Natalenamīdi A–C, cikliskie tripeptīdi no termītiem saistītā Actinomadura Sp. RB99

Abstract:

Pēdējos gados ir palielinājušies pētījumi par ar kukaiņiem saistīto baktēriju bioķīmiju. Apvienojot tos ar analītiskajiem dereplicēšanas procesiem, šie pētījumi nodrošina spēcīgu stratēģiju, lai identificētu strukturāli un/vai bioloģiski jaunus savienojumus. Ribosomāli nesintezētiem cikliskajiem peptīdiem ir plašs bioaktivitātes spektrs ar augstu medicīnisko potenciālu.

Šeit mēs ziņojam par trīs jaunu ciklisku tripeptīdu atklāšanu: natalenamīdi A–C (savienojumi 1–3). Šie savienojumi tika identificēti no sēnīšu audzēšanas termītiem saistītā Actinomadura sp. RB99, izmantojot uz šķidruma hromatogrāfiju (LC)/ultravioleto (UV)/masas spektrometriju (MS) balstītu replikācijas metodi. Jauno savienojumu (1–3) ķīmiskās struktūras tika noteiktas, analizējot visaptverošas spektroskopiskās metodes, tostarp viendimensijas (1H un 13C) un divdimensiju (1H-1H-COSY, HSQC, HMBC) kodolmagnētiskās. rezonanses spektroskopija (KMR) kopā ar augstas izšķirtspējas elektrosmidzināšanas jonizācijas masas spektrometrijas (HR-ESIMS) datiem. Jauno savienojumu absolūtās konfigurācijas tika noskaidrotas, izmantojot Marfeja analīzi. Veicot vairākus tripeptīdu bioaktivitātes testus, mēs atklājām, ka 3. savienojumam ir nozīmīga inhibējoša iedarbība uz 3-izobutil-1-metilksantīna (IBMX) izraisīto melanīna ražošanu. Savienojuma 3 iedarbība bija līdzīga kojskābes iedarbībai, ko plaši izmanto kā kosmētikas materiālu ar ādu balinošu efektu.

Taisna, gluda un maiga āda vienmēr ir bijis austrumu sieviešu mērķis. Ādas kopšanas līdzekļu balināšanas līdzekļu izpēte un izstrāde galvenokārt balstās uz tirozināzes aktivitātes kavēšanu.

Savienojumiem, kas satur benzola gredzenus vai fenola hidroksilgrupas, ir potenciāls balināšanas efekts, piemēram, pašlaik plaši izmantotais balināšanas līdzeklis arbutīns, kas var radīt balinošu efektu, inhibējot tirozināzes aktivitāti.

Un mēs atklājām, ka Cistanche deserticola ir balinošs efekts. Cistanche deserticola galvenā aktīvā viela, feniletanoīdu glikozīdi, ir sava veida dabisks glikozīdu savienojums. Pētījumos atklāts, ka feniletanoīdu glikozīdi var kavēt tirozināzes aktivitāti un melanīna veidošanos cilvēka epidermas melanocītos, kā arī tiem ir balinošs efekts. aģenta efektivitāte.

Click cistanche tubulosa ekstrakta pulveris

Atslēgvārdi:

sēņojošs termīts; Actinomadura sp.; tripeptīdi; natalenamīdi A–C; ādu balinoša iedarbība.

1. Ievads

Lauksaimniecības kukaiņu aizsargājošo baktēriju simbiontu ķīmiskā analīze pēdējos gados ir piesaistījusi lielu dabisko produktu ķīmiķu uzmanību [1–5]. Izmantojot vismodernākos kodolmagnētiskās rezonanses (KMR)/masas spektrometrijas (MS) dereplicēšanas procesus un ekoloģiski nozīmīgus biotestus, ir atklāts iespaidīgs daudzums strukturāli intriģējošu dabisko produktu, tostarp vairāki cikliskie peptīdi, kas nav sintezēti ribosomu ceļā. no mikrobu simbiontiem [6]. Visizcilākie piemēri ir pretsēnīšu dentigerumicīns, ciklisks depsipeptīds, kas izolēts no sēnīšu augšanas skudras, kas saistītas ar Pseudonocardia sp. [7] un gerumicīnus A–C, piperazīnskābi saturošus cikliskos depsipeptīdus, kas identificēti no Pseudonocardia sp. [8].

Ir pierādīts, ka cikliskie peptīdi uzrāda plašu bioloģisko aktivitāšu klāstu, veicinot vairākas sintētiskas pieejas šīm farmakoloģiski daudzsološajām struktūrām [9–12]. Pašlaik tiek tirgotas un plaši izmantotas klīniskā vidē vairāk nekā 40 ciklisko peptīdu zāles, un vidēji katru gadu tirgū nonāk aptuveni viena jauna ciklisko peptīdu zāles [13].

Kā daļu no mūsu pastāvīgajiem centieniem identificēt strukturāli jaunus un/vai bioaktīvus sekundāros metabolītus no termītiem saistītiem mikrobiem [14–17], mēs koncentrējāmies uz ar termītiem saistītajiem Actinomadura sp. RB99, izolēts no sēnīšu augoša termīta Macrotermes natalensis. Mūsu šķidruma hromatogrāfijas (LC)/ultravioletās (UV)/masas spektrometrijas (MS) dereplicēšanas stratēģija radīja potenciāli jaunus bioaktīvus dabiskos produktus. Šajā pētījumā mēs ziņojam par trīs jaunu ciklisko tripeptīdu, natalenamīda A–C (savienojumi 1–3, 1. attēls), izolāciju un ķīmisko identificēšanu, izmantojot uz LC/UV/MS balstītu dereplicācijas metodi, kā arī to bioloģiskos citotoksisko novērtējumu. , pretiekaisuma un ādas balināšanas aktivitātes.

2. Rezultāti un diskusija

2.1. Šķidruma hromatogrāfija (LC)/ultravioletā (UV)/masas spektrometrija (MS) balstīta savienojumu 1–3 izolācija

Actinomadura sp. RB99 tika izolēts no termītu darbinieka (M. natalensis) virsmas. Gandrīz pilnīgas 16S ribosomu ribonukleīnskābes (rRNS) secības filoģenētiskā analīze liecina, ka celms RB99 pieder pie Actinomadura ģints ar tuvāko kaimiņu Actinomadura nitritigenes NBRC 15918T. Turpmākā bagātināto kultūras ekstraktu analīze, kas balstīta uz LC/UV/MS, atklāja raksturīgu UV absorbciju kopumu ar unikāliem molekulāro jonu pīķiem, kas satur slāpekļa atomus.

Lai identificētu attiecīgos metabolītus un izpētītu to aktivitāti, tika veikta liela mēroga fermentācija, izmantojot optimizētus augšanas apstākļus (100 agara plates no 2 L ISP2 agara, pH 6, 10 dienas 30 ◦C temperatūrā) un noteikta apstrādes un priekšattīrīšanas procedūra. piemēro [17]. Sekojošā LC-UV/MS vadītā frakcionēšana un atkārtota daļēji preparatīva augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfija (HPLC) ļāva izolēt trīs metabolītus ar unikālu KMR/MS modeli. Mēs veicām augšanas un barotnes pētījumus, izmantojot dažādus sāļus (NaCl, KBr 1–3 procenti) un barotnes (ISP1-6 barotnes), lai atdarinātu dabisko vidi un stimulētu metabolītu veidošanos, kā rezultātā radās arī trīs jaunas vielas. metabolīti (skatīt Papildu attēlu S19).

2.2. Savienojumu strukturālā izskaidrošana

Natalenamīds A (1) tika iegūts kā amorfs pulveris. Molekulārā formula 1 tika noteikta kā C19H25N3O5 no nātrija pievienotā molekulārā jona pie m/z 398,1691 [M plus Na] plus (aprēķināts C19H25N3O5Na, 398,1692), izmantojot pozitīvas jonu režīma augstas izšķirtspējas elektrosmidzināšanas jonizāciju (masas spektrometrija). ESIMS) dati. Infrasarkanais (IR) spektrs uzrādīja spēcīgu absorbcijas joslu pie 1670 cm−1, kas liecina par amīdu grupu klātbūtni molekulā. Detalizētā 1. 1H NMR datu analīze (1. tabula) liecināja par tipiskiem peptīda skeleta signāliem, parādot divus metilsignālus (δH 0.91 (3H, d, J=7).{29 }} Hz, H-3) un 0.92 (3H, d, J=7.0 Hz, H-4)), trīs metilēna signāli (δH 1,95 (1H, m, H-7a), 2,27 (1H, m, H-8a), 2,36 (1H, m, H-8b), 2,48 (1H) , m, H{{50}}b), 2,97 (1H, dd, J=14.0, 8.0 Hz, H{{58} }a) un 3,20 (1H, dd, J=14.0, 5,0 Hz, H-12b)), četri metīna signāli (δH 2,02 (1H) , m, H-2), 4,16 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1), 4,20 (1H, dd, J=8,5, 4,5 Hz, H-6) un 4,63 (1H, dd, J=8.0, 5,0 Hz, H-11)) un pieci pārklāti aromātiskie protoni (δH 7,18 (1H, m, H-16), 7,23 (2H, m, H{100}}/18) un 7,24 (2H, m, H{105}}}/17)).

13C KMR spektrs (1. tabula), izmantojot HSQC un HMBC spektrus, kopā uzrādīja 19 oglekļa rezonanses, kas ir atbildīgas par diviem metilsignāliem (δC 18,9 un 19,9), trim metilēna signāliem (δC 27.0, 30.6 un 38.8), deviņi metīna signāli (δC 32.1, 55.6, 58.0, 60.4, 127.8, 129.5 (×2) un 130.6 (×2)), tostarp pieci aromātiskie oglekli, viens olefīna ogleklis signāls (δC 138,8) un četri karboniloglekļa signāli (δC 173,2, 173,3, 174,8 un 181,3). Apvienojumā ar iepriekš minētajiem spektroskopiskajiem datiem, detalizēta divdimensiju (2D) KMR pārbaude (1H-1H COSY, HSQC un HMBC eksperimenti) atklāja trīs aminoskābju klātbūtni 1: glutamāts (Glu), fenilalanīns ( Phe) un valīnu (Val) (2. attēls). Šo aminoskābju savienojamību noteica H-1/C-5 un C-19, H-11/C-10 un C{ HMBC korelācijas. {50}} un H-6/C-5 un C-10 (2. attēls).

Lai identificētu 1 absolūto konfigurāciju, tika izmantota Mārfeja metode, lai noteiktu -H daudzkārtņu (C-1, C-6 un C-11) stereoķīmiju. 1 un standarta aminoskābju (L/D-Glu, Phe un Val) skābes hidrolizāti tika atvasināti ar 1-fluoro-2,4-dinitrofenil-5-L-alanīnu. amīds (L-FDAA). Secīgi atvasinātais 1 un standarta aminoskābju maisījums tika analizēts ar LC/MS, lai pārbaudītu to aiztures laiku. Glu, Phe un Val daļu absolūtās konfigurācijas tika noteiktas kā L formas, pamatojoties uz L-FDAA atvasinājumu aiztures laiku 1, salīdzinot ar standarta aminoskābēm. Tādējādi 1 struktūra tika noskaidrota kā ciklisks tripeptīds, kas parādīts 1. attēlā.

Natalenamīds B (2) tika izolēts kā amorfs pulveris. Tā molekulārā formula (C20H27N3O5) tika izsecināta no ūdeņraža un nātrija pievienoto molekulāro jonu virsotnēm pie 390,2032 [M plus H] plus (aprēķināts C20H28N3O5, 390,2029) un 412,1849 [aprēķināts M plus N, attiecīgi C, 4, 08, 1H, 18, 0,5 H]. Salīdzinot ar 1 molekulāro formulu un KMR spektrālajiem datiem, savienojumam 2 peptīda skeletā bija papildu CH2 grupa. Visaptveroša viendimensijas (1D) (1H un 13C NMR) un 2D KMR (1H–1H COSY, TOCSY, HSQC un HMBC) spektra pārbaude atklāja trīs aminoskābju atlikumu esamību: Glu, Phe un Leu. (leicīns). Šo aminoskābju secība tika izveidota, pamatojoties uz H-1/C-6 un C-20, H-12/C-11 un C HMBC korelācijām. -20 un H-7/C-6 un C-11 (2. attēls). Lai noteiktu 2 absolūto konfigurāciju, tika veikta Glu, Phe un Leu atlieku atvasināšana ar L-FDAA un pēc tam analizēta ar LC/MS. LC/MS datos L-Glu, L-Phe un L-Leu tika atklāti, salīdzinot 2 L-FDAA atvasinājumu aiztures laikus ar standarta aminoskābēm. Tādējādi 2 ķīmiskā struktūra tika noteikta kā cikliskais tripeptīds, kas parādīts 1. attēlā.

Pozitīvā režīma HR-ESIMS dati par natalenamīdu C (3) uzrādīja ūdeņraža un nātrija pievienotos molekulāros jonus pie 424,1870 [M plus H] plus (aprēķināts C23H26N3O5, 424,1872) un 446,1694 (aprēķināts [M plus Na2N] plus 3 424.1692). Tas liecināja, ka tā molekulārā formula bija C23H25N3O5. Detalizēta 3 1D un 2D KMR spektru analīze liecināja, ka tā ķīmiskā struktūra bija līdzīga 2 ķīmiskajai struktūrai, izņemot to, ka Leu 3. vietā tika aizstāts ar Phe. Trīs identificēto aminoskābju savienojamība 3. tika pārbaudīta, izmantojot HMBC korelācijas. H-1/C-9 un C-23, H-15/C-14 un C-23, un H-10/ C-9 un C-14 (2. attēls). Piemērojot Marfeja metodi savienojumam 3, tika noskaidrots, ka -H daudzkārtņu (C-1, C-10 un C-15) absolūtās konfigurācijas ir viens L-Glu un divi L. -Phe daļas. Attiecīgi tika noteikta pilnīga 3 struktūra, kā parādīts 1. attēlā.

Natalenamīdi A–C ir tricikliskie peptīdi, kuru izcelsme, iespējams, nav ribosomāla. Pašlaik vairāki bioaktīvie cikliskie tripeptīdi ir raksturoti kā dabiski produkti: citotoksiskie 17-locekļi cikliskie tripeptīdi (piemēram, OF4949 I–IV), kas izolēti no Penicillium rugulose [18]; pretsēnīšu sklerotomijas A−K, kas identificētas no halotolerantu baktēriju fermentācijas buljona [10]; un antiproliferatīvā psihrofilā E, kas izolēta no divu jūras aļģu Aspergillus ģints sēņu celmu jauktas kultūras [19].

2.3. Savienojumu bioloģiskās aktivitātes 1-3

Tā kā ir ziņots, ka cikliskie peptīdi uzrāda plašu bioloģisko aktivitāšu klāstu, izolēto ciklisko tripeptīdu ({{0}}) bioloģiskā ietekme tika novērtēta, izmantojot trīs bioaktivitātes. Savienojumu 1-3 citotoksicitāte tika pētīta pret četrām vēža šūnu līnijām (MCE7 krūts vēža šūnām, HeLa dzemdes kakla vēža šūnām, A549 cilvēka plaušu vēža šūnām un HepG2 aknu vēža šūnām) dažādās koncentrācijās (0, 6,25). , 12,5, 25, 50 un 100 uM). 1. savienojums neietekmēja MCF-7, HeLa vai A549 šūnu dzīvotspēju. Tomēr HepG2 šūnu apstrāde ar 100 M savienojuma 1 samazināja šūnu dzīvotspēju līdz 78,5 plus 3,2 procentiem (3. attēls). 2. savienojums samazināja HeLa un A549 šūnu dzīvotspēju līdz 82.9  2.1 procentiem un 73.5=3.0 procentiem , bet neietekmēja MCF-7 vai MCF dzīvotspēju. HepG2 šūnas (3. attēls). 3. savienojums neietekmēja nevienas šūnu līnijas dzīvotspēju (3. attēls).

Pēc tam tika izmantoti RAW264.7 makrofāgi, lai izpētītu izolēto savienojumu pretiekaisuma iedarbību. Lai novērstu kļūdas NO ražošanā, ko izraisa mainīgie šūnu izdzīvošanas rādītāji, tika pārbaudītas katra savienojuma netoksiskās koncentrācijas. Kā parādīts 4. attēlā, savienojumiem 1–3 bija maz citotoksiskas iedarbības RAW264.7 šūnās (4.A–C attēls), un tiem nebija inhibējošas ietekmes uz NO veidošanos lipopolisaharīdu (LPS) stimulētās RAW264.7 šūnās (4.D–F attēls). .

Savienojumu 1–3 inhibējošā iedarbība uz melanīna saturu B16F10 šūnās tika pārbaudīta kā pierādījums to ādu balinošajām aktivitātēm (5. attēls). Tā kā izmaiņas šūnu dzīvotspējā izraisa kļūdas melanīna ražošanā un mērīšanā, mēs vispirms pārbaudījām savienojumu 1–3 ietekmi uz B16F10 šūnu izdzīvošanu. Savienojumiem 1–3 nebija citotoksiskas iedarbības B16F10 šūnās nevienā no izmantotajām koncentrācijām (5.A–C attēls). Pēc tam mēs novērtējām savienojumu inhibējošo ietekmi uz 3-izobutil-1-metilksantīna (IBMX) izraisīto melanīna ražošanu B16F10 šūnās (5.D–F attēls). IBMX, labi zināms melanoģenēzes stimulators, izraisa ievērojamu melanīna ražošanas pieaugumu pēc vienas ārstēšanas melanomas šūnās. No novērtētajiem savienojumiem 3. savienojumam (pie 5–100 µM) bija nozīmīga inhibējoša ietekme uz IBMX mediēto melanīna sintēzi atkarībā no devas. Kojskābe, mūsu pozitīvā kontrole, ir plaši izmantota kā kosmētikas materiāls ar ādu balinošu efektu [20]. Savienojuma 3 inhibējošā iedarbība uz IBMX izraisīto melanīna ražošanu bija līdzīga kojskābes iedarbībai (5.F attēls), kas liecina, ka savienojums 3 darbojas kā spēcīgs IBMX izraisītas melanīna ražošanas inhibitors B16F10 melanomas šūnās.

Turklāt savienojums 3 bija piesārņots ar nelielu skaitu piemaisījumu, kas tika noteikti kā taukskābju analogi, interpretējot NMR spektroskopiskos datus un LC / MS analīzi (papildu materiāli, S11–S15 un S23 attēli). Lai identificētu piemaisījumu aktivitāti, tika veikti papildu eksperimenti ar taukskābju analogiem, lai noskaidrotu to inhibējošo ietekmi uz IBMX izraisīto melanīna ražošanu B16F10 šūnās, kas atklāja, ka pārbaudītajiem savienojumiem nebija balināšanas efekta (papildu materiāli, S24 attēls). Tādējādi, lai gan mēs nevaram izslēgt, ka piemaisījumi savienojumā 3 ir atbildīgi par inhibējošo ietekmi uz IBMX izraisīto melanīna ražošanu, tas šķiet maz ticams.

3. Materiāli un metodes

3.1. Vispārējās eksperimentālās procedūras

Infrasarkanie spektri tika iegūti ar Bruker IFS-66/S FT-IR (Bruker, Billerica, MA, ASV) spektrometru. Elektrosmidzināšanas jonizācijas un HR-ESIMS spektri tika mērīti ar SI-2/LCQ DecaXP šķidruma hromatogrāfijas (LC)-masas spektrometru (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV). KMR spektri, tostarp 1H–1H COSY, HSQC un HMBC eksperimenti, tika veikti, izmantojot Varian UNITY INOVA 800 NMR spektrometru (Varian, Palo Alto, CA, ASV), kas darbojās 800 MHz (1H) un 200 MHz (13C), ar ķīmiskās nobīdes izteiktas ppm (δ). Sagatavošanas HPLC izmantoja Waters 1525 bināro HPLC sūkni ar Waters 996 fotodiožu masīva detektoru (Waters Corporation, Milford, CT, ASV). Kolonnu hromatogrāfijai tika izmantots silikagels 60 (230–400 acs, Merck, Kenilworth, NJ, ASV) un silikagels RP-C18 (230–400 acs, Merck). Puspreparatīvajā HPLC tika izmantota Shimadzu Prominence HPLC sistēma ar SPD{ {22}}A/20AV Series Prominence HPLC ultravioletā starojuma (UV-Vis) detektori (Shimadzu, Tokija, Japāna). LC/MS analīzes tika veiktas ar Agilent 1200 Series HPLC sistēmu (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ASV), kas aprīkots ar diožu matricas detektoru un 6130. sērijas ESI masas spektrometru ar analītisko Kinetex (4,6 × 100 mm, 3,5 µm). Plānām plāksnēm tika izmantotas Merck iepriekš pārklātas silikagela F254 plāksnes un RP-18 F254s plāksnes. -slāņu hromatogrāfija (TLC) Plankumi tika atklāti TLC UV gaismā vai karsējot pēc izsmidzināšanas ar anīsaldehīda-sērskābes šķīdumu.

3.2. Mikrobu materiāls

Actinomadura sp. RB99 tika izolēts no M. natalensis ģints termītu darbinieka virsmas (kolonija Mn103, GPS S25 43 45.9 E28 14 08.9) 2. janvārī{ {13}}10. Biomateriāls tika ievietots tīros plastmasas maisiņos un apstrādāts vienas dienas laikā pēc savākšanas. Termīti tika mazgāti sterilā dejonizētā ūdenī, un baktērijas tika izolētas, pārklājot iegūtās suspensijas uz barotnes ar zemu uzturvielu saturu ar hitīnu (litrā: 4 g hitīna, 0,7 g K2HPO4, 0,3 g). KH2PO4, 0,5 g MgSO4·5H2O, 0,01 g FeSO4·7H2O, 0,001 g ZnSO4, 0,001 g MnCl2 un 20 g agara) [21]. Izolāti ar aktinobaktērijām līdzīgu morfoloģiju tika pārnesti uz ISP2 agaru (litrā: 10 g iesala ekstrakta, 4 g rauga ekstrakta, 4 g glikozes un 20 g agara) un subkultivēja, līdz tika iegūti tīri izolāti.

3.3. DNS ekstrakcija un polimerāzes ķēdes reakcijas pastiprināšana

Actinomadura sp. RB99 tika audzēts ar barības vielām bagātā šķidrā barotnē ISP2 piecas līdz septiņas dienas 30 ◦C temperatūrā. Šūnas tika novāktas un genoma DNS tika ekstrahēta, izmantojot GenJet genoma DNS attīrīšanas komplektu (#K0721, Thermo Scientific, Waltham, MA, ASV), ievērojot ražotāja norādījumus ar šādām izmaiņām: (a) lizocīma apstrāde tika pagarināta līdz 40 minūtēm un b ) ārstēšana ar proteināzi K tika pagarināta līdz 40 minūtēm. DNS kvantitatīvi noteica fotometriski, izmantojot Nanodrop Lite spektrometru (Thermo Scientific).

Filoģenētiskajiem pētījumiem 16S rRNS gēns tika pastiprināts, izmantojot primeru komplektu 1492R/27F. Katra amplifikācijas reakcija tika sagatavota 25 µL gala reakcijas tilpumā, kas satur 7,25 µL destilēta ūdens, 5 µL HF buferšķīduma, 5 µL katra praimera (2,5 µM), {{10}}, 5 µL dNTP. (10 µM), 0,25 µL Phusion High-Fidelity DNS polimerāzes (New England Biolabs, Ipswich, MA, ASV) un 2 µL ekstrahētas DNS (veidnes). Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) tika veikta šādos apstākļos: 98 ◦C 38 s; 32 cikli 98 ◦ 30 s, 52 ◦ C 45 s, 72 ◦ C 1 min 20 s; un galīgais pagarinājums 72 ◦C uz 8 minūtēm. PCR produkts tika vizualizēts ar agarozes gēla elektroforēzi, un PCR reakcijas tika attīrītas, izmantojot PCR attīrīšanas komplektu (Thermo Scientific). DNS fragmenti tika sekvencēti GATC (Konstanca, Vācija).

3.4. Secība un sugu identifikācija

Secības tika novērtētas attiecībā uz tīrību un neatbilstībām, izmantojot BioEdit [22]. Katram celmam iegūtās tiešās un apgrieztās secības tika saliktas ar BioEdit un pārbaudītas, vai nav himēras, izmantojot DECIPHER (//decipher.cee.wisc.edu/FindChimerasOutputs.html). Iegūtās sekvences tika deponētas GenBank (piekļuves numurs: KY558684). Blast analīzes ar gandrīz pilnām 16S rRNS sekvencēm (1368 bp) tika veiktas, izmantojot Nacionālā biotehnoloģijas informācijas centra (NCBI) datubāzi (atsauces RNS sekvences). Rezultāti liecināja, ka celms RB99 ir Actinomadura ģints loceklis. Pirmo 10 trāpījumu secības tika lejupielādētas no NCBI datu bāzes un saskaņotas ar Actinomadura sp. 16S rRNS secību. RB99, izmantojot Sina secību izlīdzināšanas pakalpojumu [23]. Izmantojot MEGA programmatūras versiju 7.0.26 [24–26], tika rekonstruēti divi dažādi filoģenētiski koki ar kaimiņu savienošanas vai maksimālās varbūtības algoritmiem. Tamura un Nei evolūcijas attāluma modelis tika izmantots, lai ģenerētu evolūcijas attāluma matricas maksimālās iespējamības un kaimiņu savienošanas algoritmiem, dzēšot pilnīgas nepilnības un trūkstošos datus [27]. Maksimālās varbūtības algoritmam tika izmantots diskrēts gamma sadalījums (plus G), un ātruma variācijas modelis ļāva dažām vietnēm būt evolucionāri nemainīgām (plus I). Kaimiņu savienošanas algoritmam ātruma atšķirības starp vietnēm tika modelētas ar gamma sadalījumu ( plus G). Mezglu ticamības vērtības tika novērtētas, izmantojot sāknēšanas analīzi, pamatojoties uz 1000 atkārtotas atlases soļiem [28].

3.5. Ekstrakcija un izolācija

Actinomadura sp. RB99 tika audzēts 50 ml ISP2 buljonā septiņas dienas 30 ◦C (iepriekškultūra) un izmantots, lai inokulētu 100 ISP2 agara plates. Plāksnes inkubēja 10 dienas 30 ◦C temperatūrā, sagriež mazos gabaliņos, konsolidēja un uz nakti iegremdēja MeOH. MeOH fāzi filtrēja un iztvaicē pazeminātā spiedienā. MeOH ekstrakts (20 g) tika izšķīdināts destilētā ūdenī (700 ml) un pēc tam trīs reizes sadalīts ar šķīdinātāju ar EtOAc (700 ml), iegūstot 1,1 g atlikuma. EtOAc šķīstošā frakcija (1,1 g) no MeOH ekstrakta tika ievietota silikagela (230–400 acu) kolonnā hromatogrāfijai un eluēja ar gradienta šķīdinātāju sistēmu CH2Cl2-MeOH (100:1 līdz 1: 1, v/v). Tas nodrošināja sešas frakcijas (A–F), kuras tika pakļautas LC-UV/MS analīzei. Dereplikācijas analīze, izmantojot iekšēju UV spektrālo bibliotēku, liecināja par nelielu peptīdu analogu esamību frakcijā E. Tie parādīja vienkāršu UV modeli pie aptuveni 220 nm un unikālas molekulārās formulas jonu virsotnes, kas satur slāpekļa atomus. Polārā frakcija E (233 mg) tika frakcionēta ar preparatīvu apgrieztās fāzes HPLC (Phenomenex Luna C18, 250 × 21,2 mm id, 5 µm, Torrance, CA, ASV), izmantojot CH3CN/H2O (1:9 līdz 9:1, v. /v, gradienta sistēma, plūsmas ātrums: 5 ml/min), lai iegūtu piecas apakšfrakcijas (E1–E5). Apakšfrakcija E2 (27 mg) tika attīrīta ar daļēji preparatīvu apgrieztās fāzes HPLC (Phenomenex Luna C18, 250 × 10,0 mm id, 5 µm) ar 33% MeOH/H2O (izokratiskā sistēma, plūsmas ātrums: 2 ml/min). ), lai iegūtu savienojumu 1 (5,8 mg, tR=57,0 min). Savienojumi 2 (1,6 mg, tR=42,0 min) un 3 (1,5 mg, tR=55,0 min) tika izolēti no apakšfrakcijas E3 (15 mg) ar daļēji preparāta apgrieztās fāzes palīdzību. HPLC, eluējot 43 procentus MeOH/H2O (izokratiskā sistēma, plūsmas ātrums: 2 ml/min).

3.5.1. Natalenamīds A (1)

3.5.2. Natalenamīds B (2)

3.5.3. Natalenamīds C (3)

3.6. 1.–3. savienojumu skābes hidrolīze

Kopējais daudzums 0,4 mg katra savienojuma (1–3) tika hidrolizēts ar 6 N HCl (500 µL) 1 stundu 110 ◦C temperatūrā. Pēc atdzesēšanas līdz istabas temperatūrai 1–3 hidrolizāti tika iztvaicēti, lai noņemtu HCl pēdas. Destilēts ūdens (500 µL) tika pievienots hidrolizāta maisījumiem un pēc tam iztvaicēts, lai noņemtu HCl pēdas; šī procedūra tika veikta trīs reizes.

3.7. Aminoskābju absolūtās konfigurācijas noteikšana 1.–3

Hidrolizātu maisījumi (1–3), kā arī standarta aminoskābes (L/D-Leu, Glu, Phe un Val) tika izšķīdināti 1 N NaHCO3 (100 µL) un pēc tam apstrādāti. ar 50 µL L-FDAA (10 mg/ml acetonā). Pēc tam katrs hidrolizāts tika karsēts 10 minūtes 80 ◦ C temperatūrā. Katrs maisījums tika dzēsts ar 2 N HCl (50 µL) un koncentrēts vakuumā. Atlikums tika izšķīdināts 300 µl MeOH. Katra alikvota daļa (5 µL), kas iegūta no hidrolizātu maisījumiem, tika tieši injicēta LC/MS (Phenomenex Luna C18, 4,6 × 100 mm, 3,5 µm, plūsmas ātrums 0,3 ml/min) un pilna skenēšana pozitīvā un negatīvā. jonu režīmi (skenēšanas diapazons no m/z 100 līdz 1000) tika izmantoti, lai noteiktu L-FDAA atvasināto aminoskābju aiztures laikus.

Kustīgā fāze, kas sastāv no skudrskābes destilētā ūdenī ({{0}},1 % v/v) (A) un acetonitrila (B), tika pārnesta ar gradienta šķīdinātāju sistēmu šādi: 20–40 procenti (B) 10 minūtes, 100 procenti (B) izokrātiski 5 minūtes un pēc tam 20 procenti (B) izokrātiski 5 minūtes, lai veiktu kolonnas mazgāšanas procedūru pēc palaišanas. L-FDAA atvasināto aminoskābju aiztures laiki, kas tika izmantoti kā standarti, bija 16,7 min (L-Glu, m/z 400 [M plus H] plus ), 18,2 min (D-Glu, m/z 400 [M plus H]). plus ), 22,1 min (L-Val, m/z 370 [M plus H] plus ), 25,1 min (D-Val, m/z 370 [M plus H] plus ), 25,6 min (L-Phe, m/ z 418 [M plus H] plus ), 27,0 min (D-Phe, m/z 418 [M plus H] plus ), 25,5 min (L-Leu, m/z 384 [M plus H] plus ) un 28,2 min (D-Leu, m/z 384 [M plus H] plus ). Atvasināto hidrolizātu aiztures laiki 1–3 bija L-Glu (16,9 min), L-Phe (25,7 min) un L-Val (22,5 min) no 1; L-Glu (16,7 min), L-Phe (25,7 min) un L-Leu (25,6 min) no 2; un L-Glu (16,9 min) un L-Phe (25,7 min) no 3.

3.8. Citotoksiskie testi, izmantojot vēža šūnas

MCF7, HeLa un A549 šūnas tika iegādātas no American Type Culture Collection (Rokvila, MD, ASV). HepG2 šūnas tika iegādātas no Korean Cell Line Bank (Seula, Koreja). MCF7 šūnas tika kultivētas Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 barotnē, kas papildināta ar 10 procentiem liellopu augļa seruma. HeLa un A549 šūnas tika kultivētas Dulbecco minimālajā būtiskajā barotnē (DMEM, Cellgro, Manassas, VA, ASV), kas papildināta ar 10 procentiem liellopu augļa seruma. HepG2 šūnas tika kultivētas Minimum Essential Medium, kas papildināts ar 10 procentiem liellopu augļa seruma. Kultivēšanas apstākļi tika uzturēti 37 ◦C mitrinātā atmosfērā, kas satur 5 procentus CO2. Citotoksicitāte tika pārbaudīta uz šīm četrām cilvēka šūnu līnijām (MCF7, HeLa, A549 un HepG2), izmantojot EZ-CyTox šūnu dzīvotspējas testa komplektu (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japāna). Īsumā, 5 × 103 šūnas iedobē tika iesētas 96-iedobju plāksnēs. Pēc 24 stundām šūnas tika apstrādātas ar savienojumiem norādītajās koncentrācijās. Pēc 72 stundu inkubācijas tika izmantots EZ-CyTox šūnu dzīvotspējas testa komplekts. Pēc 2 h inkubācijas absorbcija tika mērīta pie 450 nm ar atsauci pie 620 nm. Šūnu dzīvotspēja tika aprēķināta procentos no kontroles.

3.9. Pretiekaisuma darbība

Peļu makrofāgu RAW264.7 šūnu līnija tika iegādāta no American Type Culture Collection. Šūnas tika kultivētas DMEM, kas papildināts ar 10 procentiem liellopu augļa serumu (FBS), 100 vienības/ml penicilīna un 100 µg/ml streptomicīna, un inkubēja 37 ◦C mitrinātā atmosfērā ar 5 procentiem CO2. Šūnu dzīvotspēja tika mērīta, izmantojot Ez-Cytox šūnu dzīvotspējas noteikšanas komplektu. Šūnas tika inkubētas 96-iedobju plāksnēs ar koncentrāciju 2500 šūnu katrā iedobē 24 stundas un apstrādātas ar norādītajām 1.–3. savienojumu koncentrācijām 24 stundas. Pēc tam katrā iedobē tika pievienoti Ez-Cytox reaģenti. Optiskais blīvums pie 450 nm tika mērīts pēc 1 stundas, izmantojot mikroplašu lasītāju (PowerWave XS; Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, ASV), lai novērtētu šūnu dzīvotspēju. Atsevišķā eksperimentā RAW264.7 šūnas tika inkubētas 96-iedobju plāksnēs ar koncentrāciju 30,000 šūnas vienā iedobē 24 stundas. Pēc seruma badošanās 12 stundas šūnas tika iepriekš apstrādātas ar savienojumiem 1–3 1 stundu un pēc tam stimulētas ar 1 µg / ml LPS 24 stundas. Barotnes absorbcija Griesa reakcijā tika mērīta pie 540 nm, izmantojot PowerWave XS mikroplašu lasītāju, lai novērtētu NO līmeni.

3.10. Melanīna satura mērīšana

Peļu melanomas šūnu līnija B16F10 tika iegādāta no Amerikas tipa kultūras kolekcijas. Šūnas tika kultivētas DMEM, kas papildināts ar 10 procentiem FBS, 100 vienībām/ml penicilīna un 100 µg/ml streptomicīna, un inkubēja 37 ◦C mitrinātā atmosfērā ar 5 procentiem CO2. B16F10 šūnas 24 stundas inkubēja 6 cm kultivēšanas trauciņos pie 250,{12}} šūnas vienā iedobē DMEM, kas papildināts ar 10% FBS, 100 µg/ml streptomicīna un 100 V/mL penicilīna. Šūnas divas reizes nomazgāja ar fosfātu buferšķīdumu (PBS) un pēc tam stimulēja ar IBMX un inkubēja ar dažādām koncentrācijām 1.–3. savienojumu vai kojskābi (pozitīvā kontrole) RPMI barotnē, kas nesatur fenola sarkanu, un kas papildināta ar 10 procentiem FBS, 100 vienības. /mL penicilīna un 100 µg/ml streptomicīna 24 stundas un 48 stundas. Barotnes absorbcija tika mērīta pie 405 nm, izmantojot PowerWave XS mikroplašu lasītāju, lai novērtētu melanīna saturu. Rezultāti tiek izteikti kā izmaiņas, salīdzinot ar kontroli (šūnas, kuras nestimulē IBMX).

3.11. Statistiskā analīze

Visi dati, tostarp šūnu dzīvotspēja, NO un melanīna ražošana, tika parādīti kā vidējā vērtība un standarta novirze (SD). Visas pārbaudes tika veiktas trīs eksemplāros un tika atkārtotas vismaz trīs reizes. Šajā pētījumā tika iekļauti tikai daži katra šūnu eksperimenta atkārtojumu skaitļi, tāpēc statistiskajai analīzei tika izmantota neparametriskā analīzes metode. Katra mainīgā lieluma statistiskai analīzei tika izmantots Kruskall-Wallis tests. Visām analīzēm tika izmantota SPSS statistikas pakotne (International Business Machines Corporation (IBM) SPSS statistikas versija 21, Bostona, MA, ASV). Statistiskā nozīmība tika uzskatīta par p-vērtību, kas ir zemāka par 0.05.

4. Secinājumi

Mūsu ziņojumā ir sniegta sēnīšu augšanas termīta mikrobu izolātu ķīmiskā analīze. Trīs jauni cikliskie tripeptīdi, natalenamīdi A–C (1–3), tika izolēti un strukturāli raksturoti no sēnīšu audzēšanas termītiem saistītā Actinomadura sp. RB99, izmantojot uz LC-UV/MS balstītu dereplicēšanas metodi. Visi izolētie savienojumi tika novērtēti attiecībā uz bioloģisko aktivitāti, izmantojot šūnu testus. 1. un 2. savienojumiem bija vāja citotoksicitāte attiecīgi pret HepG2 un HeLa/A549 šūnām. Nevienam no izolētajiem savienojumiem nebija būtiskas inhibējošas ietekmes uz NO veidošanos LPS stimulētajās RAW264.7 šūnās. Savienojumam 3 bija nozīmīga inhibējoša iedarbība uz IBMX mediēto melanīna sintēzi atkarībā no devas. Iedarbība bija līdzīga kojskābei, ko izmanto kā kosmētisko materiālu ar ādu balinošu efektu.

Pateicības:

Mēs esam ļoti pateicīgi Maiklam Tomasam-Poulsenam (Kopenhāgenas Universitātes Bioloģijas katedra, Dānija) par atbalstu mūsu lauka darbiem.

Interešu konflikti:

Autori paziņo, ka nav interešu konflikta.

Atsauces

1. Ņūmens, dīdžejs; Cragg, GM Dabiskie produkti kā jaunu zāļu avoti no 1981. līdz 2014. gadam. J. Nat. Prod. 2016, 79, 629–661. [CrossRef] [PubMed]

2. Mišra, BB; Tiwari, VK Natural products: mainīga loma turpmākajā narkotiku atklāšanā. Eiro. J. Med. Chem. 2011, 46, 4769–4807. [CrossRef] [PubMed]

3. Bēmelmans, C.; Guo, H.; Rišers, M.; Poulsen, M. Dabiski produkti no mikrobiem, kas saistīti ar kukaiņiem. Beilstein J. Org. Chem. 2016, 12, 314–327. [CrossRef] [PubMed]

4. Ramadhar, TR; Bēmelmans, C.; Karijs, CR; Clardy, J. Baktēriju simbionti lauksaimniecības sistēmās nodrošina stratēģisku avotu antibiotiku atklāšanai. J. Antibiots. 2014, 67., 53.–58. [CrossRef] [PubMed]

5. Hārvijs, AL; Edrada-Ebel, R.; Quinn, RJ Dabisku produktu atkārtota parādīšanās zāļu atklāšanai genomikas laikmetā. Nat. Drug Discov. 2015, 14, 111–129. [CrossRef] [PubMed]

6. Sattely, ES; Fišbahs, MA; Walsh, CT Kopējā biosintēze: poliketīdu un neribosomālo peptīdu ceļu atjaunošana in vitro. Nat. Prod. Rep. 2008, 25, 757–793. [CrossRef] [PubMed]

7. Ak, D.; Skots, Dž. Karijs, CR; Clardy, J. Mycangimycin, poliēna peroksīds no savstarpēja Streptomyces sp. Org. Lett. 2009, 11, 633–636. [CrossRef] [PubMed]

8. Sēdēt, CS; Ruzzini, AC; Van Arnam, EB; Ramadhar, TR; Karijs, CR; Clardy, J. Mainīgās ģenētiskās arhitektūras rada praktiski identiskas molekulas sēnīšu augošo skudru baktēriju simbiontos. Proc. Natl. Akad. Sci. ASV 2015, 112, 13150–13154. [CrossRef] [PubMed]

9. Zems, KE; Lērs, S.; Čens, KJ; Kempbels, RL; Hikijs, JL; Tans, J.; Skallija, CCG; Deiviss, RL; Judins, AK; Zaretsky, S. Kalpaīna inhibitoru racionāla konstrukcija, pamatojoties uz kalpastatīna peptidomimētiku. J. Med. Chem. 2016, 59, 5403–5415. [CrossRef] [PubMed]

10. Džens, Dž.; Sju, Z.; Van, Y.; Hons, K.; Liu, P.; Zhu, W. Cikliski tripeptīdi no halotolerantās sēnītes Aspergillus sclerotiorum PT06-1. J. Nat. Prod. 2010, 73, 1133–1137. [CrossRef] [PubMed]

11. Weerakkody, D.; Mošņikova, A.; El-Sajeda, NS; Adochite, RC; Sleibaugs, G.; Golijaņins, J.; Tivari, RK; Andrejevs, OA; Parangs, K.; Reshetnyak, YK Jauni pH jutīgi cikliskie peptīdi. Sci. Rep. 2016, 6, 31322. [CrossRef] [PubMed]

12. Džao, M.; Lin, HC; Tang, Y. Biosintēze -nitro saturošu ciklisko tripeptīdu psychrophilic. J. Antibiots. 2016, 69, 571–573. [CrossRef] [PubMed]

13. Zorži, A.; Deils, K.; Heinis, C. Ciklisko peptīdu terapija: pagātne, tagadne un nākotne. Curr. Atzinums. Chem. Biol. 2017, 38., 24.–29. [CrossRef] [PubMed]

14. Kima, KH; Ramadhar, TR; Bēmelmans, C.; Cao, S.; Polsens, M.; Karijs, CR; Clardy, J. Natalamicīns A, ansamicīns no ar termītiem saistīta Streptomyces sp. Chem. Sci. 2014, 5, 4333–4338. [CrossRef] [PubMed]

15. Kangs, HR; Lī, D.; Bendorfs, R.; Jungs, WH; Bēmelmans, C.; Kangs, KS; Kim, KH Termisoflavoni A–C, izoflavonoīdu glikozīdi no termītiem saistītiem Streptomyces sp. RB1. J. Nat. Prod. 2016, 79, 3072–3078. [CrossRef] [PubMed]

16. Bēmelmans, C.; Ramadhar, TR; Kims, KH; Klāsens, JL; Cao, S.; Wyche, TP; Hou, Y.; Polsens, M.; Bugni, TS; Karijs, CR; un citi. Makrotermicīni A–D, glikozilēti makrolaktāmi no ar termītiem saistīta Amycolatopsis sp. M39. Org. Lett. 2017, 19, 1000–1003. [CrossRef] [PubMed]

17. Guo, H.; Bendorfs, R.; Leihnics, D.; Klāsens, JL; Volmers, J.; Gērls, H.; Šteinakers, M.; Veigels, C.; Dahse, HM; Kasters, AK; de Beer, ZW; un citi. Rubterolonu A–F izolēšana, biosintēze un ķīmiskās modifikācijas: Reti tropolonu alkaloīdi no Actinomadura sp. 5–2. Chem. Eiro. J. 2017, 23, 9338–9345. [CrossRef] [PubMed]

18. Sano, S.; Ikai, K.; Katajama, K.; Takesako, K.; Nakamura, T.; Obajaši, A.; Ezure, Y.; Enomoto, H. OF4949, jauni aminopeptidāzes B inhibitori. II. Struktūras noskaidrošana. J. Antibiots. 1986, 39, 1685–1696. [CrossRef] [PubMed]

19. Ciasullo, L.; Kasapulo, A.; Katinjāno, A.; Bifulko, G.; Debits, C.; Hūpers, Dž.; Gomess-Paloma, L.; Riccio, R. Renieramide, ciklisks tripeptīds no Vanuatu sūkļa Reniera n. sp. J. Nat. Prod. 2002, 65, 407–410. [CrossRef] [PubMed]

20. Solano, F.; Briganti, S.; Pikardo, M.; Ghanem, GH hipopigmentējošie līdzekļi: atjaunināts pārskats par bioloģiskajiem, ķīmiskajiem un klīniskajiem aspektiem. Cūka. Cell Melanoma Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]

21. Vissers, AA; Nobre, T.; Karijs, CR; Ānens, DK; Poulsen, M. Aktinobaktēriju kā aizsardzības simbiontu potenciāla izpēte sēnīšu audzēšanas termītos. Microb. Ecol. 2012, 63, 975–985. [CrossRef] [PubMed]

22. Hall, TA BioEdit: lietotājam draudzīgs bioloģisko secību izlīdzināšanas redaktors un analīzes programma operētājsistēmai Windows 95/98/NT. Nukleīnskābju simptoms. Ser. 1999, 41, 95–98.

23. Prūss, E.; Peplijs, J.; Glöckner, FO SINA: Precīza augstas caurlaidības ribosomu RNS gēnu vairāku secību saskaņošana. Bioinformātika 2012, 28, 1823–1829. [CrossRef] [PubMed].

24. Saitou, N.; Nei, M. Kaimiņu savienošanas metode: jauna filoģenētisko koku rekonstrukcijas metode. Mol. Biol. Evol. 1987, 4, 406–425. [PubMed]

25. Felsenstein, J. Evolūcijas koki no DNS sekvencēm: maksimālās iespējamības pieeja. J. Mol. Evol. 1981, 17, 368–376. [CrossRef] [PubMed]

26. Kumar, S.; Štečers, G.; Tamura, K. MEGA7: Molekulārās evolūcijas ģenētikas analīzes versija 7.0 lielākām datu kopām. Mol. Biol. Evol. 2016, 33, 1870–1874. [CrossRef] [PubMed]

28. Tamura, K.; Nei, M. Nukleotīdu aizvietojumu skaita novērtējums mitohondriju DNS kontroles reģionā cilvēkiem un šimpanzēm. Mol. Biol. Evol. 1993, 10, 512–526. [PubMed]

28. Felsenstein, J. Pārliecības robežas par filoģenēzi: pieeja, izmantojot bootstrap. Evolution 1985, 39, 783–791. [CrossRef] [PubMed]

Parauga pieejamība:

Savienojumu paraugi no autoriem nav pieejami.

For more information:1950477648nn@gmail.com