Abstrakts

Patērētāju interese par kosmētikas nozares produktiem ar ādu izgaismojošu efektu ir palielinājusi pieprasījumu pēc melanoģenēzi mazinošiem preparātiem. Vairākas anti-melanogēnas zāles ir zināmas ar blakusparādībām, piemēram, kontaktdermatītu un augstu toksicitāti, kā arī sliktu iekļūšanu ādā. Ievērojami nesen veikti pētījumi ir vērsti uz augu izcelsmes produktiem kā alternatīvām ķīmijterapijas zālēm ar mazākām blakusparādībām.

Tūlītējā pētījumā mēs pārbaudījām ārpusšūnu pūslīšu (EV) anti-melanogēno iedarbību, kas ekstrahētas no Dendropanax patogēna lapotnēm un kātiem. Strādājot ar spektrofotometriskām un bioķīmiskām metodēm, mēs noskaidrojām, ka no lapām iegūtās ekstracelulārās pūslīši (LEV) un no stumbra ekstracelulārās pūslīši (SEV) samazināja melanīna saturu un tirozināzes (TYR) aktivitāti no koncentrācijas atkarīgā veidā B16BL6 peles melanomas šūnu līnijā. Elektronu mikroskopiskā analīze arī parādīja, ka LEV un SEV izraisīja no koncentrācijas atkarīgu melanīna satura samazināšanos melanomas šūnās. Salīdzinot ar arbutīnu kā pozitīvu kontroli, LEV un SEV uzrādīja spēcīgāku balināšanas efektu uz melanomas šūnām, un LEV balinošais efekts bija spēcīgāks. Proti, ne LEV, ne SEV neizraisīja nozīmīgu citotoksicitāti. Mēs arī pārbaudījām augu izcelsmes EV ietekmi uz ar tirozināzi saistīto proteīnu (TRP) ekspresiju melanomas šūnās. LEV inhibēja ar melanoģenēzi saistīto gēnu un proteīnu, tostarp ar mikroftalmiju saistīto transkripcijas faktoru (MITF), TYR, TRP-1 un TRP-2, ekspresiju. Cilvēka epidermas modelī LEV melanoģenēzi kavēja spēcīgāk nekā arbutīns. Kopumā mūsu dati liecina, ka lev no D. patogēniem var būt jauna dabiska viela, ko izmanto kā pretmelanogēnu līdzekli farmaceitiskajos preparātos.

atslēgvārdi:Augu izcelsmes EV; LEV unSEV; anti-melanogēns; TYRaktivitāte; melanīna saturs unCistanche ekstrakta priekšrocības

Noklikšķiniet šeit, lai iegūtuCistanche priekšrocības ādas balināšanaiunCistanche ekstrakta iedarbība

Ievads

Melanīnu, kas ir svarīga cilvēka matu, acu un ādas pigmentācijas sistēmas daļa, ražo melanocīti, izmantojot procedūru, ko sauc par melanoģenēzi. Nenormāla melanīna uzkrāšanās var izraisīt ādas bojājumus, piemēram, vasaras raibumus, saules raibumus un melasmu, kā arī var izraisīt vēzi un vitiligo. Tāpēc melanoģenēzes regulēšana ir būtiska stratēģija hiperpigmentētu traucējumu ārstēšanā. Piemēram, hidrohinons, hidroksifenilsavienojums, kas traucē TYR darbību, tiek izmantots kā ādas balināšanas līdzeklis kosmētikas rūpniecībā. Tomēr hidrohinons var izraisīt blakusparādības, piemēram, kontaktdermatītu un eksogēnu brūnināšanas slimību. Va-skābe ir vēl viens sintētisks līdzeklis, kas kavē TYR aktivitāti, taču tā lietošana ir saistīta ar biežu tūsku vai kairinājumu.

Ir pieaugusi interese identificēt alternatīvas zāles no dabīgiem avotiem pret melanoģenēzi, ņemot vērā esošo ķīmisko savienojumu ierobežojumus, kas atspoguļo faktu, ka no augiem un garšaugiem izgatavotie kosmētikas produkti mēdz būt maigāki, bioloģiski noārdāmāki un tiem ir zemāka toksicitāte nekā sintētiskie. savienojumi. Ir pierādīts, ka dendrobija slimības lapu ekstrakti kavē melanīna ražošanu, tieši mijiedarbojoties ar intracelulāro TYR aktivāciju un melanīna biosintēzē iesaistīto enzīmu ekspresiju. Līdzīgā veidā Croton officinalis lapu ekstrakts nomāca melanīna saturu un šūnu TYR aktivitāti, inhibējot ar melanoģenēzi saistīto transkripcijas faktoru (MITF) un melanogēnos enzīmus. Turklāt zīdkoka lapām bija inhibējoša ietekme uz TYR aktivitāti un melanīna veidošanos melan-A šūnās. P-kumarskābe no žeņšeņa lapām tika identificēta kā galvenais TYR inhibitors.

Herba Cistanche

Neskatoties uz to, ka ārstniecības kosmētikas preparātos ir izmantots plašs botānisko savienojumu klāsts, to zemā šķīdība, zemā mērķa afinitāte un mērena ādu izgaismojoša iedarbība ir kavējušas progresu botāniskās kosmētikas terapeitiskās iedarbības uzlabošanā. Tas ir motivējis meklēt jaunas un progresīvas metodes, lai uzlabotu ārstniecisko un bioaktīvo savienojumu efektivitāti un uzlabotu to piegādes ādā efektivitāti. Piemēram, ir veiksmīgi izstrādātas vairākas nanopiegādes tehnoloģijas, tostarp nano-lovely efektīvai ādas kopšanai, nano-kvercetīns ultravioletā (UV) starojuma izraisīto šūnu bojājumu aizkavēšanai, nanofullerēni kolagēna reģenerācijai un ādas novecošanās novēršanai. , nano-luteolīns antioksidantu aktivitātes uzturēšanai un nano-resveratrols ādas aizsardzībai no UV starojuma.

Šajā pētījumā mēs koncentrējamies uz augu izcelsmes ekstracelulāro pūslīšu (EV) lomu. Jaunākie pētījumi ir parādījuši, ka no augu izcelsmes EV ir struktūra, kas līdzīga zīdītāju izolētu eksosomu struktūrai un darbojas kā ārpusšūnu ziņotāji, kas veicina starpšūnu komunikāciju. Turklāt šīs pūslīši spēj pārvietot mRNS, mikro-RNS (miRNS), bioaktīvos lipīdus un olbaltumvielas dzīvnieku šūnās.

Pa to laiku mēs esam pētījuši no slimu pākšaugu lapām un kātiem iegūto EV inhibējošo ietekmi uz melanoģenēzi. Mēs raksturojām no lapām iegūto ekstracelulāro pūslīšu (LEV) un no stumbra iegūto ekstracelulāro pūslīšu (SEV) lielumu un īpašības, kas ekstrahētas no slimu pākšaugu lapām un kātiem, un parādījām, ka šos EV viegli uztver melanomas šūnas un tie nebija citotoksiski. Lai parādītu LEV un SUV anti-melanogēno iedarbību, mēs pārbaudījām melanīna saturu un TYR aktivitāti melanomas šūnās. Tālāk mēs novērtējām EV ietekmi uz sarežģīto melanīna sintēzes procesu, pārraugot dažādu olbaltumvielu un enzīmu līmeņa izmaiņas.

Alfa-melanocītu stabilizējošais hormons (-MSH) saistās ar melanokortīna 1 receptoru (MC1R) uz šūnas virsmas un aktivizē adenilāta ciklāzi, kā rezultātā palielinās cikliskā adenozīna monofosfāta (cAMP) intracelulārais līmenis. cAMP tiek mediēts ar cAMP atkarīgo proteīnkināzi A, izraisot cAMP atbildes elementu saistošā proteīna (CREB) fosforilēšanos. Aktivētais CREB inducē MITF, kas izpaužas melanocītos un kam ir galvenā loma melanocītu diferenciācijā un attīstībā. -TRP1 ir būtiska pareizai TYR pārvietošanai uz melanīna sintēzi, un TRP2 ir svarīga loma TRP katalītiskajā aktivitātē melanīna sintēzes sākumposmā. Šie trīs mijiedarbojas melanomas šūnās (1. papildu attēls).

Mēs atklājām samazinātu MITF ekspresiju ar LEV ārstētās melanomas šūnās, kam sekoja samazināta TYR, TRP-1 un TRP-2 ekspresija, un ar elektronu mikroskopiju apstiprinājām, ka melanīna sintēze šajās šūnās tika samazināta. ultrastrukturālais līmenis. Mēs arī apstiprinājām LEV anti-melanogēno iedarbību, izmantojot rekonstruētu cilvēka epidermas modeli. Lai kvantitatīvi novērtētu LEV inhibējošo ietekmi uz šūnu melanīna sintēzi, mēs sagatavojām standarta šķīdumus no audiem un izmērījām melanīna saturu, izmantojot kolorimetru. melanīna plankumi tika samazināti Fontana-Masson krāsotajās audu sekcijās. LEV inhibēja melanīna ražošanu efektīvāk nekā TYR inhibitors arbutīns, ko izmantoja kā pozitīvu kontroli.

Kopumā šie atklājumi liecina, ka no dabīgām vielām iegūtu EV izmantošana hiperpigmentācijas ārstēšanai ir iespējama turpmākā pieeja farmācijas nozarei. Turklāt, ņemot vērā maza izmēra, zemas toksicitātes, augstas uzņemšanas un vides drošības priekšrocības, no augu izcelsmes EV ir nākamās paaudzes terapeitiskās piegādes sistēmas citu slimību ārstēšanai. Proti, no augu izcelsmes EV ir laba anti-melanogēna iedarbība uz rekonstruētiem cilvēka ādas audiem (līdzīgi kā cilvēka epidermai), kas ir pamats turpmākiem klīniskiem pētījumiem.

Cistanche papildinājums

materiāli un metodes

1. D. morbifera LEV un SUV izolācija

Svaigas lapas un stublāji tika savākti no Poge salas, Guandao-gun un Jeollanam-do. EV tika izolēti no attiecīgi 50 g lapu un stublāja, sasmalcinot ar ekstraktoru un izlaižot iegūto sulu caur filtrpapīru un centrifugējot ar ātrumu 10, 000 × g 10 minūtes. Lieli atkritumi tika noņemti, filtrējot supernatantu caur 0,22 μm membrānu, kam sekoja centrifugēšana, izmantojot Amicon Ultra-4 PL 100 K centrifūgas filtru (Merck Millipore. Darmstadt, Vācija), lai koncentrētu EV, centrifugējot paraugus ar ātrumu 5000 × g 10 minūtes 4 grādu temperatūrā. Pēc centrifugēšanas EV olbaltumvielu koncentrācija tika noteikta, izmantojot bishinolīnskābes (BCA) proteīna testa komplektu (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV).

2. Izolētu EV izmēru raksturojums

Izolēto EV hidrodinamisko izmēru mērīja ar dinamisko gaismas izkliedi (DLS), metodi, ko izmanto, lai noteiktu suspensijā esošo mazo daļiņu sadalījumu pēc izmēra, izmantojot Zetasizer Nano ZS90 sistēmu (Malvern Instruments, Malvern, UK). Savāktās EV tika ievietotas nemainīgas temperatūras kamerā 20 grādu temperatūrā. Daļiņu izmēru sadalījums un z-vidējais lielums, ko izmantoja, lai noteiktu hidrodinamisko daļiņu izmēru sadalījumu, tika noteikts, mērot izkliedes intensitātes autokorelācijas funkciju. Izolētie EV tika atšķaidīti ar burbuļūdeni bez pūslīšiem un pēc tam pakļauti nanodaļiņu izsekošanas analīzei (NTA) (Nanosight; izmantojot 488 nm lāzeru 25 grādos).

3. EV transmisijas elektronu mikroskopiskā analīze

Transmisijas elektronu mikroskopijas (TEM) analīzei uz vara režģa pārklātas oglekļa plēves tika ievietoti 5 μL parauga šķīduma. Pēc parauga adsorbcijas 1 minūti, režģi tika mazgāti ar pilienu tīra ūdens un pēc tam negatīvi iekrāsoti ar 1 procentu uranilacetātu 1 minūti. Liekais traips tika noņemts ar filtrpapīru, un režģi tika žāvēti gaisā. Paraugi tika attēloti fokusā starp 0.8 - 1,5 μm, izmantojot JEM- 1400 Plus transmisijas elektronu mikroskopu (JEOL Ltd., Tokija, Japāna), kas aprīkots ar Lab6 lielgabalu, kas darbojas ar 120 kV spriegumu. . Attēli tika ierakstīti, izmantojot UltraScan OneView CMOS kameru (Gatana, Pleasanton, CA, ASV).

Cistanche tubulosa

4. Liposomu sagatavošana

Liposomu maisījumi tika sagatavoti, izmantojot DMPC (1,2-stearoil-sn-glicerīna-3-fosfoholīna) attiecību 95:5 (mol/mol) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, ASV) ar DSPE-mPEG (1,2-stearoil-sn-glicerīns-3-fosfoetanolamīns-[metoksi(polietilēnglikols)- 2000] (Avanti polārie lipīdi), lai sagatavotu liposomu maisījumus kā lipīdu membrānas. hidrofobā fluorescējošā krāsviela 1,1-dioktadecil-3,3,3ʹ,3'-tetrametilindokarbocianīna perhlorāts (DiI, Invitrogen, Waltham, MA, ASV) tika sajaukta ar EV, 725,49 ug DMPC, 151PE6-4. un 15 ug DiI. Pēc organiskā šķīdinātāja iztvaicēšanas membrāna, kas satur lipīdu un DiI maisījumu, tika hidratēta ar 1 ml fosfātu buferšķīduma (PBS). Pēc tam, izmantojot ekstruderu (Avanti Polar), tika sagatavotas 100 nm lielas liposomas. Lipīdi).

5. Šūnu kultūras un dzīvotspējas testi

B16BL6 melanomas šūnas tika kultivētas alfa-minimālā ēteriskā barotnē (alfa-MEM), kas satur 10 procentus liellopu augļa seruma (Rocky Mountain Biologicals, Missoula, MT, ASV) un 1 procentu penicilīna/streptomicīna (Lonza, Bāzele, Šveice) (Gibco, Thermo). Fisher Scientific) kultūrā. Šūnas tika inkubētas 37 grādu temperatūrā mitrinātā 5% CO2 atmosfērā. 100 μL B16BL6 melanomas šūnu tika inokulēti 96-iedobju plāksnēs (5 × 104 šūnas/iedobē), lai veiktu šūnu dzīvotspējas testus. Pēc 24 stundu inkubācijas šūnas 24 stundas apstrādāja ar LEV un SEV koncentrācijās attiecīgi 1, 5 un 10 µg / ml. Liposomu un arbutīna koncentrācija visos eksperimentos bija attiecīgi 10 µg/mL un 70 µg/mL. Pēc tam katrai iedobei pievienoja 10 µL EZ-Cytox reaģenta (Daeil Lab Service, Seula, Koreja). Plāksnes inkubēja 1 stundu. Pēc tam plāksnes viegli sakrata, un absorbcija tika mērīta pie 450 nm, izmantojot enzīmu marķieri (BioTek, Winooski, VT, ASV).

ATSAUCES

[1] Meredita P, Sarna T. Eumelanīna fizikālās un ķīmiskās īpašības. Pigment Cell Res. 2006;19(6):572–594.

[2] Grimes PE. Melasma: etioloģiskie un terapeitiskie apsvērumi. Arch Dermatol. 1995;131(12):1453–1457.

[3] Tods MM, Rallis TM, Gerwels JW u.c. 3 lāzeru un šķidrā slāpekļa salīdzinājums saules lentigīnu ārstēšanā: randomizēts, kontrolēts, salīdzinošs pētījums. Arch Dermatol. 2000;136(7):841–846.

[4] Kawalek AZ, Spencer JM, Phelps RG. Kombinēts eksimēra lāzers un lokāls takrolīms vitiligo ārstēšanai: izmēģinājuma pētījums. Dermatol Surg. 2004;30(2):130–135.

[5] Bastiaens M, Ter Huurne J, Gruis N u.c. Melanokortīna{1}}receptoru gēns ir galvenais vasaras raibuma gēns. Hum Mol Genet. 2001;10(16):1701–1708.

[6] Pillaiyar T, Manickam M, Jung SH. Melanoģenēzes pazemināšana: zāļu atklāšana un terapeitiskās iespējas. Narkotiku disks šodien. 2017;22(2):282–298.

[7] Hu ZM, Zhou Q, Lei TC u.c. Hidrohinona un tā glikozīdu atvasinājumu ietekme uz melanoģenēzi un antioksidāciju: biodrošība kā ādas balināšanas līdzekļi. J Dermatol Sci. 2009;55(3):179–184.

[8] Westerhof W, Kooyers T. Hidrohinons un tā analogi dermatoloģijā — potenciāls veselības apdraudējums. J Cosmet Dermatol. 2005;4(2):55–59.

[9] Picardo M, Carrera M. Jaunas un eksperimentālas hloazmas un citas hipomelanozes ārstēšanas metodes. Dermatol Clin. 2007;25(3):353–362.

[10] Shin JW, Park KC. Pašreizējā depigmentācijas līdzekļu klīniskā izmantošana. Dermatol Sin. 2014;32(4):205–210.

[11] Chaita E, Lambrinidis G, Cheimonidi C u.c. Grieķu augu anti-melanogēnās īpašības. Jauns depigmentācijas līdzeklis no Morus alba koka. Molekulas. 2017;22(4):1–14.

[12] Park SA, Park J, Park CI u.c. Dendropanax morbifera lapu ekstraktu šūnu antioksidanta aktivitāte un balinošā iedarbība. Microbiol Biotechnol Lett. 2013;41(4):407–415.

[13] Chatatikun M, Yamauchi T, Yamasaki K u.c. Croton roxburghii un Croton sublyratus lapu anti-melanogēnā iedarbība -MSH stimulētās B16F10 šūnās. J Tradit Complement Med. 2019;9(1):66–72.

[14] Lee SH, Choi SY, Kim H u.c. Mulberrosīds F, kas izolēts no Morus alba lapām, kavē melanīna biosintēzi. Biol Pharm Bull. 2002;25(8):1045–1048.

[15] Lim JY, Ishiguro K, Kubo I. Tirozināzi inhibējošā P-kumarskābe no žeņšeņa lapām. Phytother Res. 1999;13(5):371–375.

[16] Chanchal D, Swarnlata S. Jaunas pieejas augu izcelsmes kosmētikā. J Cosmet Dermatol. 2008;7(2):89–95.

[17] Ganesan P, Choi DK. Pašreizējais uz fitokompaundu bāzes veidoto nanokosmētikas līdzekļu pielietojums skaistuma un ādas terapijā. Int J Nanomedicine. 2016;11 (11):1987–2007.

[18] Takahashi M, Kitamoto D, Asikin Y u.c. Liposomas, kas iekapsulē Aloe vera lapu gēla ekstraktu, ievērojami uzlabo proliferāciju un kolagēna sintēzi cilvēka ādas šūnu līnijās. J Oleo Sci. 2009;58(12):643–650.

[19] Bose S, Du Y, Takhistov P u.c. Formulācijas optimizācija un kvercetīna lokāla piegāde no cietām lipīdu bāzes nanosistēmām. Int J Pharm. 2013;441(30):56–66.

[20] Ngan CL, Basri M, Tripathy M u.c. Fullerēnā integrētas nanoemulsijas iejaukšanās ādā strukturālā un kolagēna reģenerācijā pret ādas novecošanos. Eur J Pharm Sci. 2015;70(5):22–28.

[21] Mitri K, Shegokar R, Gohla S u.c. Lipīdu nanonesēji luteīna ievadīšanai caur ādu: sagatavošana, raksturojums, stabilitāte un veiktspēja. Int J Pharm. 2011; 414 (1–2): 267–275.

[22] Juškaitė V, Ramanauskienė K, Briedis V. Optimizētu mikroemulsiju izstrāde un formulēšana resveratrola dermālai piegādei. Evid Based Complement Alternatīvā Med. 2015;2015:1–10.

[23] Zhang M, Viennois E, Xu C u.c. Augu izcelsmes ēdamās nanodaļiņas kā jauna terapeitiska pieeja pret slimībām. Audu barjeras. 2016;4(2):1–9.

[24] Criton M, Le Mellay-Hamon V. N-hidroksi-N′-feniltiourīnvielas un N-hidroksi-N′-fenilurīnvielas analogi kā tirozināzes un melanīna veidošanās inhibitori. Bioorg Med Chem Lett. 2008;18 (12): 3607–3610.

[25] Kobayashi T, dzirdes VJ. Tieša tirozināzes mijiedarbība ar Tyrp1, veidojot heterodimērus kompleksus in vivo. J Cell Sci. 2007;120(24):4261–4268.

[26] D'Mello S, Finlay G, Baguley B u.c. Signalizācijas ceļi melanoģenēzē. Int J Mol Sci. 2016;17(7):1–18.

[27] Fang D, Tsuji Y, Setaluri V. Tirozināzes ģimenes gēna TYRP1 selektīva pazemināšana, inhibējot melanocītu transkripcijas faktora, MITF, aktivitāti. Nucleic Acids Res. 2002;30(14):3096–3106.

[28] Oh MJ, Hamid MA, Ngadiran S u.c. Ficus deltoidea (Mas cotek) ekstraktam bija anti-melanogēna aktivitāte, novēršot tirozināzes aktivitāti in vitro un nomācot tirozināzes gēna ekspresiju B16F1 melanomas šūnās. Arch Dermatol Res. 2011;303(3):161–170.

[29] Jang EJ, Shin Y, Park HJ u.c. Fitosfingozīna anti-melanogēnā aktivitāte, modulējot ar mikroftalmiju saistītā transkripcijas faktora signalizācijas ceļu. J Dermatol Sci. 2017;87(1):19–28.

[30] Toyofuku K, Wada I, Valencia JC u.c. 1. un 3. tipa acs albīnisms ir ER aiztures slimības: tirozināzes vai Tyrp1 mutācija var ietekmēt gan mutantu, gan savvaļas tipa proteīnu apstrādi. Faseb J. 2001;15:2149–2161.

[31] Xue L, Li Y, Zhao B u.c. TRP-2 veicina apmatojuma krāsas pigmentāciju aitas ādā. Mol Med Rep. 2018;17:5869–5877.

[32] Mu J, Zhuang X, Wang Q u.c. Starpsugu saziņa starp augu un peles zarnu saimniekšūnām, izmantojot ēdamas augu izcelsmes eksosomām līdzīgas nanodaļiņas. Mol Nutr Food Res. 2014;58(7):1561–1573.