Kā novērst un samazināt nierakmeņu veidošanos?

lai iegūtu plašāku informāciju:ali.ma@wecistanche.com

Ⅰ Ⅱ daļa: Fosfatidilserīna eversija, ko regulē fosfolipīdu skramblāze, ko aktivizē TGF-1/Smad signalizācija agrīnā nierakmeņu veidošanās stadijā

Xiu Guo Gan1 · Hai Tao Xu1 · Zhi Hao Wang

lai iegūtu plašāku informāciju:ali.ma@wecistanche.com

Ievads

Urolitiāze ir viena no visbiežāk sastopamajām slimībām, kas skar cilvēkus, un tā ir saistīta ar vairākām uroloģiskām komplikācijām [1]. Tiek ziņots, ka kalcija oksalāts (CaOx) bojā kultivētas nieru kanāliņu šūnas, pēc tam šūnu membrānas fosfatidilserīns (PS) in vitro pārceļas no iekšējā slāņa uz ārējo slāni, lai spēlētu svarīgu lomunierakmensveidošanās [2]. Par līdzīgiem atklājumiem ziņots dažādos pētījumos [3-6], kas veikti šūnu līmenī. Tomēr mehānisms, kas ir pamatā PS eksternalizācijai nieru kanāliņu šūnās, ko izraisa CaOx izraisīti bojājumi, joprojām nav skaidrs. Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka augsta kalcija oksalāta koncentrācija izraisa reaktīvo skābekļa sugu (ROS)[7] pārprodukciju, kas pēc tam veicina PS eksternalizāciju nieru kanāliņu šūnās, izraisot CaOx kristālu veidošanos un augšanu [8]. ROS un lipīdu peroksidācija spēcīgi aktivizē fosfolipīdu skramblāzi (PLSCR)[9], savukārt ROS uztvērēju, piemēram, glutationa, koenzīma Q10 vai idebenona (sintētiskā koenzīma Q10 homologa) iedarbība samazina PLSCR aktivāciju policistiskās nieru slimības gadījumā [10]. . PLSCR, kas ir piestiprināts pie šūnu membrānas[11], darbojas kā viens no trim fosfolipīdus pārvēršošajiem enzīmiem, kas spēj katalizēt ātru PS divvirzienu kustību abās membrānas pusēs pa koncentrācijas gradientu [12]. Fizioloģiskos apstākļos šūnu membrāna atrodas asimetriskā stāvoklī, un PLSCR neietekmē membrānu [13]. Tomēr pēc eikariotu šūnu ievainojuma PLSCR tiek aktivizēts un pārvieto PS no iekšējā uz ārējo slāni [14, 15]. Turklāt tiek ziņots, ka pārmērīga PLSCRin Ķīnas kāmja olnīcu K1 šūnu ekspresija stimulē PS eksternalizāciju, uzlabojot PS pārvietošanos uz āru uz šūnas virsmu apoptozes laikā [16]. Tāpēc mēs izvirzījām hipotēzi, ka PLSCR ir iesaistīts arī PS eksternalizācijā nieru kanāliņu šūnu membrānā, aktivizējot ROS.

Potenciāls oksalātu izraisītas ROS ražošanas molekulārais mehānisms rodas, indukējot TGF- 1/Smad signalizāciju, kam var būt nozīme ROS veidošanā [17,18]. Tiek ziņots, ka TGF- 1/Smad signalizācija ir saistīta ar neskaitāmām nieru slimībām, piemēram, glomerulonefrītu, nieru intersticiālu fibrozi un nefrolitiāzi[19]. Turklāt mononukleārās šūnas, kas apstrādātas ar TGF- 1, uzrāda PSeksternalizāciju šūnu membrānā, izraisot PS pārvēršanos no iekšējā uz ārējo slāni [20]. Tomēr, cik mums zināms, saikne starp TGF- 1/Smad signalizāciju un PSversiju nieru kanāliņu šūnu membrānās joprojām nav zināma. Mēs izvirzījām hipotēzi, ka TGF{10}} piedalās PS versijā nieru kanāliņu šūnu membrānās, aktivizējot PLSCR žurku agrīnā stadijā.nierakmensveidošanās ar ROS starpniecību.

Tāpēc mēs pētījām, vai TGF- 1/Smad signalizācija stimulē PS eksternalizāciju, aktivizējot ROS, un vai TGF aktivizē PLSCR nieru kanāliņu šūnu membrānā agrīnā slimības stadijā.nierakmensattīstība in vitro un in vivo, tādējādi liekot teorētisko pamatu etioloģijainierakmensveidošanās.

Noklikšķiniet uz Cistanche DHT nieru slimībām

materiāli un metodes

Žurkas agrīnās stadijas CaOx nierakmeņu veidošanās modelis

Sešdesmit tīrus 3-mēnešus vecus Wistar žurku tēviņus, kas sver 200 ± 20 g, nodrošināja Harbinas Medicīnas universitātes Eksperimentālais dzīvnieku centrs, un tie tika izmitināti istabas temperatūrā (22 grādi ± 2 grādi) un 50-70 procentu mitruma. Pēc 3 adaptīvās audzēšanas dienām tās tika nejauši sadalītas trīs grupās (20 žurkas/grupā) — kontrole,nierakmens, unnierakmensplus SB431542 (TGF- 1/Smad signalizācijas ceļa inhibitors).

Nierakmensveidošanās tiek uzsākta kā agrīnas patoloģiskas izmaiņas pēc nieru kanāliņu šūnu traumas [21,22]. Lai izpētītu šo traumu procesu, žurku modelis agrīnā stadijānierakmenstika izveidota, jo par standartizētu pieeju vēl nav ziņots. Lai novērotu agrīnās izmaiņas pēc nieru kanāliņu šūnu bojājumiem, mēs izmantojām metodi, par kuru ziņoja Liet al. [23]. Īsumā, kontroles grupas žurkām ar orālo zondi katru dienu tika ievadīti 2 ml destilēta ūdens, savukārt žurkāmnierakmensgrupai katru dienu ar orālo zondi ievadīja 2 ml 1% etilēnglikola šķīduma un 1% NHCl šķīduma. Žurkas iekšānierakmensplus SB431542 grupa tika intraperitoneāli injicēta ar SB431542 līdzšķīdinātāju (5 mg/kg, S1067; Selleckchem, Šanhaja, Ķīna) ik pēc 7 dienām [24]. Pārtika un ūdens tika nodrošināti ad libitum. 14. dienā žurkas tika eitanāzētas ar anestēzijas līdzekļa pārdozēšanu (nātrija pentobarbitāls, 200 mg / kg, izmantojot intraperitoneālu injekciju), un to nieres tika izgrieztas. Kreisās nieres nekavējoties tika konservētas šķidrā slāpeklī turpmākai olbaltumvielu noteikšanai. Labās nieres tika fiksētas, pēc tam dehidrētas un iestrādātas parafīna vaskā. Visi pētījumi ar dzīvniekiem tika veikti saskaņā ar Nacionālo veselības institūtu rokasgrāmatu laboratorijas dzīvnieku aprūpei un lietošanai. Eksperimentālās procedūras apstiprināja Harbinas Medicīnas universitātes Pirmās saistītās slimnīcas Dzīvnieku eksperimentu lietošanas ētikas komiteja (apstiprinājuma numurs: 2020005, Harbina, Ķīna).

Kristālu veidošanās nieru audos

Audu paraugi tika iekrāsoti, izmantojot Pizzolato metodi [23], un CaOx kristāli tika novēroti polarizētās gaismas optiskā mikroskopā (Sinico Optical Instrument Co., Shenzhen, Ķīna). Pizzolato pozitīvie reģioni tika izmērīti un izteikti kā permilžu vecums no šķērsgriezumu kopējā audu laukuma, izmantojot ImageJ 1.49v (Nacionālais veselības institūts, ASV).

PS noteikšana nieru kanāliņu šūnu membrānā in vivo ar plūsmas citometriju

Nieru epitēlija šūnu PS iedarbība tika novērtēta, izmantojot ar fluoresceīna izotiocianātu (FITC) iezīmētu aneksīna V krāsošanas testu, kā aprakstīts iepriekš [2]. Šūnas tika novērotas (katrā grupā) zem konfokālā lāzera mikroskopa (Olympus, Tokija, Japāna). PS eksternalizācijas apjoms tika noteikts kā aneksīna V pozitīvo šūnu procentuālais daudzums. Paraugu aneksīna V fluorescence tika mērīta, izmantojot plūsmas citometru (488 nm ierosme/530 nm emisija; Beckman Coulter, Brea, CA, ASV).

TGF- 1 un Smad7 līmeņu mērīšana nieru kanāliņu šūnu membrānā ar Western blot metodi

Pēc sasaldēto audu paraugu atgūšanas proteīns tika ekstrahēts, izmantojot dabisko membrānas proteīna ekstrakcijas komplektu ProteoExtract (M-PEK) (MERCK Co., Kenilworth, NJ, ASV), un proteīna koncentrācija tika noteikta, izmantojot Bio-Rad proteīna testu. komplekts (Hercules, CA, ASV) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Pēc tam 40 ug proteīna tika ievietoti 8 procentu SDS-poliakrilamīda gēlā (kraušanas gēls 100 V, izšķīdināšanas gēls 200 V) uz 1 stundu ar nemainīgu elektroda strāvu 300 mA. Gelā esošās olbaltumvielas tika pārnestas uz nitrocelulozes membrānu (Kexing Co., Pekina, Ķīna), 1 stundu bloķētas 37 grādu temperatūrā 5% vājpiena pulverī un inkubētas nakti 4 °C temperatūrā ar aitas anti-žurku TGF 1 ( ab208466; Abcam, Kembridža, Apvienotā Karaliste) un Smad7 (66 478; Proteintech, Uhaņa, Ķīna) antivielas [25]. Tika pievienota ar mārrutku peroksidāzi iezīmēta trušu sekundārā antiviela pret aitu (1:400; Nakasugi Jinqiao Co., Pekina, Ķīna) un inkubēta 37 grādu temperatūrā 1 stundu. Signāls tika noteikts, izmantojot uzlaboto hemiluminiscences reaģentu (Abcam). Pozitīvās joslas tika analizētas, izmantojot Gel-Pro 4.0 gēla optiskā blīvuma analīzes programmatūru, un tika izmērīts kumulatīvais optiskais blīvums (IOD vērtība), un R vērtība atspoguļo relatīvo proteīna saturu šādi: R=atsauces IOD vērtība PLSCR (mērķis)/GAPDH (references proteīna) IOD atsauces vērtība.

Šūnu kultūra un RNS traucējumi

Nieru epitēlija šūnu līnija (MDCK šūnas, CCL34, pasāžas 53-90; ATCC, Manasasa, VA, ASV) tika audzēta Dulbecco modificētajā Eagle barotnē, kas papildināta ar antibiotikām (10{{1{{14} }}} U/mL penicilīns, 100 mg/ml streptomicīna; Life Technologies, Karlsbāda, Kalifornija, ASV) un 10% liellopu augļa seruma (Life Technologies Co.) 37 grādu temperatūrā 5% CO atmosfērā un subkultivēts ar 0,25% tripsīns un 1 mM etilēndiamīntetraetiķskābe (Life Technologies Co., CA, ASV). Šūnas tika apstrādātas ar CaOx (0,5 mM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ASV) 2 stundas un ar 0,5 mM CaOx un 100 ug/ml neitralizējošu anti-TGF- 1 antivielu (R&D Systems, Mineapolisa). , MN, ASV) 2 stundas. Visi eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros.

Lai noteiktu PLSCRin PS eversijas lomu, nieru kanāliņu epitēlija šūnas tika transficētas ar PLSCR siRNS [26]. siRNS izstrādāja un sintezēja Anhui General Biological System (Anhui, Ķīna; skatīt 1. tabulu). LipofectamineTM 2000 (Sunshine Biotechnology Co., Ltd., Šanhaja, Ķīna) tika izmantots transfekcijai saskaņā ar ražotāja norādījumiem. . Pēc 24 stundu transfekcijas šūnas tika sagremotas ar tripsīnu, centrifugētas ar ātrumu 1000 × g 5 minūtes, divas reizes mazgātas ar PBS un vēlreiz centrifugētas. Supernatants tika izmests, un granula tika suspendēta PBS, lai izveidotu vienas šūnas suspensiju ar blīvumu 1 × 10 grādu šūnas / ml. Pozitīvais FAM (karboksifluoresceīna) ekspresijas ātrums bija 93 procenti ± 5 procenti, kā noteikts plūsmas citometrijā. Lai tālāk novērtētu saistību starp TGF 1 un PLSCR, šūnas 2 stundas apstrādāja ar 0,5 mM CaOx vai 10 ng/ml TGF- 1 un pēc tam tika transficētas ar PLSCR siRNS.

PLSCR līmeņa mērīšana nieru kanāliņu šūnu membrānās ar Western blot metodi

Olbaltumvielas tika ekstrahētas, izmantojot dabisko membrānas proteīna ekstrakcijas komplektu ProteoExtract (Chemical Book Co., Pekina, Ķīna), un olbaltumvielu koncentrācija tika noteikta, izmantojot Bio-Rad proteīna testa komplektu (Noble-Ryder Co., Pekina, Ķīna). Pēc tam 40 ug proteīna tika ievietoti uz 8% SDS-poliakrilamīda gēla (kraušanas gēls 100 V, izšķīdināšanas gēls 200 V) uz 1 stundu ar nemainīgu strāvu 300 mA. Želejā esošie proteīni tika pārnesti uz nitrocelulozes membrānu (Kexing Co., Shenzhen, Ķīna) un bloķēti ar 5% vājpienu 1 stundu 37 ° C temperatūrā un nakti inkubēti 4 grādos ar aitas anti-žurku PLSCR monoklonālo antivielu (1:200, PAB781HuO1; Abcam, Guandžou, Ķīna). Pēc tam pievienoja ar mārrutku peroksidāzi iezīmētu trušu sekundāro antivielu pret aitu (1:400) un maisījumu inkubēja 37 °C 1 stundu. Pēc membrānas mazgāšanas signāls tika noteikts ar pastiprinātu hemiluminiscences reaģentu (Abcam, Guang-zhou, Ķīna). Pozitīvās joslas tika analizētas, izmantojot Gel-Pro 4.0gel optiskā blīvuma analīzes programmatūru, un tika izmērīta IOD vērtība, un R vērtība atspoguļo relatīvo olbaltumvielu saturu, kā aprakstīts iepriekš.

1. tabula siRNS sekvences PLSCR

Membrānas fosfatidilserīna sadalījuma mērīšana

Šūnu membrānas PS eversijas daudzums tika noteikts, izmantojot fluorescences dzēšanas metodi, ko aprakstīja Kim et al.[27] un mūsu pētnieku komanda [2], izmantojot nitrobenzolu-2-oksa-1, 3-diazolu (NBD, Šanhaja, Ķīna) kā fluorescences zondi. Pēc PS marķēšanas šūnu membrānas ārējā slānī ar NBD, šūnas tika kultivētas PBS, kas satur 5 mM diizopropilfluorfosfātu. Pēc tam tika pievienots PBS, kas satur kalcija oksalātu (10 mM), un šūnas tika inkubētas 37 grādu temperatūrā. Ik pēc 10 minūtēm tika izvadīts vienāds daudzums šūnu suspensijas, un fluorescences intensitāte tika reģistrēta, izmantojot RF-5000 spektrofluorometru (Shimadzu, Kioto, Japāna). Spektrofluorometra iestatījumi bija šādi: 10 nm spraugas platums emisijas viļņa garumam 530 nm; un 5 nm spraugas platums ierosmes viļņa garumam 470 nm. Pēc tam 50 gadu laikā tika reģistrēta vidējā fluorescences vērtība (FT). Vidējā samazinātā fluorescences intensitāte (FD) tika reģistrēta arī pēc ditionīta šķīduma izmantošanas, lai dzēstu NBD fluorescenci no šūnas ārējā slāņa. Pēc tam tika pievienots 1% (w/v) Triton X-100, lai padarītu šūnu membrānu caurlaidīgu. Pēc tam tika dzēsta NBD fluorescence no šūnu membrānas iekšējā slāņa, un tika reģistrēta fluorescences intensitāte (FO). NBD-PS procentuālais daudzums iekšējās lobulās vēlāk tika aprēķināts, izmantojot šādu vienādojumu: internalizētā NBD-PS vecums procentos =100 × [(FD-FO)/(FT-FO)].

PS eksternalizācijas procentuālais daudzums tika noteikts pēc principa, kas izmantots NBD-PS internalizācijas mērīšanai. NBD-PS procentuālais daudzums ārējās daiviņās tika aprēķināts arī, izmantojot šādu vienādojumu: NBD-PS procentuālā daļa ārējās daivas =100×[(FT-FD)/(FT-FO)].

Statistiskā analīze

Nepārtraukti mainīgie tiek izteikti kā vidējā±standarta novirze. Tika izmantots neparametrisks pāra rangu summas tests, t-tests un hī kvadrāta tests. Visas analīzes tika veiktas, izmantojot SPSS programmatūru 19.0(SPSS, Inc., Čikāga, IL, ASV). Rezultāti ar P<0.05 were="" considered="" statistically="">

Rezultāti

TGF- 1/Smad signalizācija stimulē PS eksternalizāciju in vivo

Kristālu veidošanās žurku modeļa nieru audos

Izveidot žurku modeli agrīnā stadijānierakmensveidošanās, etilēnglikolu un amonija hlorīdu ievadīja žurku kuņģī 2 nedēļas, un pēc tam katru nieru sekciju pārbaudīja ar digitālo mikroskopu. Kontroles grupas paraugos 14. dienā tika novērotas normālas nieru kanāliņu struktūras bez kristālu veidošanās (1. att.). Kad nieru audi nonierakmensgrupa tika novērota ar mikroskopiju, nieru kanāliņi parādījās paplašināti ar redzamiem mikrokristāliem; dažos nieru kanāliņos tika novērota neregulāra CaOx kristālu uzkrāšanās, kas liecina par veiksmīgu agrīnas stadijas žurku modeļa izveidi.nierakmensnieru kanāliņu šūnu bojājumu veidošanās un rašanās.

PS klātbūtne nieru kanāliņu šūnu membrānā

Anneksīns V-FITC, fluorescējoša molekula, kas saistās ar PS uz šūnas virsmas, tiek plaši izmantota, lai noteiktu PS pārdali. Mūsu pētījumā MDCK šūnas normālā kontrolē,nierakmens, unnierakmensplus SB431542 grupas tika novērotas konfokālā lāzera mikroskopā (1.B att.). PS versiju līmenis palielinājāsnierakmensgrupā, salīdzinot ar kontroles grupu (P<0.05, fig.1c,="" d),="" whereas="" cells="" in="" the="">nierakmensplus SB431542 grupa uzrādīja zemāku PS eksternalizācijas pamata līmeni nekā grupānieresakmensgrupa (P<0.05, fig.="" 1c,="">

TGF{0}} un Smad7 līmeņu mērīšana

TGF{0}} līmenisnierakmensgrupa tika kvantificēta ar Western blotēšanu. Tipisks Western blots ir parādīts 2.A attēlā kopā ar TGF- 1 līmeņa densitometrisko analīzi. Vērtības tika normalizētas ar kontroles vērtībām un izteiktas kā TGF- 1 attiecība pret tubulīnu. Etilēnglikola un NH Cl pievienošana ievērojami palielināja TGF- 1 līmeni un samazināja Smad7 līmeni, salīdzinot ar tiem, kas bija kontroles šūnās (2.A att.); tomēr apstrāde ar SB431542 plus etilēnglikolu un NH Izsauca, lai ievērojami pazeminātu TGF- 1 līmeni un palielinātu Smad7 līmeni, salīdzinot ar šūnām, kas apstrādātas ar etilēnglikolu un NH, Cl.

TGF aktivizē PLSCR aktivitāti nieru kanāliņu šūnu membrānā in vitro

PLSCR

PLSCR līmenis tika novērtēts ar Western blotēšanu. Šūnas 2 stundas apstrādāja ar CaOx. PLSCR līmenis kontroles šūnās bija niecīgs, bet ievērojami palielinājās CaOx grupā (P<0.05, fig.2b).plscr="" overexpression="" was="" inhibited="" following="" treatment="" with="" the="" anti-tgf-β1="" antibody.="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" plscr="" expression="" significantly="" reduced=""><0.05,>

Traucēta NBD-PS kustība uz iekšu

Lai novērtētu PLSCR aktivitāti, mēs noteicām PS kustības uz iekšu un uz āru nieru kanāliņu epitēlija šūnu membrānā. Lai novērtētu, vai PLSCR ietekmē PS kustību no ārējās brošūras uz plazmas membrānas iekšējo brošūru, mēs integrējām fluorescējoši marķētu PS (NBD-PS) plazmas membrānas ārējā lapiņā un novērojām tās internalizāciju (3. att.). MDCK šūnu internalizētais NBD-PS daudzums kontroles un CaOx grupās bija attiecīgi aptuveni 46,2 procenti un 17,8 procenti. Tādējādi PS internalizācijas ātrums CaOx grupas šūnās bija ievērojami zemāks nekā kontroles grupas šūnās (P<0.01, fig.3a).="" however,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" in="" the="" anti-tgf-β1+caox="" group="" increased="" to="" 34.2%,="" which="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" caox="" group=""><0.01, fig.3a).="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" significantly=""><0.05, fig.3b,="">

1. att. Kristālu veidošanās un PS eksternalizācija tika novērota kontroles, nierakmeņu un nierakmeņu plus SB431542 grupās.

(A) kristālu veidošanās nieru audos 14. dienā; bultiņa norāda uz mikrokristāliskām struktūrām. (B) MDCK šūnas tika novērotas ar konfokālo lāzera mikroskopiju.

(C) Eversijas ātruma plūsmas citometriskie grafiki. (D) Pārvēršanas koeficients ( procenti ). Trijstūris norāda P<0.05 vs.="" control.="" asterisk="" indicates=""><0.05 vs.="">nierakmensgrupai

Uzlabota NBD-PS kustība uz āru

Lai noteiktu, vai oksalāts ietekmē PS transportēšanu uz āru, MDCK šūnas tika intracelulāri marķētas ar NBD-PS, un tika noteikts tās pārvietošanās apjoms uz piemēriem-mikrofona lapiņu. Inkubācijas barotne saturēja liellopu seruma albumīnu (1 % w/v), kas ātri ekstrahēja virsmas ekspresēto NBD-PS. Aptuveni 34,5 procenti NBD-PS migrēja uz ārējo brošūru kontroles šūnās, savukārt ārējās PS pārneses ātrums CaOx grupas šūnās tika palielināts līdz 75,3 procentiem, salīdzinot ar kopējo iekšējo marķēto NBD-PS, kas bija ievērojami lielāks nekā ka kontroles grupas šūnās (P<0.01, fig.3a).to="" determine="" whether="" tgf-β1="" causes="" ps="" eversion="" in="" renal="" tubule="" cell="" membranes="" by="" activating="" plscr,="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" were="" transfected="" with="" plscr="" sirna.="" after="" plscr="" sirna="" transfection,="" the="" externalization="" rate="" was="" lower="" than="" that="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox=""><0.01 for="" both,="" fig.3b,="">

2. att. TGF- 1/Smad ekspresija kontroles, nierakmeņu un nierakmeņu plus SB431542 grupās un PLSCR ekspresija nieru kanāliņu šūnu membrānā.

(A)TGF- 1/Smad izteiksme. (B) Relatīvie fosfolipīdu skramblāzes (PLSCR) līmeņi un reprezentatīvs blots ar ekspresiju, kas normalizēta līdz GAPDH.P ekspresijai.<>

Trijstūris norāda P<0.05 vs.control.="" the="" round="" dot="" indicates=""><0.05 vs.="" the="" caox="" group.="" pound="" sign="" indicates=""><0.05 vs.="" tgf-β1="">

SPIED ŠEIT, LAI DALĪTIES Ⅱ