Imūno gēnu ekspresija un funkcionālie tīkli atsevišķās lupus nefrīta klasēs Ⅰ

KOPSAVILKUMS

Mērķis Izpētīt NanoString platformas lietderībunieres izskaidrošanaimūnās transkripti III, IV un V klases lupus nefrīta (LN) gadījumā, izmantojot retrospektīvu kohortuar formalīnu fiksēts parafīns(FFPE) nieru biopsijas audi.

Metodes: imūngēnu transkripta analīze tika veikta, izmantojot NanoString nCounter platformu RNS no LN (n=55), plānas bazālās membrānas (TBM) slimības (n=14) un membrānas nefropātijas (MN) (n{). {2}}) FFPEnieru biopsijaaudi. LN paraugi sastāvēja no atsevišķām III (n=11), IV (n=23) un V (n=21) klases biopsijām bez jauktiem bojājumiem. Diferenciālā gēnu ekspresija tika veikta ar NanoString nSolver, vizualizējot vulkānu diagrammas un siltuma kartes, kas ģenerētas R. Tika nopratināti nozīmīgi transkripti, lai identificētu funkcionālos tīklus, izmantojot STRING un Gene ontoģenēzes terminus.

KLIKŠĶINIET ŠEIT, LAI IEGŪTU AUGU FORMULU CISTANHE NIERĒM

Rezultāti Salīdzinot ar TBM, mēs identificējām 52 ievērojami atšķirīgi izteiktus gēnus, kas ir kopīgi visām trim LN klasēm. Ceļu analīze parādīja I tipa interferona (IFN) signalizācijas, komplementa un MHC II ceļu bagātināšanos, un lielākā daļa no tiem uzrādīja visaugstāko ekspresiju IV klases LN. Mūsu IV klases LN biopsijas arī uzrādīja būtisku NF-κB signālu pārregulēšanu un imunoloģisko bagātināšanu, salīdzinot ar V klases LN biopsijām. I tipa IFN ceļa transkripti atšķīra V klasi LN no MN.

Secinājums Mūsu visa nieru sekcijas transkriptomiskā analīze sniedza ieskatu III, IV un V klases LN molekulārajā profilā. Dati iezīmēja svarīgus ceļus, kas ir kopīgi visām trim klasēm, un ceļiem, kas bagātināti mūsu IV klases LN biopsijās. Spējai atklāt molekulāros ceļus LN, izmantojot veselas FFPE biopsijas sekcijas, varētu būt klīniska lietderība LN ārstēšanas izvēlē.

IEVADS

Lupus nefrīts(LN) ir svarīga sistēmiska izpausmesarkanā vilkēde(SLE) un attīstās aptuveni 40% pacientu.1 Tās izplatību ietekmē vecums (lielāks bērnībā radušos SLE gadījumā) un etniskā piederība (augstāks pacientiem, kas nav baltās rases pārstāvji), un tas ir apgriezti saistīts ar sociāli ekonomisko stāvokli.2nieru biopsijair svarīga LN3 4 pārvaldības daļa, un ir pieliktas ievērojamas pūles, lai biopsijā novērotās izmaiņas saistītu ar patoģenēzi, ārstēšanas izvēli un prognozi.1 Šajā sakarā ļoti svarīga bija LN klasifikācijas sistēmas izstrāde, kas ietvēra standartizētas biopsijas bojājumu definīcijas, lai samazinātu starpziņojumu mainīgumu.

Starptautiskās nefroloģijas biedrības/nieru patoloģijas biedrības (ISN/RPS) 2003. gada vienprātīgā LN5 klasifikācija aprakstīja sešas klases: minimālais mezangiālais LN (I klase); mezangiāls proliferatīvs LN (II klase); fokusa LN (III klase); difūzā LN, ko varētu vēl iedalīt difūzajā segmentālajā (IV-S klase) un difūzajā globālajā (IV-G klase) proliferatīvajā LN; membranozais LN (V klase) un progresējoša sklerozējošs LN (VI klase). Aprakstot III un IV klasi, tika definēti un apzīmēti arī aktīvi (A, piemēram, endokapilāra hipercelularitāte, fibrinoīdā nekroze, šūnu un mikrošūnu pusmēness) un hroniskie (C, piemēram, glomerulārā skleroze, šķiedru pusmēneši) glomerulārie bojājumi. Piemēram, IV-G (A) klase aprakstīja difūzu globālu proliferējošu LN ar aktīviem bojājumiem. Ir ierosināts šīs klasifikācijas atjauninājums.6 Ieteikumos bija iekļauta IV-S un IV-G klases apakšnodaļu likvidēšana, jo tie neietekmē iznākumu. Metaanalīzē rašanās vai nunieru slimība beigu stadijāvaiseruma kreatinīna līmeņa dubultošanāsneatšķīrās starp IV-S un IV-G klasēm.7 Tika arī ierosināts aizstāt aktīvos un hroniskos deskriptorus ar aktivitātes un hroniskuma indeksiem, kas iegūti no NIH lupus aktivitātes un vērtēšanas sistēmas8, tādējādi ļaujot kvantitatīvi novērtēt aktivitāti (a punktu skaits no 0 līdz 24) un hroniskums (no 0 līdz 12).

LN klasei ir izšķiroša nozīme, lai informētu vadību.3 Imūnsupresija ir ieteicama aktīvās III un IV klases LN, bet ne II klases LN. Lēmumu par imūnsupresijas ierosināšanu V klases LN ietekmē proteīnūrijas pakāpe un tās reakcija uz renīna-angiotenzīna-aldosterona blokādi. Proteīnūrijas kontroles nespēja 12 mēnešus pēc ārstēšanas ir saistīta ar progresēšanu līdz hroniskai nieru slimībai9–11, tāpēc ārstēšanas mērķis ir samazināt proteīnūriju, lai panāktu pilnīgu klīnisku atbildes reakciju (<0.5–0.7 g per 24 hours).

LN klase vien ir mazāk spēcīga rezultātu informēšanā, joriska faktori hroniskas nieru slimības attīstībaiietverklīniskās pazīmesun tāpēc, ka tajos ir iekļautas histoloģiskas pazīmes, kas nav ietvertas LN klases definīcijās. Tie ietver intersticiālās fibrozes un tubulārās atrofijas (IFTA) pakāpi un specifiskus glomerulārus bojājumus, piemēram, fibrinoīdu nekrozi un šķiedru pusmēness.12 Atlasītu un precīzi definētu atsevišķu nieru bojājumu kvantitatīva noteikšana var sniegt informāciju par prognozi. Tas ir acīmredzams IgA nefropātijā, kur ir pierādīts, ka mezangiālo šūnu, endokapilāru hipercelularitātes, segmentālās sklerozes, tubulārās atrofijas, intersticiālās fibrozes un pusmēness punktu noteikšana, veidojot MEST-C punktu, palīdz prognozēt risku. 13–15 Ierosinātie ISN grozījumi. /RPS 2003 vienprātīgā LN klasifikācija varētu novērst šos trūkumus6, taču tā joprojām ir balstīta uz morfoloģijas izmantošanu. Līdz ar to ir jāizpēta LN biopsiju molekulārie ceļi un jāsaprot, kā tie ir saistīti ar LN klasēm16 17 un ārstēšanas rezultātiem.18 19 Klīniskās lietderības ziņā nieru biopsiju transkriptomiskā analīze ir vissvarīgākā. progresējusi antivielu izraisītas nieru atgrūšanas diagnostikā, kad gēnu transkriptu ekspresijas palielināšanās biopsijas audos, gaidot apstiprināšanu, ir pievienota apstiprinātajiem morfoloģiskajiem kritērijiem.20 Lai noteiktu transkriptijas datu izmantošanas lietderību, lai uzlabotu nieru klīnisko lietderību. biopsija SLE gadījumā, mēs izmantojām NanoString tehnoloģiju, lai pētītu 750 ar imūnsistēmu un iekaisumu saistītu transkriptu ekspresiju formalīnā fiksētās parafīnā iegultās (FFPE) sekcijās no 55 LN biopsijām, 14 biopsijām ar plānas bazālās membrānas (TBM) slimību un 9 biopsijām ar membrānas nefropātija (MN).

METODES

Paraugi: FFPE nieru biopsijas audi tika iegūti no arhivētiem LN, TBM un MN paraugiem, kas tika izmantoti klīniskai lietošanai un kur bija pieejami atbilstoši audi analīzei. Tika izslēgtas lupus biopsijas ar jauktiem bojājumiem vai ievērojamām rētām. TBM tika izmantots kā slimības kontrole, jo nebija pieejamas normālas nieru biopsijas. Klīniskie parametri tika savākti no veselības ierakstiem retrospektīvi. Interferona (IFN) punktu matrica tika iegūta, kā ziņots iepriekš.21 Pilnīga atbildes reakcija tika definēta kā urīna proteīna/kreatinīna attiecība (uPCR).<50mg/mmol and an estimated glomerular filtration rate (eGFR) of ≥60mL/min, or if <60mL/min at baseline not fallen by >20% uz 1 gadu pēc biopsijas. Daļēja atbilde tika definēta kā uPCR<300mg/mmol with a≥50% improvement from baseline and eGFR criteria the same as for complete response. Non-response was defined as failing to achieve partial response by 1 year.

RNS ekstrakcija

Pēc divu 4 μm sekciju noņemšanas no katra FFPE bloka ar mikrotomu tika iegūtas sešas 10 μm biezas veselu audu sekcijas. Lai novērstu savstarpēju piesārņojumu, starp paraugiem aprīkojums tika notīrīts ar RNase Away, un katram paraugam tika izmantots jauns asmens. Visu audu RNS izolācija tika veikta tajā pašā dienā, izmantojot RNeasy FFPE komplektu (Qiagen, #73504), un RNS koncentrācija tika novērtēta ar NanoDrop ND1000 spektrofotometru (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Masačūsetsa, ASV; tiešsaistes papildu dati S1).

Transkripta analīze

Transcriptome analysis was performed using 100ng of total RNA on the NanoString nCounter platform (NanoString nCounter FLEX Dx analysis system, NanoString Technologies, Seattle, Washington, USA) with a probe CodeSet comprising the human PanCancer immune profiling panel (730 immune-related genes, 40 housekeeping genes, 6 positive control genes, 8 negative control genes) and additional 20 custom probes selected based on literature review (online supplemental table 1). Samples were run using two CodeSets which differed only by 10 unique probes, enabling us to analyze 750 endogenous transcripts across the 78 samples. CodeSet One: LN class III (n=6), class IV (n=9), class V (n=8), TBM (n=8), MN (n=1). CodeSet Two: LN class III (n=5), class IV (n=14), class V (n=13), TBM (n=6), MN (n=8). All samples passed NanoString quality control parameters (image quality control, binding density, positive control linearity and limit of detection). To control for inter-CodeSet variation and batch variability we used the nSolver Cross Reporter Library File (RLF) function to calibrate raw counts of overlapping probes using an identical sample run on both CodeSets. To reduce technical bias, and increase confidence and reproducibility, background thresholding was set at 100 counts, which is >dubultā (vidējais +2 SD) negatīvās kontroles zondes. Skaitļi tika normalizēti līdz 10 mājturības gēnu ģeometriskajam vidējam (FCF1, HPRT1, MRPS5, MTMR14, POLR2A, PRPF38A, SDHA, SF3A3, TUBB un ZC3H14), kas atlasīti tā, kā tie tika izteikti visos paraugu tipos. Visu paraugu normalizētie skaitļi ir norādīti tiešsaistes papildu datos S2.

Statistiskā analīze

Diferenciālā gēnu ekspresija (DGE) tika veikta, izmantojot Solver Advanced Analytics (V.4) Fast/Approxi mate algoritmu, kas izmanto vienkāršoto negatīvo binomiālo modeli visām zondēm, izņemot gadījumus, kad algoritms nekonverģē un tiek izmantota lineārās regresijas metode. LN, MN vai LN klase (III, IV un V) tika izmantoti kā neatkarīgi mainīgie un TBM kā mūsu atsauces grupa. Sliekšņa skaits tika iestatīts uz 100, un novērojumu biežums paraugos tika iestatīts uz 8%; P vērtība tika koriģēta, izmantojot Benjamini-Hochberg metodi ar viltus atklāšanas slieksni, kas iestatīta uz 0.05. Vulkānu diagrammas tika izveidotas, izmantojot Enhanced Volcano pakotni (https://github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano) R.22 Funkcionālā proteīnu asociācijas tīkla vizualizācija tika veikta, izmantojot datubāzi STRING (https://string-db.org/). , izmantojot pilnu STRING tīklu. Tīkla malas tika noteiktas pēc pārliecības, un mijiedarbības tika iestatītas uz augstāko uzticamības mijiedarbības punktu skaitu (lielāks par 0,9 vai vienāds ar to). Atvienotie mezgli tīklos netika parādīti. Tika novērtēti nozīmīgi atšķirīgi izteikti gēni, lai bagātinātu gēnu ontoloģijas (GO) terminus (bioloģiskie procesi, molekulārās funkcijas, šūnu komponents), reaktīvo ceļu un STRING lokālā tīkla klasterus. Vizuālās mijiedarbības tīkli tika ģenerēti ar funkcionālu bagātināšanu GO terminos (bioloģiskajos procesos) un STRING analīzē. Apgabalam proporcionālā Venna diagramma, kurā attēloti atšķirīgi izteikti gēni starp LN apakšklasēm, tika ģenerēts ar BioVenn (www.biovenn. nl).23 Dati no uzlabotas analīzes risinātāja programmatūras tika nolasīti R statistikas vidē un datu vizualizācija tika veikta, izmantojot boxplots, galveno komponentu analīzi, vulkānu zemes gabali un siltuma kartes. Siltuma kartes tika ģenerētas, izmantojot normalizēto skaitīšanas Z punktu skaitu, un R. Pheatmap. Kopas tika analizētas, izmantojot Fišera precīzu testu. Vairāku grupu salīdzināšanai tika izmantota dispersijas analīze ar Sidaka vairāku salīdzinājumu testu. Dati tika analizēti, izmantojot GraphPad Prism (V.8.0).

Pacienta un sabiedrības iesaistīšanas (PPI) paziņojums

Šis pētījums bija daļa no MASTERPLANS konsorcija, un pacientu līdzstrādnieki piedalījās katrā darba daļā, tostarp šajā pētījumā. PPI izstrādāja terminu glosāriju, lai nodrošinātu turpmāku sadarbību ar plašāku pacientu kopienu, un pētījumu rezultāti tika iekļauti nespeciālistu pārskatīšanas dienās. Publikāciju recenzijas tiek kopīgotas MASTERPLANS tīmekļa vietnē (https://sites. manchester.ac.uk/masterplans).

Wecistanche atbalsta dienests - lielākā cistanche eksportētāja Ķīnā:

E-pasts:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel.:+86 15292862950

Iegādājieties sīkāku informāciju par specifikācijām:

Skatīt šeit: https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

IEGŪT DABĪGU ORGANISKO CISTANŠES EKSTRAKTU AR 25% EHINAKOZĪDU UN 9% AKTEOZĪDU NIERĒM