaja, Ķīna), ievērojot ražotāja norādījumus. Trušu antiserumi pret FOXO tika sagatavoti saskaņā ar iepriekš aprakstīto metodi [55].

Western blotēšana

No dažādiem orgāniem vai hemocītiem ekstrahētie proteīni tika atdalīti, izmantojot 10% nātrija dodecilsulfāta poliakrilamīda gēla elektroforēzi (SDS-PAGE). SDS-PAGE gēlos esošās olbaltumvielas tika pārnestas uz celulozes nitrāta membrānu, izmantojot pārneses buferšķīdumu (25 mM Tris-HCl, 20 mM glicīna, 0,037% mM SDS un 20% etanolu). un inkubēja 5% vājpiena vai 3% liellopu seruma albumīna (BSA) Tris buferšķīdumā (TBS: 150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl, pH 8,0) 1 stundu, maigi kratot istabas temperatūrā. Pēc tam membrānas tika inkubētas ar primāro antiserumu: Anti-FOXO atšķaidījumā 1:100, anti-RAB5 1:25, anti-Rab7 1:25, anti-beta aktīns (ACTB) 1:250 (sagatavots mūsu laboratorijā). ); Histona-3 poliklonālās antivielas (A2348, ABclonal, Uhaņa, Ķīna, 1:2500); anti-fosforilētās (p)-AKT poliklonālās antivielas (WLP001a, Wanleibio, Shenyang, Ķīna, 1:500) un viegli sakrata nakti 4 °C temperatūrā. Pēc trīs reizes mazgāšanas ar TBST (TBS pievienots 0,1% Tween-20), membrānas tika inkubētas ar sekundāro antivielu (ZB2308 ZSGB-Bio, Pekina, Ķīna, 1:5,000) vai ( ZB2301 ZSGB-Bio, Pekina, Ķīna, 1:5,000) 3 stundas istabas temperatūrā, maigi kratot. Imunoreaktīvās proteīna joslas tika izstrādātas, izmantojot nitrotetrazolija zilā hlorīda (A610379, BBI) un P-toluidīna sāls (A610072, BBI) šķīdumu tumšos apstākļos vai izmantojot pastiprinātu hemiluminiscenci (ECL). -aktīns vai Histons-3 tika izmantoti kā atsauces.

Audu sadalījuma un ekspresijas modeļi garnelēs, kuras apdraud baktērijas

Foxo/FOXO audu sadalījums hemocītos, sirdī, žaunās, krēpās, kuņģī un zarnās tika analizēts, izmantojot RT-PCR ar praimeriem Foxo-F un Foxo-R (1. tabula) un Western blot ar anti-FOXO antivielām, attiecīgi. PCR procedūra sastāvēja no sākotnējās inkubācijas 94˚C 3 minūtes; kam seko 35 cikli 94 ˚C 30 s, 50 ˚C 30 s un 72 ˚C 30 s; kam seko 72˚C 10 min. PCR produkti tika analizēti, izmantojot agarozes gēla elektroforēzi (1,5% agarozes). Aktīna gēns (-actin-F un -actin-R; 1. tabula) tika izmantots kā iekšējā kontrole. Foxo/FOXO laika gaitas ekspresijas modeļi RNS un olbaltumvielu līmeņos garnelēs, kas inficētas ar V. anguillarum, tika analizētas, izmantojot kvantitatīvu reāllaika PCR (qPCR) termociklerā (qTOWER3, ANALYTIK JENA AG, Jena, Vācija) un West ern blotting, attiecīgi. qPCR procedūra ietvēra: 95˚C 10 minūtes; 40 cikli 95 ˚C 10 s un 60 ˚C 50 s; un pēc tam kušanas periods no 65˚C līdz 95˚C. Foxo ekspresijas pro faili tika iegūti, izmantojot 2-ΔΔCT metodi [56], izmantojot normalizēšanai divu iekšējo kontroles gēnu -aktīna un Ef-1 ģeometrisko vidējo vērtību. Praimeru pāra efektivitāte qPCR tika analizēta pēc MIQE metodes [57] ar cDNS maisījuma logaritmisko atšķaidījumu 10-kārtīgi, lai izveidotu lineāru standarta līkni.

Kodola un citoplazmas proteīnu izolēšana

Zarnu audi tika atdalīti no garnelēm un trīs reizes mazgāti PBS. Olbaltumvielu ekstrakcija tika veikta, izmantojot kodola un citoplazmas proteīna ekstrakcijas komplektu (R0050, Solarbio, Pekina, Ķīna), ievērojot ražotāja norādījumus. Lai novērstu individuālās atšķirības, olbaltumvielu ekstrakcijai tika izmantotas vismaz trīs garneles.

RNS traucējumu tests

Lai analizētu gēnu funkciju, mēs veicām RNS traucējumu (RNAi) testus. Vairāki primeru pāri, kas satur T7 promotora secību (Foxo-RI-F un Foxo-RI-R; Rab5-RI-F un Rab5 -RI-R; Rab7-RI- F un Rab7 -RI-R; Akt-RI-F un Akt-RI-R. 1. tabula) tika izstrādāti, lai pastiprinātu dsRNS sintēzes veidnes. Izmantojot T7 RNS polimerāzi (EP0111, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV) un cDNS veidni, mēs sintezējām dsRNS fragmentus. Divu virkņu zaļā fluorescējošā proteīna dsGfp RNS kalpoja par kontroli, kas tika pastiprināta, izmantojot Gfp-RI-F un Gfp -RI-R (1. tabula) kā primerus dsGfp sintēzei. Pēc tam dsRNS fragmenti (50 ug/katrs) tika injicēti M. japonicus vēdera segmentā, izmantojot mikrošļirci, un 12 stundas vēlāk, izmantojot to pašu devu, tika veikta otrā injekcija. RNS traucējumu efektivitāte tika analizēta, izmantojot kvantitatīvu reālā laika reversās transkripcijas PCR (qRT-PCR, kas ietver RNS reverso transkripciju, veidojot cDNS, ko pēc tam izmantoja kā veidni qPCR testā) vai Western blot 24 stundas pēc otrās injekcijas. -aktīns tika izmantots kā iekšējā atsauce.

Atsauces

1. Calnan DR, Brunet A. FoxO kods. Onkogēns. 2008. gads; 27(16): 2276–2288. https://doi.org/10.1038/ onc.2008.21 PMID: 18391970.

2. Tran H, Brunet A, Grenier JM, Datta SR, Fornace AJ, DiStefano PS u.c. DNS remonta ceļš, ko stimulē dakšveida transkripcijas faktors FOXO3a caur Gadd45 proteīnu. Zinātne. 2002. gads; 296 (5567): 530–534. https://doi.org/10.1126/science.1068712 PMID: 11964479.

3. Martins R, Lithgow GJ, Link W. Lai dzīvo FOXO: FOXO proteīnu lomas atrisināšana novecošanā un ilgmūžībā. Novecojoša šūna. 2016. gads; 15(2):196–207. https://doi.org/10.1111/acel.12427 PMID: 26643314.

4. Vogt PK, Jiang H, Aoki M. Trīskāršā slāņa kontrole-fosforilēšana, acetilēšana un FOXO proteīnu ubikvitinācija. Šūnu cikls. 2005. gads; 4(7):908–913. https://doi.org/10.4161/cc.4.7.1796 PMID: 15917664. 5. Daitoku H, Sakamaki J, Fukamizu A. FoxO transkripcijas faktoru regulēšana ar acetilēšanu un proteīna-proteīnu mijiedarbību. Bba-Mol Cell Res. 2011. gads; 1813(11):1954–1960. https://doi.org/10.1016/j. bbamcr.2011.03.001 PMID: 21396404.

6. Wang Y, Zhou YM, Graves DT. FOXO transkripcijas faktori: to klīniskā nozīme un regulējums. Biomed Res Int. 2014. gads; 2014:1–13. https://doi.org/10.1155/2014/925350 PMID: 24864265.

7. Murphy CT, McCarroll SA, Bargmann CI, Fraser A, Kamath RS, Ahringer J u.c. Gēni, kas darbojas lejpus DAF-16, lai ietekmētu Caenorhabditis elegans dzīves ilgumu. Daba. 2003. gads; 424(6946):277–284. https://doi.org/10.1038/nature01789 PMID: 12845331. 8. Sergi C, Shen F, Liu SM. Insulīna/IGF-1R, SIRT1 un FOXO ceļi — intriģējoša mijiedarbības platforma kaulu un osteosarkomas ārstēšanai. Priekšējais endokrinols (Lozanna). 2019. gads; 10:93–103. https://doi.org/10. 3389/fendo.2019.00093 PMID: 30881341.

9. Brunete A, Bonni A, Zigmond MJ, Lin MZ, Juo P, Hu LS u.c. Akt veicina šūnu izdzīvošanu, fosforilējot un inhibējot dakšveida transkripcijas faktoru. Šūna. 1999. gads; 96(6):857–868. https://doi.org/10.1016/ s0092-8674(00)80595-4 PMID: 10102273.

10. Huang H, Regan KM, Wang F, Wang DP, Smith DI, van Deursen JMA u.c. Skp2 inhibē FOX01 audzēja nomākšanā, izmantojot ubikvitīna izraisītu degradāciju. P Natl Acad Sci USA. 2005. gads; 102(5):1649–1654. https://doi.org/10.1073/pnas.0406789102 PMID: 15668399.

11. Ogg S, Paradis S, Gottlieb S, Patterson GI, Lee L, Tissenbaum HA u.c. Dakšas galvas transkripcijas faktors DAF-16 pārveido insulīnam līdzīgus vielmaiņas un ilgmūžības signālus C. elegans. Daba. 1997. gads; 389 (6654): 994–999. https://doi.org/10.1038/40194 PMID: 9353126.

12. Fink C, Hoffmann J, Knop M, Li Y, Isermann K, Roeder T. Intestinal FoxO signalizācija ir nepieciešama, lai izdzīvotu perorāla infekcija Drosophila. Gļotādas imunols. 2016. gads; 9(4):927–936. https://doi.org/10.1038/mi. 2015.112 PMID: 26627459.

13. Spellberg MJ, Marr MT. FOXO regulē RNS traucējumus Drosophila un aizsargā no RNS vīrusa infekcijas. P Natl Acad Sci USA. 2015. gads; 112(47):14587–14592. https://doi.org/10.1073/pnas. 1517124112 PMID: 26553999.

14. Guo LL, Karpac J, Tran SL, Jasper H. PGRP-SC2 veicina zarnu imūnsistēmu homeostāzi, lai ierobežotu commen sal disbiozi un pagarinātu dzīves ilgumu. Šūna. 2014. gads; 156 (1–2): 109–122. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.12. 018 PMID: 24439372.

15. Becker T, Loch G, Beyer M, Zinke I, Aschenbrenner AC, Carrera P u.c. No FOXO atkarīga iedzimtas imūnās homeostāzes regulēšana. Daba. 2010. gads; 463(7279):369–373. https://doi.org/10.1038/ nature08698 PMID: 20090753.

16. Seiler F, Hellberg J, Lepper PM, Kamyschnikow A, Herr C, Bischoff M u.c. FOXO transkripcijas faktori regulē iedzimtos imūnmehānismus elpošanas epitēlija šūnās. J Immunol. 2013. gads; 190(4):1603–1613. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1200596 PMID: 23315071.

17. Graves DT, Milovanova TN. Gļotādas imunitāte un FOXO1 transkripcijas faktori. Front Immunol. 2019. gads; 10:2530–2541. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02530 PMID: 31849924.

18. Bulet P, Stocklin R, Menin L. Pretmikrobu peptīdi: no bezmugurkaulniekiem līdz mugurkaulniekiem. Immunol Rev. 2004; 198:169–184. https://doi.org/10.1111/j.{8}}.2004.0124.x PMID: 15199962.

19. Buchon N, Silverman N, Cherry S. Drosophila melanogaster imunitāte — no mikrobu atpazīšanas līdz visa organisma fizioloģijai. Nat Rev Immunol. 2014. gads; 14(12):796–810. https://doi.org/10.1038/nri3763 PMID: 25421701.

20. Hoffmann JA, Reihharts JM. Drosophila iedzimtā imunitāte: evolūcijas perspektīva. Nat Immunol. 2002. gads; 3(2):121–126. https://doi.org/10.1038/ni0202-121 PMID: 11812988.

21. Hultmark D. Drosophila imunitāte: ceļi un modeļi. Curr Opin Immunol. 2003. gads; 15(1):12–19. https://doi.org/10.1016/s0952-7915(02)00005-5 PMID: 12495727.

22. Li FH, Xiang JH. Jaunākie sasniegumi pētījumos par garneļu iedzimto imunitāti Ķīnā. Dev Comp Immunol. 2013. gads; 39(1–2):11–26. https://doi.org/10.1016/j.dci.2012.03.016 PMID: 22484214.

23. Sun JJ, Lan JF, Zhao XF, Vasta GR, Wang JX. C tipa lektīna spirālveida domēna saistīšanās ar Domeless receptoru tieši aktivizē JAK/STAT ceļu garneļu imūnreakcijā pret baktēriju infekciju. PLoS Patogs. 2017. gads; 13(9): e1006626. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006626 PMID: 28931061.

24. Gordons S. Fagocitoze: imūnbioloģisks process. Imunitāte. 2016. gads; 44(3):463–475. https://doi.org/ 10.1016/j.immuni.2016.02.026 PMID: 26982354.

25. Wang S, Xia PY, Huang GL, Zhu PP, Liu J, Ye BQ u.c. FoxO1-mediētā autofagija ir nepieciešama NK šūnu attīstībai un iedzimtai imunitātei. Nat Commun. 2016. gads; 7:11023–11037. https://doi.org/10.1038/ ncomms11023 PMID: 27010363.

26. Dongs G, Song L, Tian C, Wang Y, Miao F, Zheng J u.c. FOXO1 regulē baktēriju izraisītu neitrofilu aktivitāti. Front Immunol. 2017. gads; 8:1088–1102. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01088 PMID: 28928749.

27. Wang XW, Zhao XF, Wang JX. C tipa lektīns saistās ar beta-Integrīnu, lai veicinātu hemocītisko fagocitozi bezmugurkaulniekiem. J Biol Chem. 2014. gads; 289(4):2405–2414. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.528885 PMID: 24324258.

28. Norouzitallab P, Baruah K, Vanrompay D, Bossier P. Garneļu pašaizsardzības mācīšana cīņā pret infekcijām. Trends Biotechnol. 2019. gads; 37(1):16–19. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.05.007 PMID: 29914649.

29. Flegel TW. Garneļu patogēnu vēsturiskā parādīšanās, ietekme un pašreizējais stāvoklis Āzijā. J Invertebr Pathol. 2012. gads; 110(2):166–173. https://doi.org/10.1016/j.jip.2012.03.004 PMID: 22429834.

30. Wang PH, Huang TZ, Zhang XB, He JG. Pretvīrusu aizsardzība garnelēm: no iedzimtas imunitātes līdz vīrusu infekcijai. Antivir Res. 2014. gads; 108:129–141. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2014.05.013 PMID: 24886688.

31. Obsil T, Obsilova V. FOXO transkripcijas faktoru regulējuma pamatā esošās struktūras/funkciju attiecības. Onkogēns. 2008. gads; 27(16):2263–2275. https://doi.org/10.1038/onc.2008.20 PMID: 18391969.