Zema gestācijas proteīna uzņemšanas ietekme uz embrionālās nieres mikroRNS ekspresiju un vīriešu augļa nefrona cilmes šūnām
Mar 08, 2022
Ievads
Barības vielu trūkums var signalizēt par izmaiņām galvenajos ceļiem dažādos augļa attīstības posmos, kas var izraisīt neatgriezeniskus orgānu un sistēmu traucējumus pieaugušā vecumā [1]. Augļa programmēšana attiecas uz jebkuru apvainojumu attīstības laikā, kas izraisa ilgtermiņa ietekmi uz organisma struktūru vai funkciju [2]. Augļa programmēšanas traucējumi izraisa mazu dzimšanas svaru, mazāku nefronu skaitu un paaugstinātu sirds un asinsvadu unnierutraucējumi pieaugušā vecumā [3–6]. Citu autoru un mūsu pētījumi ir parādījuši zemāku dzimšanas svaru, par 28 procentiem mazāk nefronu, samazinātunierusāls izvadīšana, hroniskanieru mazspēja, un arteriālā hipertensija gestācijas zema proteīna (LP) uzņemšanas gadījumā, salīdzinot ar standarta (NP) proteīnu uzņemšanu pēcnācējiem pieaugušā vecumā [3–7]. Nefroģenēze ietver stingru gēnu ekspresijas, olbaltumvielu sintēzes un audu remodelācijas kontroli. Pētījumi ir parādījuši, ka nefronu skaitu nosaka mijiedarbība starp urīnizvadkanāla pumpuriem (UB) un metanefros mezenhīma (MM) cilmes šūnām [8–10]. MM signāli izraisa UB stimulētu augšanu un kanāliņu sistēmas sazarošanos. Savukārt MM proliferāciju un diferenciāciju, kas veido mezenhimālo vāciņu (CM), mediē UB gali [11].
CISTANCHE UZLABOS NIERU/NIeru SLIMĪBU
Ir bijusi nopietna interese par epiģenētisko izmaiņu lomu attiecībā uz pirmsdzemdību stresa ilgtermiņa ietekmi uz augļa attīstību [12]. MikroRNS (miRNS) ir genomā kodētas mazas nekodējošas RNS, kuru garums ir aptuveni 22 nukleotīdi, un tām ir būtiska loma mērķa gēna ekspresijas pēctranskripcijas regulēšanā [13–16]. miRNS kontrolē gēnu ekspresiju pēc transkripcijas, regulējot mRNS translāciju vai stabilitāti citoplazmā [17, 18]. Funkcionālie pētījumi liecina, ka miRNS ir iesaistītas kritiskos bioloģiskos procesos attīstības laikā un šūnu fizioloģijā [13, 16]. To izpausmes izmaiņas ir novērotas vairākās patoloģijās [16, 19]. Tādējādi miRNS raksturojums ir palīdzējis izprast gēnu regulēšanu un šūnu proliferāciju, diferenciāciju un apoptozi un izskaidrot patofizioloģijas traucējumus, tostarpnierestraucējumi [20–22]. Pētījumi liecina, ka laikānieresontoģenēzes miRNS ir neaizstājamas nefronu attīstībai [23–26]. Turklāt dažu miR NA nepietiekama ekspresija MM cilmes šūnās samazina šūnu proliferāciju, kā rezultātā notiek agrīna diferenciācija un līdz ar to samazinās nefronu skaits [27, 28]. Šo fenomenu raksturo palielināta apoptoze un augsta Bim ekspresija cilmes šūnās [27]. Tādējādi miRNS modulē līdzsvaru starp šo metanefrisko primāro šūnu apoptozi un proliferāciju [29].
Mēs izvirzījām hipotēzi, ka ir saistītas nezināmas epiģenētiskas izmaiņas un miRNS ekspresijas profilēšananieresattīstības traucējumi mātes pēcnācējiem ar ierobežotu olbaltumvielu daudzumu. Tādējādi mūsu mērķis bija novērtēt miRNS modeļus un paredzēto gēnu ekspresiju auglimnieres17 dienu pēc gestācijas (17-DG) ar proteīnu ierobežotu vīriešu dzimuma pēcnācēju, lai noteiktu molekulāros ceļus un traucējumus, kas saistīti arnierušūnu proliferāciju un diferenciāciju laikānieresattīstību.
Atslēgvārdi:nieru mazspēja; nieru kanāliņu; nieru darbības traucējumi; nieru attīstība; nieres
Materiāls un metodika
Dzīvnieki un diētasEksperimenti tika veikti, kā detalizēti aprakstīts iepriekš [5, 6] ar atbilstoša vecuma žurku mātītēm un tēviņiem, kas bija pārojušās Wistar HanUnib žurkas (250–300 g), kas iegūtas no CEMIB/UNICAMP piegādātās vaislas šķirnes. , Kampinasa, SP, Brazīlija. Eksperimentālās procedūras laikā vide un mājoklis radīja pareizos apstākļus viņu veselības un labklājības pārvaldībai. Tūlīt pēc atšķiršanas trīs nedēļu vecumā dzīvnieki tika turēti kontrolētā temperatūrā (25˚C) un apgaismojuma apstākļos (07:00–19:00), nodrošinot brīvu piekļuvi krāna ūdenim un standarta laboratorijas grauzēju ēdienam (Purina Nuvital). , Kuritiba, PR, Brazīlija: Na plus saturs: 135 ± 3 μEq/g; K plus saturs: 293 ± 5 μEq/g), 12 nedēļas pirms audzēšanas. Sanpaulu Valsts universitātes (#446-CEUA/UNESP) Dzīvnieku izmantošanas institucionālā komiteja apstiprināja eksperimentālo protokolu, un visas izmeklēšanas laikā tika ievērotas Brazīlijas Dzīvnieku eksperimentu koledžas noteiktās vispārīgās vadlīnijas. Grūtniecības 1. diena tika noteikta kā diena, kurā maksts uztriepe parādīja spermu. Pēc tam mātītes tika uzturētas ad libitum visu grūtniecības laiku izokaloriskā grauzēju laboratorijā ar standarta olbaltumvielu saturu [NP, n=36] (17 procenti olbaltumvielu) vai zemu olbaltumvielu saturu [LP, n=51 ] (6 procenti olbaltumvielu). NP un LP mātes barības patēriņš tika noteikts katru dienu (vēlāk normalizēts ķermeņa svaram), un mātīšu ķermeņa svars tika reģistrēts katru nedēļu abās grupās. 17 grūtniecības dienās (17-DG) mātītes tika anestēzētas ar ketamīnu (75 mg/kg) un ksilazīnu (10 mg/kg), un dzemde tika atklāta. Augļi tika izņemti un nekavējoties eitanāzēti, nogriežot galvu. Augļi tika nosvērti, un aste un ekstremitātes tika savākti dzimuma noteikšanai. Metanefross tika savākts nākamās paaudzes sekvencēšanas (NGS), RT-qPCR un imūnhistoķīmijas analīzēm.
CISTANČE UZLABOS NIeru/NIeru mazspēju
Seksa apņēmībaŠis pētījums tika veikts tikai vīriešu 17-DG pēcnācējiem, un dzimumu noteica ar Sry parasto PCR (polimerāzes ķēdes reakcijas) sekvences analīzi. DNS ekstrahēja ar enzīmu līzi ar proteināzi K un fenola hloroformu. Reakcijai tika izmantots Master Mix Colorless-Promega, ievērojot ražotāja cikla nosacījumus. Integrētās DNS tehnoloģijas (IDT) sintezēja šādas tālāk norādītās sekvences: Uz priekšu: 5'-TACAGCCTGAGGACATATTA-3'Reverse: 5'-GCACTTTAACCCTTCGATTAG-3'.
Kopējā RNS ekstrakcijaRNS tika iegūta no NP (n=4) un LP (n=4) veselanieresizmantojot Trizol reaģentu (Invitrogen), saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Kopējais RNS daudzums tika noteikts pēc absorbcijas pie 260 nm, izmantojot nanoVue spektrofotometru (GE Healthcare, ASV). RNS integritāte tika nodrošināta, iegūstot RNS integritātes numuru — RIN > 8 ar Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Vācija) [30].
miRNA-Seq un datu analīzeSekvencēšana tika veikta uz MiSeq platformas (Illumina). Protokols atbilst ražotāja norādījumiem, kas pieejamiĪsumā, sekvencēšana ietver bibliotēkas izveidi, un tajā tika izmantots 1 ug kopējās RNS. Šajā darbībā ir savienoti adapteri — 3 un 5. Pēc adapteru ligēšanas tika veikta reversās transkripcijas reakcija, lai izveidotu cDNS. Pēc tam to pastiprināja ar standarta PCR reakciju, kurā parauga identificēšanai izmanto praimerus, kas satur secības indeksu - šo cDNS bibliotēku, kas pakļauta agarozes gēla elektroforēzei miRNS izolēšanai. Pēc kvantitatīvās noteikšanas bibliotēkas koncentrācija tika normalizēta līdz 2 nM, izmantojot 10 nM Tris-HCl, pH 8,5, un transkripta sekvencēšana tika veikta ar MiSeq Reagent Kit v2 (50 cikli).
Datu analīze tika veikta sadarbībā ar Tao Chen, Ph.D. no Ģenētiskās un molekulārās toksikoloģijas nodaļas, Nacionālais toksikoloģisko pētījumu centrs, Džefersons, AR, ASV. Dati no miRNS nākamās paaudzes sekvencēšanas (NGS) tika ģenerēti FASTA formātā un importēti vietnē BaseSpace.com (Illumina, ASV). Datu kvalitāte tika novērtēta, izmantojot ražotāja (Illumina) izstrādāto bāzes izsaukšanas programmatūru CASAVA. Analīzes tika veiktas, izmantojot BaseSpace miRNA analīzi (no Torino Universitātes, Kanādas), un dažādu miRNS secību kartēšanu ar Small RNS (Illumina, ASV) žurkas genomam. Diferencēti izteiktais miRNS pētījums tika analizēts, izmantojot programmatūru Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity, ASV).
miRNS ekspresijas validācijaKatrā grupā miRNS iegūšanai tika izmantoti četri vīriešu kārtas pēcnācēji no dažādiem metieniem (miR{{0}}p, -144-3p, -298-5p, let-7a{{ 4}}p, -181a-5p, -181c-3p un -199a-5p) izteiksmju analīze. Īsumā, 450 ng RNS tika reversi transkribēta bez iepriekšējas pastiprināšanas, izmantojot TaqMan1 Micro RNA reversās transkripcijas komplektu saskaņā ar ražotāja vadlīnijām. Komplementārā DNS (cDNS) tika pastiprināta, izmantojot TaqMan MicroRNA Assays (Life Technologies, ASV) ar TaqMan1 Universal PCR Master Mix, bez AmpErase1 UNG (2x) StepOnePlusTM reāllaika PCR sistēmā (Applied BiosystemsTM), saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Datu analīze tika veikta, izmantojot relatīvo gēnu ekspresiju, kas novērtēta, izmantojot salīdzinošās kvantitatīvās noteikšanas metodi (Pfaffl, 2001). Pamatojoties uz stabilitātes analīzi, U6 snRNS un U87 scaRNS tika izmantotas kā atsauces gēns. Visas relatīvās kvantitatīvās vērtības tika novērtētas, izmantojot DataAssist programmatūru, v 3.0, izmantojot ΔΔCT metodi. miRNS dati ir ģenerēti, ievērojot MIQE vadlīnijas [31].
CISTANČE UZLABOS NIeru/NIeru FUNKCIJU
Paredzamo mērķa gēnu RT-qPCRcDNS sintēzei tika izmantots High Capacity cDNS reversās transkripcijas komplekts (Life Technologies, ASV). RT-qPCR reakcijas uz Bax, Bim, Caspase-3, Collagen 1, GDNF, PCNA, TGF -1, Bcl-2, Bcl-6, c-Myc, c -ret, ciklīna A, Map2k2, PRDM1, Six-2, Ki-67, MTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2, NOTCH1 un IGF1 gēnu veica SYBR Green Master Mix (Life Technologies, ASV ), ko nodrošina IDT1 Integrated DNA Technologies (1. tabula). Reakcijas tika veiktas ar kopējo tilpumu 20 μL, izmantojot 2 μL cDNS (atšķaidīts 1:30), 10 μL SYBER Green Master Mix (Life Technologies, ASV) un 4 μL katra konkrētā grunts (5 nM). Pastiprināšana un noteikšana tika veikta, izmantojot StepOnePlusTM Real-Time PCR sistēmu (Applied BiosystemsTM). Ct vērtības tika pārveidotas relatīvās ekspresijas vērtībās, izmantojot ΔΔCt metodi ar pēcnācēju metanefros datiem, kas normalizēti ar GAPDH kā atsauces gēnu [32].
imūnhistoķīmija,Auglis (n {{0}} katrā grupā) tika izņemts un nekavējoties fiksēts 4% paraformaldehīdā (0,1 M fosfāts, pH 7,4). Materiāli tika dehidrēti, diafānizēti un iekļauti paraplastā, un bloki tika sagriezti 5- μm biezās daļās. Histoloģiskās sekcijas tika deparafinētas un apstrādātas imunofluorescences un imūnoperoksidāzes noteikšanai. Sadaļas bija
inkubē ar bloķējošu šķīdumu (8 procenti liellopu augļa seruma, 2,5 procenti liellopu albumīna un 2 procenti vājpiena pulvera PBS). Pēc tam iestatiet ar primāro antivielu (anti-Six-2), kas atšķaidīta ar PBS, kas satur 1 procentu vājpiena, uz nakti un ledusskapī. Pēc mazgāšanas ar PBS sekcijas inkubēja ar specifisku sekundāro antivielu, kas konjugēta ar Alexa 488 fluoroforu, atšķaidīta tajā pašā buferšķīdumā, kas satur 1 procentu piena 2 stundas istabas temperatūrā. Pēc secīgas mazgāšanas ar PBS priekšmetstikliņi tika uzlikti ar segstikliņiem, izmantojot Vectashield dienasgaismas montāžas vidi (Vector Laboratories, Inc. Burlingame). Fluorescence paraugā tika noteikta ar lāzera konfokālo mikroskopiju. Attēli iegūti, izmantojot Focus Imagecorder Plus sistēmu. Tika veikta imūnhistoķīmija c-Myc, Ki-67, Bcl-2, TGF -1, - katenīnam, ZEB1, ZEB2, šķelto kaspāzes 3, ciklīna A un WT1 proteīniem. Priekšmetstikliņi tika hidratēti, un pēc 5 minūšu mazgāšanas PBS pH 7,2 antigēnu atgūšana tika veikta ar citrāta buferi pH 6.{23}} 25 minūtes spiediena katlā. Priekšmetstikliņi tika mazgāti PBS. Pēc tam 10 minūtes tumsā tika veikta endogēnās peroksidāzes blokāde ar ūdeņraža peroksīdu un metanolu. Sekcijas tika atkārtoti mazgātas PBS. Pēc tam tika bloķēta nespecifiskā saistīšanās, un priekšmetstikliņus 1 stundu inkubēja ar bloķējošu šķīdumu (5% vājpiena pulvera, PBS). Sekcijas tika inkubētas ar primāro antivielu (2. tabula), kas atšķaidīta ar 1 procentu BSA uz nakti ledusskapī. Pēc mazgāšanas ar PBS sekcijas tika pakļautas specifiskajai sekundārajai antivielai 2 stundas istabas temperatūrā. Priekšmetstikliņus mazgā ar PBS. Šķēles tika atklātas ar DAB (3,3'-diaminobenzidīna tetrahidrohlorīds, Sigma-Aldrich CO1, ASV). Pēc secīgas mazgāšanas tekošā ūdenī priekšmetstikliņi tika iekrāsoti ar hematoksilīnu, dehidrēti un piestiprināti ar segstikliņu, izmantojot Entellan1. Attēli tika iegūti, izmantojot fotomikroskopu (Olympus BX51) vai Zeiss LSM 780-NLO konfokālo ierīci Axio Observer Z.1 mikroskopā (Carl Zeiss AG, Vācija) no Nacionālā zinātņu un tehnoloģiju institūta par fotonikas izmantošanu šūnām. Bioloģija (INFABIC) Kampinasas Valsts universitātē.
Morfoloģijas kvantitatīvā noteikšanaParafīns 5 μmnieressadaļas tika analizētas, izmantojot CellSens Dimension programmatūru no fotomikroskopa (Olympus BX51). ThenieresŠķēlēm tika piekļūts, lai noteiktu nefrogēno zonu, CM un UB proteīnu un šūnu skaitu, hematoksilīna-eozīnu, kas iekrāsots 17-DG LP auglim (n=5), salīdzinot ar atbilstoši vecumam NP pēcnācējiem (n {{4). }}) no dažādām mātēm. Mēs kvantitatīvi noteicām katra analizētā metanefrosa CM un UB (4NP un 4LP no dažādām mātēm), un statistiskā analīze tika veikta ar t-testu, un vērtības tika izteiktas kā vidējais ± SD. P�0.05 tika uzskatīts par nozīmīgu. GraphPad Prism v01 Software, Inc., ASV, tika izmantota statistikas analīzei un figūru veidošanai.
Statistiskā analīzeTika izmantots t-tests, un vērtības tika izteiktas kā vidējā ± standartnovirze (SD). P�0.05 tika uzskatīts par nozīmīgu. GraphPad Prisma v. 01 programmatūra (GraphPad Software, Inc., ASV) tika izmantota statistiskai analīzei un attēlu veidošanai.
Rezultāti
MiRNS ekspresija ar miRNA-SeqIzprast mikroRNS izmaiņas, kas saistītas ar mātes zemu olbaltumvielu daudzumunieruprogrammējot, mēs veicām globālās miRNS profilēšanas analīzes izteiksmi. Tika identificētas 44 deregulētas miRNS (p � 0.05), no kurām attiecīgi 19 un 25 miRNS tika regulētas uz augšu vai uz leju (3. tabula). Visvairāk izteiktās miRNS un to funkcijas, ceļi un tīkli tika identificēti, izmantojot programmatūru Ingenuity (4. tabula).
MiRNS ekspresijas apstiprināšanaLP grupas dzīvniekiem Let{0}}a-5p, miR-181a-5p, miR-181c-3p tika paaugstināti regulēti, kamēr miR-127-3p, miR-144-3p un miR-199a-5p bija pazeminātas attiecībā pret NP dzīvniekiem. Rezultāti neuzrāda nekādas atšķirības miR{10}} izteiksmē, salīdzinot abas grupas (1. att.). 5. tabulā tika parādītas vērtības, kas iegūtas, veicot miRNS sekvencēšanu ar RT-qPCR validācijas datiem. Lai gan LP tika novērota nozīmīga miRNS ekspresijas atšķirība salīdzinājumā ar NP pēcnācējiem, apstiprināto miRNS locījuma izmaiņas (FC) bija līdzīgas abām metodēm.
miRNS gēnu mērķi
Dažādu miRNS paredzēto mērķu, piemēram, Six-2, Bcl-2, PRDM1, ciklīna A, PCNA, GDNF, kolagēna 1, kaspāzes 3 un Bim ekspresijas gēni LP būtiski neatšķīrās no NP. auglis. Tomēr Baksa, TGF -1 Bcl-6, c-ret, Map2k2, Ki-67, mTOR, -katenīna, ZEB1, ZEB2 un IGF1 gēnu ekspresija tika pārregulēta {{15. }}DG LP grupa, salīdzinot ar vecuma atbilstošām kontrolēm. Un otrādi, c-Myc un NOTHC1 tika samazināti pēcnācējiem, kuriem bija ierobežots mātes proteīns (2. attēls).
Augļa ķermeņa masa un metanefrosa morfometrija17-DG LP ķermeņa masa neatšķīrās no vecuma atbilstošā NP pēcnācēja. Tomēr LP metanefrosa mezenhīmā bija par 7,6 procentiem samazināts laukums un par 29 procentiem samazināts garozas biezums nekā NP grupā (3. attēls).ImūnhistoķīmijaŠajā pētījumā LP auglim bija ievērojams Six-2 cap fluorescences samazinājums (apmēram par 69 procentiem) nekā NP pēcnācējiem (4. attēls).
Sešu-2 imūnoperoksidāzes analīze parādīja samazinātu šūnu skaitu (14 procenti) LP CM, salīdzinot ar 28 procentiem samazinātu Six-2 plus šūnu skaitu, salīdzinot ar vāciņa laukumu, salīdzinot ar NP pēcnācējiem (4. attēls). Šis pētījums arī parādīja ievērojamu c-Myc CM un UB imūnkrāsotu šūnu procentuālo samazināšanos (mazāk par 14 procentiem) LP salīdzinājumā ar NP pēcnācējiem (4. attēls). Turklāt Ki-67 iezīmētās zonas procentuālais daudzums CM bija par 48 procentiem mazāks LP, salīdzinot ar NP augli, savukārt Bcl-2 un šķeltās kaspāzes-3 imūnreaktivitāte neatšķīrās no abām grupām (att. 5 un 6). Šis pētījums arī parādīja ievērojamu c-Myc CM un UB imūnkrāsotu šūnu procentuālo samazināšanos (mazāk par 14 procentiem) LP salīdzinājumā ar NP pēcnācējiem (4. attēls). Turklāt Ki-67 iezīmētās zonas procentuālais daudzums CM bija par 48 procentiem mazāks LP, salīdzinot ar NP augli, savukārt Bcl-2 un šķeltās kaspāzes-3 imūnreaktivitāte neatšķīrās no abām grupām (att. 5 un 6). No otras puses, LP CM un UB-katenīna iezīmētās platības bija attiecīgi palielinātas par 154 un 85 procentiem, salīdzinot ar NP pēcnācējiem (7. attēls). Tajā pašā laikā mTOR imūnreaktivitātes sadalījums arī aizņēma ievērojami plašāku laukumu LP CM (139 procenti) un UB (104 procenti) nekā NP auglim (7. attēls). LP pēcnācējiem TGF -1 UBS šūnu iekrāsošanā palielinājās (apmēram par 30 procentiem), savukārt CM imūnkrāsotās šūnas neatšķīrās no NP grupas (8. attēls). ZEB1 metanefrosa iekrāsotais, kas atrodas CM kodolu šūnās, LP uzlabojās par 30 procentiem, salīdzinot ar NP augli (8. attēls). Vienlaikus ZEB2 imunofluorescence, lai gan tā bija visās metanefros struktūrās, abās eksperimentālajās grupās bija līdzīga (8. attēls). Pašreizējais pētījums, ņemot vērā miRNS un mRNS ekspresiju un proteīnus
Diskusija
Ir palielinājušās zināšanas par nefroģenēzes šūnu un molekulārajiem mehānismiem [33–37]. Tomēr ir iesaistīti daudzi regulējoši faktori un signalizācijas ceļinieruontoģenēze paliek neskaidra [38]. miRNS ir izšķiroša loma gēnu ekspresijas regulēšanā laikānieruattīstība [25, 39–41]. Cik mums zināms, miRNS un mRNS ekspresijas analīzes mātes LP uzņemšanas 17-DG vīriešu mezenhīma šūnās nav veiktas. Mēs piedāvājam jaunu molekulāru mehānismu, kas iesaistīts agrīnas nefroģenēzes kavēšanā, kā rezultātā samazinās nefronu skaits. Mēs izmantojām NGS, lai novērtētu miRNS ekspresiju, un konstatējām, ka 19 miRNS tika paaugstinātas un 25 pazeminātas 17-DG LP, salīdzinot ar NP metanefrosu. Starp 10 labākajām deregulētajām miRNS mēs izvēlējāmies 7 miRNS ar bioloģiskiem mērķiem, kas iesaistīti proliferācijā, diferenciācijā un šūnu apoptozē. Gan miRNA-Seq, gan TaqMan datu analīze atklāja konsekventas un specifiskas izmaiņas miRNS ekspresijā LP dzīvniekiem, salīdzinot ar kontroles NP dzīvniekiem, kas atbilst vecumam.
MiR-181 saime sastāv no četriem ļoti konservētiem locekļiem, proti, miR-181a, miR-181b, miR-181c un miR-181d [ 42]. Neoplastiskajās šūnās miR{6}a darbojas kā audzēja nomācējs, kavējot šūnu proliferāciju un migrāciju un izraisot šūnu apoptozi [43]. Šis pētījums atklāja palielinātu miR-181a-5p ekspresiju 17-DG LP, salīdzinot ar vecuma atbilstības NP pēcnācējiem. Lai gan kaspāzes mRNS ekspresija nemainījās, Bax/Bcl-2 mRNS attiecības divkārša palielināšanās LP, salīdzinot ar NP pēcnācējiem, liecina par palielinātu apoptozi CM, norādot, ka apoptoze tiek regulēta pēc transkripcijas. Pētījumi liecina, ka BCL saime veicina citohroma izdalīšanos no mitohondrijiem un pēc tam kavē Casp3 aktivāciju, tādējādi kavējot šūnu apoptozi [44]. Li et al. izmantoja akūtu plaušu bojājumu modeli, lai atklātu, ka pārmērīga miR-181a ir saistīta ar samazinātu Bcl-2 proteīna līmeni; otrādi, miR-181a inhibīcija palielināja Bcl-2 līmeni [45]. Šis pētījums apstiprināja Lv et al. rezultātus, kuri parādīja, ka miR-181c regulē Six-2 ekspresiju un šūnu proliferāciju negatīvi, paralēli mezenhimālo šūnu fenotipa zudumam laikā.nieresattīstība LP 17-DG pēcnācējos [25].
Xiang et al. parādīja, ka palielināta miR{0}} izteiksme nomācnierukarcinomas proliferācija, kā rezultātā G2/M fāze ir īsāka. Turklāt Xiang et al. atklāja, ka miR-144 pārmērīga ekspresija kavē mTOR gēna un proteīna ekspresiju [46]. Nijland et al. parādīja, ka mTOR signālu palielināšanai ir izšķiroša nozīme, lai noteiktu nefronu skaitu embrijos, kuru mātes tika pakļautas uzturvielu ierobežojumiem [47]. Rapamicīna kompleksa 1 (mTORC1) zīdītāju mērķis ir būtisks embriju attīstībai; tomēr, kā šis komplekss regulē līdzsvaru starp augšanu un autofagiju fizioloģiskos apstākļos un vides stresa apstākļos, joprojām nav zināms [48]. Tāpēc mTOR signalizācija var būt iesaistīta šūnu reakcijās dzīvniekiem, kas grūsnības laikā pakļauti LP uzņemšanai; autofagijas uztverē, ierosināšanā un izbeigšanā; un reaģējot uz intracelulāro barības vielu pieejamību [46]. Hipotētiski smaga proteīna ierobežojuma laikā samazināta miR-144-3p ekspresija var būt saistīta ar palielinātu mTOR ekspresiju, attiecīgi aptuveni par 139 procentiem un 104 procentiem CM šūnās un UB, lai kompensētu nefronu zudumu {{ 11}}ĢD LP pēcnācēji Chen et al. definēja miR-127 kā jaunu šūnu novecošanās regulatoru, izmantojot Bcl-6 [49]. Pan et al. ziņoja, ka miR-127 nepietiekama ekspresija korelē ar palielinātu šūnu proliferāciju aknu šūnās [50]. Šis pētījums parādīja šūnu proliferācijas samazināšanos un būtisku to šūnu skaita samazināšanos, kas pozitīvi marķētas ar Ki-67 tādu dzīvnieku CM, kuriem ir ierobežots proteīnu saturs. Turklāt tika novērots nefrogēnās zonas un proliferācijas samazināšanās LP pēcnācējiem, kas atbilda Menendez-Castro et al. 8,4 procentiem proteīnu ierobežotu pēcnācēju [51, 52]. Tādējādi palielināta Ki-67 un Bcl-6 mRNS ekspresija kopā ar samazinātu miR-127-3p ekspresiju 17-DG LP vāciņā var būt saistīta ar pretregulācijas mehānismiem, lai uzturētu izplatīšana.
Sun et al. parādīja, ka miR-199a-5p pārmērīga ekspresija samazina cistisko šūnu proliferāciju un izraisa apoptozi, papildus kontrolējot šūnu ciklu [53]. Šajā pētījumā miR-199a-5p ekspresija ir samazināta 17-DG LP, ko papildina pastiprināta Ki-67, šūnu proliferācijas marķiera, un Map2k2 transkripcija. ir saistīta ar samazinātu Ki-67 reaktivitāti LP 17-DG metanefrosā. Tādējādi gestācijas nepietiekams uzturs veicina diferenciāciju, izmantojot pēctranskripcijas mehānismu. Proti, mūsu rezultāti atklāj cinka pirksta E lodziņu saistošā homeobox 1 (ZEB1), EMT induktora, represīvo lomu, kas saglabā cilmes šūnu pluripotenci embrionālo cilmes šūnu diferenciācijas laikā. Ir zināms, ka katenīns aktivizē kodola ZEB1 transkripciju, kā rezultātā rodas ZEB1 ekspresija [34]. TGF signalizācijas ceļš, viens no vislabāk pētītajiem ceļiem, var izraisīt EMT embrionālās attīstības laikā. Embrionālajai attīstībai ir nepieciešami vairāki TGF līdzīgi ligandi. Tomēr ne visi TGF mediētie efekti uz EMT ir atkarīgi no ZEB1/2, nokautās šūnas var izraisīt mezenhimālo gēnu fibronektīna un N-kadherīna ekspresiju. Tomēr E-kadherīns vairs netiek pazemināts, un veidojas arī aktīna šķiedras [54]. Karner et al. ziņoja, ka laikānieruattīstība, Wnt9b/ -catenin
signalizācijas ceļš, kas izteikts gan UB, gan CM, ir nepieciešams gan nefrona cilmes šūnu atjaunošanai, gan diferenciācijai, kas ir būtiska nefronu veidošanai embrioģenēzes laikā [55]. Evolūcijas ceļā saglabātajam Wnt9b/-catenin ceļam ir izšķiroša nozīme orgānu, audu attīstībā un traumu labošanā daudzšūnu organismos. Pētījums parādīja, ka c-Myc ir -katenīna transkripcijas mērķis, kas regulē tā proliferāciju un diferenciāciju.nierucauruļveida epitēlijs [56]. Pētītajos periodos palielinājās -katenīna ekspresija gēnu un olbaltumvielu līmenīnieruattīstība 17-DG LP auglim. Pan et al. ziņoja, ka Myc sadarbojas ar -catenin, lai veicinātu nefrona cilmes šūnu atjaunošanos [10]. Šeit, salīdzinot ar vecumam atbilstošiem NP pēcnācējiem, LP uzrādīja zemāku c-Myc ekspresiju. Tāpēc šiem dzīvniekiem var būt mazāka atjaunojamo šūnu rezerve, kas nepieciešama proliferācijai un izdzīvošanai, un tie var atspoguļot mazāku nefronu skaitu LP modelī. Turklāt,
Wnt/-catenin un Notch signālu ceļi var koordinēt Six-2 ekspresijas regulēšanu un ir iesaistīti Six-2 ekspresijas pazemināšanā nefrona cilmes šūnās. Pētījumi ir parādījuši, ka var būt nepieciešams zems -katenīna līmenis, lai saglabātu Six-2 ekspresiju un CM cilmes šūnas nediferencētā stāvoklī; turklāt paaugstināts katenīna līmenis nosaka nefrona cilmes šūnu likteni [57, 58]. Tādējādi mēs izvirzām hipotēzi, ka samazināta cMyc un Notch signalizācija kopā ar palielinātu -katenīna ekspresiju samazināja Six-2 ekspresiju par 28 procentiem 17-DG LP pēcnācējiem un korelē ar agrīnu CM šūnu diferenciāciju un samazinātu cilmes šūnu un nefronu skaits pieaugušā vecumā. Turklāt mūsu dati var liecināt, ka LP pēcnācēju MM šūnās palielināta Let-7a-5p un -katenīna ekspresija un samazināts Notch signāls var modulēt c-Myc, Six-2, un Ki-67 ekspresija, kas samazina priekšteču šūnu pašatjaunošanos. Atlikušo CM cilmes šūnu izsīkums izraisa nefronu skaita samazināšanos un arteriālās hipertensijas unnierutraucējumi pieaugušā vecumā (10. attēls). Saskaņā ar Boivin et al., mūsu rezultāti liecina, ka palielināts CM-katenīns traucē UB augšanu un nefroģenēzi [59]. Pētījumi ir parādījuši, ka augšanas faktora glial-atvasinātais neirotrofiskais faktors (GDNF), kas ir būtisks UB augšanas regulators, signalizē caur c-Ret tirozīna kināzes receptoru un Gfra1 kopreceptoru [60, 61]. 17-ĢD LP pēcnācēji, nozīmīgs
c-Ret receptoru kodējošās mRNS palielināšanās teorētiski izraisītu UB augšanas pieaugumu. Tomēr šajā pētījumā GDNF ekspresija nemainījās, kas liecina, ka, neskatoties uz cRet mRNS palielināšanos, UB sazarojums tika samazināts. Iepriekš mēs novērojām urētera pumpuru zaru samazināšanos par 28,3 procentiem pēc 14,5 dienu gestācijas proteīna ierobežojuma [4], kas varētu būt saistīts ar MM šūnu Six-2 marķējuma samazināšanos par 28%, neskatoties uz GDNF izmaiņām. transkripcija. -katenīns, iespējams, mijiedarbojas ar c-ret receptoru un tiek transportēts uz UB šūnas kodolu, veicinot TGF -1 ekspresiju epitēlija šūnās, kavējot UB sazarojumu un izraisot priekšlaicīgu CM cilmes šūnu diferenciāciju, kā redzams {{11} }DG LP pēcnācēji [62–64]. Tāpēc GDNF var nebūt būtisks, lai mediētu mezenhimālos signālus uz urīnizvadkanālu; tomēr mehānisms vēl ir jānoskaidro. Patiešām, mēs esam pierādījuši, ka MM no 17-DG LP pēcnācējiem uzrādīja specifisku Let-7 miRNS ekspresijas pieaugumu, kā rezultātā ievērojami pasliktinājāsnieresattīstību, tādējādi apstiprinot šo gēnu modulējošo lomu nefroģenēzes attīstības laikā [65].
Sākotnējos insulīnam līdzīgā augšanas faktora (IGF) pētījumos IGF-1 un -2 dominējošā loma augļa augšanā tika noskaidrota ar bagātīgiem, bet galvenokārt netiešiem pierādījumiem. Tika konstatēts, ka IGF darbojas kā proliferācijas un diferenciācijas faktori kultivētās augļa šūnās un pirmsimplantācijas embrijos. Turklāt tika konstatēts, ka IGF izdalās kultivētas augļa šūnas un eksplanti in vitro [66]. Augšanas faktori, tostarp IGF, var izraisīt daļēju vai pilnīgu epitēlija-mezenhimālo pāreju. IGF ceļu aktivizēšana izraisa EMT regulēšanu, inducējot ZEB1 ekspresiju [67]. Lai gan ir iesaistīti vairāki kandidātu izaugsmes faktorinieresnav zināms, vai tie ir iesaistīti nefroģenēzē. Dažādos laikos var būt nepieciešami dažādi augšanas faktori. Daži augšanas faktori šajā kontekstā var būt lieki. Embrionālās attīstības laikā ir nepieciešamas secīgas EMT un MET kārtas, lai diferencētu specializētus šūnu tipus un izveidotu trīsdimensiju struktūru. Šajā pētījumā tika konstatēts, ka mezenhimālā-epitēlija savstarpējā konvertējamība saglabā šūnu plastiskumu, kas liecina par ļoti inducējamas sistēmas klātbūtni LP apstākļos embrijam. Let-7 miRNS saimes ekspresija ir plaši pētīta dažādos augļa audos. Let-7 miRNS ekspresijas palielināšanās ir saistīta ar samazinātu proliferāciju un agrīnu MM šūnu diferenciācijas palielināšanos, un līdz ar to samazinātu nefronu skaitu [27, 15, 68–71]. Augstāka Let-7 ekspresija ir pierādīta augstākos organismos grauzēju smadzeņu embrioģenēzes pēdējā fāzē [72, 73]. Nagalakshmi et al. atklāja, ka Let-7 miRNS ekspresija mainīja UB epitēlija šūnu likteni no prekursora uz diferencētu stāvokli [71]. Turpretim Yermalovičs et al. parādīja, ka Lin28b, RNS saistošā proteīna, pārmērīga ekspresija ir saistīta ar nomācošām Let-7 miRNS. Lai gan lin28 un Let-7 ir zināmi ontogēnā laika regulētāji bezmugurkaulniekiem, to nozīme zīdītāju orgānu attīstībā nav saprotama [65]. Šajā pētījumā Let-7a-5p miRNS ekspresijas palielināšanās LP auglim varētu būt saistīta ar samazinātu CM šūnu proliferāciju, apdraudot nefroģenēzi attiecībā pret NP grupu. Tādējādi mēs izvirzām hipotēzi, ka CM šūnu proliferācijas nomākšana un agrīna nefroģenēzes pārtraukšana, ko izraisa palielināta Let-7 miRNS, var notikt tieši vai netieši, īslaicīgi samazinot Lin28b ekspresiju 17-DG LP. Šis efekts var ievērojami pasliktinātiesnieresattīstība 17-ĢD LP, apstiprinot, ka šis gēns regulē attīstības laiku nefroģenēzes laikā. Šajā pētījumā palielināta Let-7a-5p miRNS ekspresija sakrīt ar c-Myc ekspresijas samazināšanos. Myc ir iesaistīts proliferācijā, augšanā, apoptozē un šūnu diferenciācijānieruorganoģenēze [74–76]. LP 17-DG pēcnācējiem MM c-Myc gēna ekspresija bija samazināta, un CM c-Myc imūnreaktivitātes laukums bija par 14 procentiem mazāks, salīdzinot ar NP pēcnācējiem. Vienlaikus tika novērots CM šūnu skaita samazinājums par 14 procentiem, kas samazināja Ki-67 imūnreaktivitāti LP par 48 procentiem, salīdzinot ar NP pēcnācējiem. Konsekventi pētījumi ir parādījuši, ka c-Myc ir svarīga loma UB sazarošanās pēdējā fāzē un CM cilmes šūnu proliferācijas stimulēšanā [74].
CISTANČE UZLABOS NIeru/NIeru INFEKCIJU
samazināts līmenis cilmes šūnās, saglabājot tās nediferencētā stāvoklī. Tomēr šajā pētījumā spēcīga Let-7a-5p miRNS ekspresija CM samazināja c-Myc ekspresiju, tādējādi samazinot cilmes šūnu proliferāciju un agrīnu šūnu diferenciāciju LP 17-DG. pēcnācēji (10. att.). Pētījumi parnieresc-Myc transgēno pelēm atklāja vienlaicīgu c-Myc un S-ix-2 imūnpozitīvo CM šūnu samazināšanos, kas saistīta ar samazinātu cilmes šūnu proliferāciju [74]. Šis pētījums parāda ievērojamu (28 procenti) samazināšanos sešās -2 pozitīvās šūnās, īpašinierucilmes šūnu marķieris, tāpat kā nefronu skaita samazināšanās, 17-DG LP pēcnācēju CM salīdzinājumā ar NP pēcnācējiem. 2009. gadā Fogelgrēns u.c. pierādīja, ka sešu-2 gēnu ekspresija tiek samazināta augļa ontoģenēzes laikā, ja tā ir saistīta ar samazinātu nefronu skaitu, hipertensiju un hroniskunieru mazspēja[77]. Tādējādi samazināta Six-2 gēnu ekspresija CM cilmes šūnās norāda uz signāla izraisītas diferenciācijas nomākšanunieruattīstība 17-DG LP pēcnācējos. Tomēr atlaišana ir jāizmanto piesardzīgi — smalki nefroģenēzes defekti var kļūt acīmredzami, veicot detalizētāku analīzi vai dažādos apstākļos. IGF1 mRNS līmenis bija visaugstākais sākotnējā metanefriskās attīstības periodā, un transkripti tika atklāti visā MM, bet to līmenis samazinājās turpmākās attīstības laikā. Tomēr laikānieresembrioģenēze, smalks līdzsvars starp nefronu veicinošiem augšanas faktoriem (IGF1) un inhibējošiem augšanas faktoriem (TGF -1) regulē UB sazarojumu.
Secinājums
Lai gan vairāki autori ir pētījuši nefroģenēzi [34, 37, 78], maz ir zināms par mehānismiem, kas nosaka nefronu skaitu. Šis pētījums parāda, ka daudzas MM cilmes šūnu miRNS, mRNS un olbaltumvielas ir izmainītas 17-DG LP pēcnācējos, kas samazina proliferāciju un agrīnu šūnu diferenciāciju (11. attēls). Šis smalkais līdzsvars starp nefrona priekšteču atjaunošanos un diferenciāciju ir būtisksnieresattīstību, jo nespēja sasniegt atbilstošu nefronu skaitu ir hroniskas attīstības riska faktorsnierutraucējumi.
