Cistanche Herba ir antidepresanta efektivitāte hroniska neparedzama stresa gadījumā

Kontaktpersona: Odrija Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pasts:audrey.hu@wecistanche.com

Yang Li u.c

KOPSAVILKUMS

Nesen tika apstiprināts, ka Cistanche tubulosa, viena no Cistanches Herba sugām, piemīt antidepresantu efektivitāte hroniskā neparedzamā stresa (CUS) žurkām, atjaunojot zarnu mikrobiotas homeostāzi. Šajā rakstā mūsu mērķis ir izpētīt C. ​​tubulosa metabolisma profilu normālām un CUS izraisītām depresīvām žurkām in vitro un in vivo. Izmantojot UPLC-Q-TOF-MS, in vitro kuņģa-zarnu trakta metabolismu.Cistanche tubulosa ekstrakts(CTE) tika novērtēts gan normālām, gan CUS žurkām. Tajā pašā laikā CTE metabolisms in vivo(Cistanche tubulosa ekstrakts)normālām un nomāktām žurkām tika pētīta arī žurku urīnā un izkārnījumos. Kopā 20 un 26 metabolīti tika raksturoti no in vitro un in vivometabolisma attiecīgi normālām un CUS žurkām. CTE(Cistanche tubulosa ekstrakts)tika metabolizēts par aglikoniem un feniletanoīdu glikozīdu (PhG) un iridoīdu glikozīdu sadalīšanās produktiem, neatkarīgi no tā, vai žurku zarnu mikrobiota in vitro ir normāla vai nomākta. Aglikonu II fāzes metabolīti un PhG un iridoīdu glikozīdu sadalīšanās produkti bija galvenie metabolīti žurku urīnā un izkārnījumos. Turklāt vielmaiņas spēja radīt sekundāros glikozīdus un aglikonus depresīvā žurku zarnu mikrobiotā bija daudz vājāka nekā normālā žurku zarnu mikrobiotā, kas tika attiecināta uz nesakārtotajām glikozīdu hidrolāzēm, ko CUS nomāktām žurkām ražo zarnu mikrobiota. Šī pētījuma rezultāti lika pamatu CTE antidepresantu īpašību vielmaiņas procesa un terapeitiskā mehānisma izpratnei.

Atslēgvārdi: Cistanche tubulosa, Depresija Metabolisms, In vitro, In vivo, Zarnu mikrobiota

1. Ievads

Cistanches Herba ir oficiāli reģistrēts kā kaltēti sulīgi Cistanche deserticola (YC Ma) un C. tubulosa (Schrenk) stublāji, ko izmanto nieru mazspējas, impotences, sieviešu neauglības, morbidleukorejas, bagātīgas metrorāģijas un senils aizcietējumu ārstēšanai [1]. Mūsdienu farmakoloģiskie pētījumi ir parādījuši, ka Cistanches Herba piemīt dažādas bioloģiskas aktivitātes, piemēram, pret neirodeģenerāciju, imūnregulāciju un pretiekaisuma iedarbību [2,3]. Mūsu iepriekšējās izmeklēšanas to ir apstiprinājušasCistanche tubulosa ekstrakts(CTE), kas sastāv no 48,6% feniletanoīdu glikozīdu (PhG), 6,9% iridoīdu glikozīdu un 2{5}},0% kopējo saharīdu, var ievērojami atvieglot hroniska neparedzama stresa (CUS) izraisītu depresīvu žurku depresijas simptomus. zarnu mikrobiotas homeostāzes atjaunošana [4]. Jaunākie pētījumi liecina, ka izmaiņas zarnu mikrobiotas sastāvā bija saistītas ar depresijas attīstību un progresēšanu [5,6]. CUSdepresīvo modeļu žurkām mikrobu ģinšu relatīvais daudzums bija ievērojami traucēts, salīdzinot ar parasto kontroli [7]. Pacientiem ar depresiju ievērojami mainījās arī zarnu mikrobiotas daudzveidība un bagātība [8]. Turklāt dažādi savienojumi, tostarp feniletanoīdu glikozīdi (PhG) un iridoīdie glikozīdi, tika uzskatīti par galvenajām Cistanches Herba sastāvdaļām [2,3], kas tika viegli metabolizēti to sekundārajos glikozīdos un aglikonos, ieskaitot hidroksitirozolu (HT), 3,4-dihidroksifenetil. glikozīds, deglikozilētā genipozidīnskābe utt., ko izraisa cilvēka zarnu mikrobiota. Šie metabolīti ir vieglāk uzsūcas caur zarnām, un tiem ir bioloģiska aktivitāte, kas atbilst prototipa komponentam[9–11]. Tādējādi mēs uzskatām, ka depresijas rašanās un attīstības laikā zarnu mikrofloras struktūras traucējumi neizbēgami ietekmēs perorālo tradicionālo ķīniešu zāļu (TCM) metabolismu kuņģa-zarnu traktā, papildus ietekmējot saimnieka fizioloģisko stāvokli. Lielākā daļa esošo Cistanches Herba vielmaiņas datu iegūti no vielmaiņas pētījumiem ar veseliem dzīvniekiem[12–15]. Tāpēc klīniski nozīmīgāk būtu izpētīt CTE vielmaiņas profilu(Cistanche tubulosa ekstrakts)patoloģiskajā stāvoklī, lai noskaidrotu tā bioaktīvos komponentus un izprastu tās antidepresīvās iedarbības mehānismu.

Šajā pētījumā mūsu mērķis ir raksturot CTE vielmaiņas profilus(Cistanche tubulosa ekstrakts)gan veselām, gan CUS izraisītām depresijas modeļa žurkām, izmantojot ultra-efektivitātes šķidruma hromatogrāfijas kvadrupola lidojuma laika masas spektrometriju (UPLC-Q-TOF-MS). Lai modelētu CTE vielmaiņas procesu, ir izmantota normālu un depresīvu patoloģisku žurku kuņģa sula, zarnu šķidrums un mikrobiota.(Cistanche tubulosa ekstrakts)kuņģa-zarnu traktā in vitro, neatkarīgi un secīgi. In vivo metabolīti tiek noskaidroti arī pēc CTE perorālas lietošanas(Cistanche tubulosa ekstrakts)normālām un CUS žurkām. Šis pētījums sniedz jaunu ieskatu CTE metabolismā un aktīvajos metabolītos(Cistanche tubulosa ekstrakts)pret depresiju.

2. Materiāls un metodes

2.1. Materiāls

Žāvēti C. tubulosa stublāji tika savākti no Hetian apgabala (Sjiņdzjana, Ķīna). Kupona paraugus autentificēja prof. Sjaobo Li, un tie tika deponēti Šanhajas Dzjao Tongas universitātes (Šanhaja, Ķīna) Farmācijas skolas herbārijā. Ekstrakcijas metode tika izmantota, kā norādīts mūsu iepriekšējā publikācijā [4]. TheCistanche tubulosa ekstrakts(CTE) paraugi tika uzglabāti 4 grādu temperatūrā un pirms lietošanas atkārtoti izšķīdināti ar sterilu ūdeni. CTE sterilie ūdens šķīdumi(Cistanche tubulosa ekstrakts)pēc tam paraugi tika filtrēti caur 0,22 μm membrānu, un filtrāti tika savākti sterilās mēģenēs.

Ehinakozīdu nodrošināja Dr. Pengfei Tu laboratorija, Pekinas Universitāte (Pekina, Ķīna). Akteozīds, izoakteozīds, 2′-acetilakteozīds un cistanozīds A tika iegādāti no Sichuan Weikeqi BiologicalTechnology Co., Ltd. (Chengdu, Ķīna). Hidroksitirozols, kofeīnskābe, 3,4-dihidroksibenzolpropionskābe, 3-hidroksifenilpropionskābe un 3-fenilpropionskābe tika iegādātas no uzņēmuma Aladdin IndustrialInc. (Šanhaja, Ķīna). Katra komponenta tīrība tika noteikta ar HPLC-UV > 95 procentiem. HPLC kvalitātes acetonitrils tika iegādāts no Merck (Darmštate, Vācija). Dejonizēts ūdens tika sagatavots no destilēta ūdens, izmantojot Milli-Q ūdens attīrīšanas sistēmu (Millipore, Bedford, MA, ASV). Visi pārējie izmantotie reaģenti un ķīmiskās vielas bija analītiskas kvalitātes.

2.2. Eksperimenti ar dzīvniekiem

Sprague-Dawley žurku tēviņi (200 ± 20 g) tika iegūti no Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Pekina, Ķīna) un tika izmitināti Šanhajas JiaoTong universitātes (Šanhaja, Ķīna) laboratorijas dzīvnieku centrā. Dzīvnieki tika izmitināti grupās kontrolētā istabas temperatūrā (25 ± 2 grādi, 55 ± 10 procenti relatīvā mitruma) ar 12:12 h gaismas-tumsas ciklu. Žurkām 1 nedēļu tika atļauts brīvi piekļūt parastajam laboratorijas žurku ēdienam un ūdenim. Dzīvnieku iekārtas un protokolus apstiprināja Šanhajas Jiao Tong universitātes (Šanhaja, Ķīna) Dzīvnieku ētikas komiteja.

Pēc vienas nedēļas aklimatizācijas divpadsmit naivas žurkas tika nejauši sadalītas divās grupās (n=6), kontroles grupā un hroniskā neparedzamā stresa (CUS) grupā. CUS žurkas tika izstrādātas tāpat kā mūsu iepriekšējā ziņojumā [4], kuras tika pakļautas dažādiem stresa faktoriem: baltajam troksnim (100 dB) 1 stundu, zemas intensitātes stroboskopiskam apgaismojumam naktī (120 zibspuldzes/min), ūdens trūkumam 24 stundas, tukšai. ūdens pudeles uz 1 stundu (pēc ūdens atņemšanas), pārtikas trūkums 24 stundas, fiziski ierobežojumi (1-2 h), piespiedu peldēšana (5 min), netīrs būris 24 stundas (200 ml ūdens 100 g zāģu skaidu pakaišos), astes saspiešana ( 1 min), trieciens 30 min, 45 grādu sprosts slīpums 24 stundas un nakts apgaismojums (12 h). Stresa faktori tika lietoti nepārtraukti un nejauši 4 nedēļas, detalizēts izkārtojums ir aprakstīts S1 tabulā. Pēc 4 nedēļu stresa saharozes izvēles tests, atklātā lauka tests un novitātes nomāktās barošanas tests tika veikts, kā aprakstīts iepriekš [4]. CUS un uzvedības testa izklāsts ir parādīts S1 attēlā. Pēc uzvedības testiem no katras žurkas tika iegūtas vismaz 4 fekāliju granulas un ievietotas sterilās koniskās mēģenēs CTE in vitro analīzei.(Cistanche tubulosa ekstrakts)vielmaiņa.

2.3. CTE kuņģa-zarnu trakta metabolisms(Cistanche tubulosa ekstrakts)ar normālu un CUS žurkām in vitro

2.3.1. CTE metabolisms(Cistanche tubulosa ekstrakts)imitētās kuņģa un zarnu sulās

Piecdesmit miligrami CTE(Cistanche tubulosa ekstrakts)tika pievienoti attiecīgi 10 ml imitētas kuņģa sulas un zarnu sulas. Tad CTE(Cistanche tubulosa ekstrakts)tika inkubēts 37 grādu temperatūrā 4 stundas kuņģa sulā un 6 stundas zarnu sulā. Kultivētais maisījums (1 ml) tika atdzesēts ar 3 ml ar ūdeni piesātināta n-butanola tūlīt pēc 0 un 4 stundām kuņģa sulā un pēc 0 un 6 stundām zarnu sulā. Izmantotā parauga apstrādes metode bija tāda, kā aprakstīts iepriekš [9].

2.3.2. CTE metabolisms(Cistanche tubulosa ekstrakts)ar normālu un CUS žurku zarnu mikrobiotu

Svaigi normāli un CUS žurku fekāliju paraugi vispirms tika sajaukti un homogenizēti ar 25 reizes lielāku GAM buljona tilpumu. Nogulsnes tika noņemtas, filtrējot caur trim marles gabaliņiem. Pēc tam suspensiju inkubēja 37 grādu temperatūrā anaerobā inkubatorā, kurā gaiss tika aizstāts ar gāzu maisījumu (H2 5 procenti, CO2 10 procenti, N2 85 procenti). Piecdesmit miligramus CTE pievienoja 5 ml normālai un CUS žurku fekāliju suspensijai atsevišķi, un suspensiju inkubēja 37 grādu temperatūrā 48 stundas. Kultivētais maisījums tika noņemts un ekstrahēts ar ūdeni piesātinātu n-butanolu 0, 12, 24 un 48 stundās. Paraugu apstrādes metode tika aprakstīta iepriekš [9].

2.3.3. CTE secīgs metabolisms(Cistanche tubulosa ekstrakts)ar kuņģa sulu, zarnu sulu, normālu un CUS žurku zarnu mikrobiotu

Pirmkārt, 100 mg CTE(Cistanche tubulosa ekstrakts)tika pievienots 1{{10}} ml simulētās kuņģa sulas un inkubēts 37 grādu temperatūrā 4 stundas. Visa reakcija tika apturēta ar n-butanola, kas piesātināts ar ūdeni 3 reizes, un centrifugēts pie 3000 apgr./min 15 minūtes, kam sekoja supernatanta iztvaicēšana slāpekļa straumē. gāze 37 grādos. Otrkārt, atlikumu atkārtoti izšķīdināja 0, 4 ml sterila ūdens, pievienoja 8 ml imitētas zarnu sulas un inkubēja 37 grādos 6 stundas. Tādā pašā veidā tika sagatavots paraugs ar kuņģa sulu. Visbeidzot, atlikumu atkārtoti izšķīdināja 0, 3 ml sterila ūdens, pievienoja attiecīgi 6 ml normālu un CUS žurku fekāliju suspensiju un inkubēja 37 grādu temperatūrā 48 stundas anaerobā inkubatorā. Vienu mililitru reakcijas dzēsa ar 3 ml ar ūdeni piesātināta n-butanola tūlīt pēc 0 un 4 stundām kuņģa sulā, pēc 0 un 6 stundām zarnu sulā un pēc 0, 12, 24 un 48 stundām žurku zarnu mikrobiotā. . Paraugs tika apstrādāts identiski CTE(Cistanche tubulosa ekstrakts)imitētā kuņģa sulā.

2.4. CTE metabolisms(Cistanche tubulosa ekstrakts)ar normālu un CUS žurkām in vivo

Katra žurka abās grupās tika izmitināta atsevišķā vielmaiņas būrī. Pēc nakts badošanās, kas ļāva tikai brīvi piekļūt ūdenim, visām žurkām caur agastrālo zondi iekšķīgi ievadīja 2 ml ūdens. Tukši urīna un fekāliju paraugi tika savākti no visām žurkām no 0 h līdz 12 stundām. Turklāt CTE(Cistanche tubulosa ekstrakts)(400 mg/kg) tika ievadīts ar zondi. Urīna un fekāliju paraugi tika savākti no 0 līdz 24 stundām. Visi urīna un fekāliju paraugi nekavējoties tika uzglabāti -80 grādu temperatūrā.

Urīna un fekāliju paraugi no normālām un CUS žurkām tika iepriekš apstrādāti, kā aprakstīts iepriekš [12]. Visi iegūtie paraugi tika analizēti ar UPLC-Q-TOF-MS.

2.5. Analītiskā metode

UPLC tika veikta Waters ACQUITY UPLC sistēmā (WatersCorp., Milford, MA, ASV) ar ACQUITY UPLC BEH C18 kolonnu (100 mm × 2,1 mm id, 1,7 μm, Waters Corp. , ASV), izmantojot gradienta eluēšanu, izmantojot {{10}},1 procentu skudrskābes acetonitrilu (A) un 0,1 procentu skudrskābes ūdenī (B) ar plūsmas ātrumu 0,4 ml/min. . Gradienta profils bija: 0–5 min (A: 5–20 procenti), 5–7,5 min (A: 20–30 procenti), 7,5–10 min (A: 30–70 procenti), 10–11 min (A) : 70–100 procenti), un tika turēts 1,5 minūtes. Gradients tika atgriezts līdz 5 procentiem 0,5 minūtēs un tika noturēts 2,5 min nākamajam braucienam. Injekcijas tilpums bija 3 μL. Kolonnas krāsns temperatūra tika iestatīta uz 35 grādiem.

Masu spektrometrija tika veikta, izmantojot Waters Vion IMS masas spektrometru (Waters Corp., Milford, MA, ASV). Jonizācija tika veikta negatīvā elektrosmidzināšanas (ESI−) režīmā. MS parametri bija šādi: kapilārais spriegums, −2.0 kV; konusa spriegums, 20 V; avota temperatūra, 120 grādi; desolvatācijas temperatūra, 500 grādi ; konusa un desolvācijas gāzes plūsmas, attiecīgi 50 un 1000 l/h. Precīzai masas mērīšanai leicīns-enkefalīns tika izmantots kā bloķēšanas masa, lai radītu [M–H]– jonu (m/z 554,2615). MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) eksperiments divās skenēšanas funkcijās tika veikts šādi: 1. funkcija (zema enerģija): m/z 50–1000, 0,25 s skenēšanas laiks, 0,02 s starpskenēšanas aizkave, 6 eV sadursmes enerģija; 2. funkcija (augsta enerģija): m/z50–1000, 0,25 s skenēšanas laiks, 0,02 s starpskenēšanas aizkave, sadursmes enerģijas rampa 20–45 eV.

2.6. Datu apstrāde

Dati tika apstrādāti, izmantojot UNIFI 1.8.1 programmatūru (Waters Corp., Milforda, MA, ASV), lai identificētu metabolītus precīzos pilnas skenēšanas neapstrādātajos datos, kas savākti, izmantojot MSE. Savienojumi tika identificēti, pamatojoties uz precīzu masu, fragmentiem augstas enerģijas masas spektrometrijā. Intensitātes slieksnis tika iestatīts kā 100,0. Mērķa identifikācija, fragmentu atbilstības pielaide un citi parametri tika iestatīti automātiski.

3. Rezultāti

3.1. CUS izraisītās depresijas žurkas uzvedības izmaiņas

Žurkas ar CUS izraisītiem depresijas simptomiem tika novērtētas, izmantojot uzvedības testus, tostarp saharozes izvēles testu, atklātā lauka testu un novitātes nomāktas barošanas testu. Studenta t-tests atklāja, ka saharozes izvēle saharozes izvēles testā (p < 0,001),="" kopējais="" nobrauktais="" attālums="" atklātā="" lauka="" testā="" (p="">< 0,001)="" un="" latentums="" ēst="" novājinātas="" barošanas="" testā="" (p="">< 0,01)="" bija="" nozīmīgi.="" atšķiras,="" salīdzinot="" ar="" kontroles="" grupu="" pēc="" 4-nedēļas="" cus="" terapijas="" (1. att.).="" šie="" atklājumi="" liecināja,="" ka="" hroniskā="" neparedzamā="" stresa="" modelis="" ir="" veiksmīgi="">

3.2. CTE ķīmisko sastāvdaļu raksturojums(Cistanche tubulosa ekstrakts)

Visaptveroša CTE prototipu sastāvdaļu analīze(Cistanche tubulosa ekstrakts)tika veikts ar UPLC-Q-TOF-MS. Kopumā 27 komponenti no CTE(Cistanche tubulosa ekstrakts)tika atklāti un provizoriski raksturoti, tostarp 20 PhG, 5 iridoīdi un iridoīdi glikozīdi un 2 oligosaharīdi. Sīkāka informācija, ieskaitot aiztures laiku, precīzus MS un MS/MS fragmentu jonus, ir norādīta papildinformācijā (S2 tabula), lai sniegtu ieskatu šo ķīmisko sastāvdaļu struktūrā. CTE UPLC-Q-TOF-MS kopējā jonu hromatogramma (TIC) tika parādīta S2 attēlā.

3.3. CTE kuņģa-zarnu trakta metabolisms(Cistanche tubulosa ekstrakts)ar normālu un CUS žurkām in vitro

Šajā pētījumā potenciālie CTE metabolīti(Cistanche tubulosa ekstrakts)ar normāliem un CUSrats in vitro tika atklāti no TIC un identificēti ar elementu sastāvu un MS/MS fragmentu masas spektru kombināciju pēc to salīdzināšanas ar kontroles paraugiem. Visi CTE metabolīti(Cistanche tubulosa ekstrakts)simulētās kuņģa un zarnu sulās normāla un CUS žurku zarnu mikrobiota ir norādīta 1. tabulā.

3.3.1. CTE metabolisms(Cistanche tubulosa ekstrakts)imitētās kuņģa un zarnu sulās

Septiņi CTE metabolīti(Cistanche tubulosa ekstrakts)simulētajā kuņģa sulā tika provizoriski identificētas pēc precīzas masas un MSE fragmenta informācijas: M1 (m/z315.1074, C14H20O8, 1.66 min), M4 (m/z 459.1501, C20H28O12,2.36 min), M5 (m/z 45,0 C10H 45,10,1. 2,60 min), M7 (m/z179,0338, C9H8O4, 2,85 min), M12 (m/z 785,2481, C35H46O20, 4,77 min), M16 (m/z 827,2580, C37H48O23 min, 3 min, 18 m),/5 m. .1968, C29H36O15, 5,81 min). Deglikozilēšana, dehidroksilēšana, dehidrogenēšana un izomerizācija tika uzskatīta par galvenajiem CTE metabolisma ceļiem kuņģa sulā. Tika konstatēts, ka M4 un M5 molekulmasa ir par 2 Da un 16 Da mazāka nekā to prototipa komponentam dekofeoilakteozīdam, un tādējādi tie tika identificēti kā attiecīgi dehidrogenēti un dehidroksilēti produkti. M12 tika identificēts kā ehinakozīda izomērs, kas ražo tādus pašus jonus kā ehinakozīds pie m/z 623,2178, 477,1601, 315,1055, 161,0237.

Tie paši metabolīti tika atklāti pēc CTE(Cistanche tubulosa ekstrakts)inkubācija zarnu sulā. Jāatzīmē, ka kofeoilgrupa PhGs C-6′ pozīcijā tika viegli metabolizēta ar gremošanas enzīmiem zarnu sulā, lai iegūtu dekofeila metabolītus un kofeīnskābi.

3.3.2. CTE metabolisms(Cistanche tubulosa ekstrakts)ar normālu un CUS žurku zarnu mikrobiotu

Kopā no CTE bioloģiski pārveidoti 20 metabolīti(Cistanche tubulosa ekstrakts)normālā rota-zarnu trakta mikrobiota tika atklāta un identificēta (2. att.). No šiem rezultātiem tika novērots, ka PhG tika sadalīti par aglikona hidroksitirozolu (HT) M2 (m/z 153,0550, C8H10O3, 1,78 min) un kofeīnskābi (CA) M7 (m/z 179,0338, C9H8O4, 2,85 min). tika tālāk metabolizēti līdz M3 (m/z 163,0390, C9H8O3, 2,02 min), M6 (m/z181,0501, C9H10O4, 2,76 min), M10 (m/z 195,0655, C10H12O4, C10H12O4, 4,15 min) un 4,15 min. , C9H10O3, 4,36 min), izmantojot dehidroksilēšanu, reducēšanu un metilēšanu. Turklāt centrālie vielmaiņas ceļi, kas radīja PhG prototipa savienojumu tiešus metabolītus no CTE normālā žurku zarnu mikrobiotā, ir reducēšana, metoksilēšana, deglikozilēšana, kofeoilgrupa, dehidrogenēšana un izomerizācija.

Pēc inkubācijas CUS izraisītā depresijā žurku zarnu mikrobiota, CTE(Cistanche tubulosa ekstrakts)tika pārveidots par 20 metabolītiem, izmantojot tos pašus vielmaiņas ceļus kā parastajām žurkām.

3.3.3. Secīgs CTE metabolisms ar kuņģa sulu, zarnu sulu, normālu un CUS žurku zarnu mikrobiotu

Pēc secīgas inkubācijas kuņģa sulā, zarnu sulā, normālā un CUS žurku zarnu mikrobiotā, CTE(Cistanche tubulosa ekstrakts)tika metabolizēts līdz 14 metabolītiem (tostarp 8 ar kuņģa sulu, 7 ar zarnu sulu, 11 ar normālu un 10 ar CUS žurku zarnu mikrobiotu). Starp tiem M2(HT) un M11 (3-hidroksifenilpropionskābe, 3-HPP) bija PhG galīgie metabolīti pēc secīgas CTE inkubācijas.(Cistanche tubulosa ekstrakts)kuņģa sulā, zarnu sulā un zarnu mikrobiotā. Nebija būtisku atšķirību metabolītos starp normālu un CUS žurkām.

M8, M9, M14, M17, M19 un M20 neatkarīgajā CTE metabolismā konstatēja tikai normāla un CUS žurku zarnu mikrobiota. Šie metabolīti galvenokārt bija vielmaiņas starpprodukti, kas CTE secīgā metabolisma izpētē bija pilnībā metabolizēti galīgajos metabolītos, un tāpēc tos ir grūti noteikt.

3.3.4. Atšķirības starp CTE vielmaiņas ātrumu pēc normālas un CUS racionālas mikrobiotas

Lai noskaidrotu atšķirības starp CTE vielmaiņas ātrumu(Cistanche tubulosa ekstrakts)ar normālu un CUS žurku zarnu mikrobiotu, 27 prototipu savienojumu un 20 metabolītu relatīvais saturs pēc inkubācijas ar kuņģa sulu, zarnu sulu, normālu un CUS žurku zarnu mikrobiotu tika noteikts atsevišķi un secīgi (S3 un S4 tabulas). Rezultāti liecināja, ka, lai gan starp CTE nebija būtisku atšķirību(Cistanche tubulosa ekstrakts)normālu un depresīvu žurku metabolīti, tika novērota būtiska atšķirība to vielmaiņas ātrumos. Piemēram, C2 un C5 tika identificēti kā 8-epilogānskābe vai tās izomērs. Normālos paraugos tie tika pilnībā metabolizēti 12 stundu inkubācijas laikā. Tomēr patoloģiski nomāktā žurku zarnu mikrobiotā tie tika rūpīgi metabolizēti pēc 48 stundu inkubācijas. Bija skaidrs, ka vielmaiņas ātrums normālām žurkām bija ātrāks nekā CUS žurkām. Līdzīgi rezultāti tika atklāti no C18 (izoakteozīda). Turklāt jāatzīmē, ka M12 (ehinakozīda izomerizācija) un M16 (tubulozīda A izomerizācija) pīķa laukums normālos paraugos bija daudz lielāks nekā CUS paraugos, norādot, ka CTE izomerizācijas reakcija.(Cistanche tubulosa ekstrakts)bija vairāk izplatīta normālu žurku zarnu mikrobiotā nekā depresijas žurku zarnu mikrobiotā.

3.4. CTE metabolisms normālām un CUS žurkām in vivo

Salīdzinot ar CTE ārstētās grupas bioloģiskos paraugus ar tukšajiem bioloģiskajiem paraugiem, kopā tika iegūti 26 CTE metabolīti (1.–26. savienojums)(Cistanche tubulosa ekstrakts)tika konstatētas neparastas un CUS žurkas (2. tabula). Tipiskās UPLC hromatogrammas parastajiem un CUS žurku urīna paraugiem ir parādītas 3. attēlā.

3.4.1. CTE metabolītu raksturojums normālā un CUS raturīnā

Kopā 18 in vivo CTE metabolīti(Cistanche tubulosa ekstrakts)normālos žurku urīna paraugos tika provizoriski identificēti. PhG noārdīšanās metabolīti, tostarp HT un CA, un to turpmākā sulfācija (savienojums 1, 2, 3, 5, 8 un 16), metilēšana (6, 21, 22 un 24) un metoksilācijas (13 un 14) metabolīti bija galvenie metabolīti normālā žurku urīnā. Iridoīdie glikozīdi tika viegli metabolizēti par aglikoniem (23, 25 un 26), izmantojot degglikozilāciju. Jāatzīmē, ka parastajā žurkas urīna paraugā netika atklāts prototipa komponents.

Depresīvā žurku urīna paraugā 22 CTE metabolīti(Cistanche tubulosa ekstrakts)tika atklāti un raksturoti. Patoloģiskajā žurkas urīnā tika atklāts viens savienojuma prototips, 8-epilogānskābe. Citi metabolīti atbilda tiem, kas atrodami normālā žurku urīnā, tostarp sulfētie metabolīti (1, 2, 3, 8, 10 un 16), metilēti metabolīti (6, 11, 19 un 22), metoksilētie metabolīti (13 un 14). HT un CA, un iridoīdu glikozīdu aglikonus (25 un 26).

3.4.2. CTE metabolītu raksturojums(Cistanche tubulosa ekstrakts)parastajās un CUS žurku izkārnījumos

Šajā pētījumā tikai viens CTE metabolīts (20. savienojums, 3-HPP).(Cistanche tubulosa ekstrakts)tika identificēts normālos žurku izkārnījumos. Lielākā daļa PhG vispirms tika noārdītas līdz CA, un līdz ar to tika tālāk metabolizēti par tā galveno mikrobu metabolītu 3-HPP. Izkārnījumu paraugā no CUS žurkas tika rūpīgi raksturoti 3 metabolīti, tostarp sulfatētais 3-HPP (16. savienojums) un sulfāts HT (2. un 3. savienojums).

3.4.3. Atšķirības starp CTE in vivo metabolītiem normālos un CUSrats

Pēc CTE perorālas lietošanas(Cistanche tubulosa ekstrakts), in vivo metabolīti uzrādīja acīmredzamas atšķirības veselām un depresīvām žurkām. 21 metabolīts (savienojums 1–3, 5, 6, 8–14, 16, 17 un 19–26) tika atklāts gan veselu, gan CUS žurku paraugos. Savienojums 23 (deglikozilētā genipozīnskābe) tika identificēts tikai veselu žurku paraugos, savukārt savienojumi 4 (HT), 7 (8-epilogānskābe), 15 (3, 4-dihidroksibenzolpropionskābe) un 18 ({{ 19}}HPP glikuronīda konjugācija) tika konstatētas tikai CUS modeļa žurku paraugos. Rezumējot, prototipa sastāvdaļas tika atklātas tikai CUS žurkām, bet vairāk II fāzes metabolīti tika atklāti normālām žurkām.

4. Diskusija

Šajā pētījumā neatkarīgi un secīgi tika izmantoti trīs in vitro inkubācijas modeļi, tostarp kuņģa sula, zarnu sula, normāla un CUS žurku zarnu mikrobiota, lai izpētītu CTE kuņģa-zarnu trakta vielmaiņas profilu.(Cistanche tubulosa ekstrakts)in vitro. Tika konstatēts, ka PhGsand iridoīdu glikozīdi CTE(Cistanche tubulosa ekstrakts)CUS izraisīta depresīva žurku zarnu mikrobiota viegli metabolizēja to sekundāros glikozīdos un aglikonos. Pēc tam CTE metabolisms in vivo(Cistanche tubulosa ekstrakts)tika pārbaudīts arī normālām un CUS žurkām. Ierosinātie CTE vielmaiņas ceļi(Cistanche tubulosa ekstrakts)veselām un CUS izraisītām depresīvām žurkām ir parādītas 4. attēlā. PhGs, piemēram, ehinakozīds un akteozīds, tika metabolizēti par HT un CA, un CA tika tālāk metabolizēts par savu galveno mikrobu metabolītu 3-HPP. Pēc tam HT, CA un 3-HPP tika metabolizēti par sulfētiem, metilētiem un metoksilētiem metabolītiem. Iridoīdie glikozīdi, tostarp genipozidīnskābe, kankanosīds A un kankanosīds N, tika metabolizēti to aglikonos deglikozilēšanas ceļā. Tie arī parādīja, ka PhG un iridoīdi glikozīdi CTE(Cistanche tubulosa ekstrakts)CUS žurkām tika viegli metabolizēti par sekundārajiem glikozīdiem un aglikoniem. Šie metabolīti parasti uzrāda labāku uzsūkšanos zarnās un biopieejamību, lai pēc tam uzsūktos asinīs, lai radītu bioloģisku aktivitāti [16–18]. Ir vērts atzīmēt, ka izomerizācija bija izplatīta PhG kuņģa-zarnu traktā, attiecīgie metabolīti tika identificēti pēc salīdzināšanas ar to prototipu savienojumu UPLC aiztures laiku, pamatojoties uz optimizētu ideālo UPLC gradienta profilu.

Kofeīnskābe bija galvenais CTE noārdīšanās produkts(Cistanche tubulosa ekstrakts)ar depresīvu patoloģisku žurku zarnu mikrobiotu. Iepriekšējās publikācijās tika ziņots, ka kofeīnskābe rada antidepresīvu efektu, veicot piespiedu peldēšanas testu pelēm. Gan no smadzenēm iegūtā neirotrofiskā faktora (BDNF) mRNS līmenis frontālajā garozā, gan TrkB mRNS līmenis amigdalā bija ievērojami pazemināts pēc piespiedu peldēšanas testa, un iepriekšējo samazinājumu ievērojami kavēja kofeīnskābe [19]. Hidroksitirozols bija PhG aglikons, kas aizsargā neiroģenēzi un kognitīvās funkcijas, novēršot stresa izraisītu nervu proteīna BDNF pazemināšanos [20]. Tādējādi ir jāpievērš lielāka uzmanība dažiem bioaktīviem metabolītiem (ti, HT un CA), kurus pēc perorālas lietošanas pārveido zarnu mikrobiota.

Turklāt šie atklājumi sniedz pierādījumus tam, ka depresīvā zarnu mikrobiotā vielmaiņas spēja radīt sekundāros glikozīdus un aglikonus bija ievērojami vājāka nekā neparastajai žurku zarnu mikrobiotai. Iemesls, visticamāk, ir depresijas izraisītas zarnu mikrobiotas strukturālās izmaiņas, kas izraisa zarnu mikrobiotas ražoto metabolisko enzīmu aktivitātes samazināšanos [21]. Interesanti, ka iepriekšējais pētījums parādīja, ka Bacteroidetes kodē visvairāk glikozīdu hidrolāzes un polisaharīdu liāzes gēnus glikozīdu hidrolīzei un komplekso ogļhidrātu šķelšanai ar eliminācijas mehānismu [22]. Konkrēti, Bacteroides spp. tostarp B. caccae, B. dorei, B. finegoldii, B. fragilis, B. intestinalis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis un B. ksilānišķīdinātāji uzrādīja dominējošo kopējo gēnu skaitu, kas kodē GH un PL. Tādas pašas īpašības piemīt arī Parabacteroides distasonis [22]. Mūsu iepriekšējie pētījumi apstiprināja, ka 28-dienas hroniska neparedzama stresa stimulēšana samazināja Bacteroides, Parabacteroides, Butyricimonas un Weissella ģinšu relatīvo skaitu, savukārt žurkām palielināja Ruminococcus un Deinococcus [4]. Jāatzīmē, ka Bacteroides un Parabacteroides bija divi visizplatītākie mikrobu taksoni, kas normālām žurkām veidoja aptuveni 20 procentus. Pēc CUS ārstēšanas Bacteroides un Parabacteroides relatīvais daudzums tika strauji samazināts līdz aptuveni 5 procentiem depresijas modeļu žurkām. Tāpēc tas neizbēgami novedīs pie kopējā GH un PL enzīmu skaita samazināšanās CUS žurkām un vēl vairāk traucēs CUS depresīvās zarnu mikrobiotas deglikozilēto reakciju pēc CTE perorālas lietošanas.(Cistanche tubulosa ekstrakts)paraugžurkās.

5. Secinājums

Šajā pētījumā tika izveidota un izmantota UPLC-Q-TOF-MS tehnika, lai pārbaudītu un identificētu metabolītus.Cistanche tubulosa ekstraktsnormālām un CUS depresīvām žurkām in vitro un in vivo. Rezultāti parādīja, ka CTE(Cistanche tubulosa ekstrakts)Gan vesela, gan nomākta zarnu mikrobiota tika metabolizēta par aglikoniem un PhG un iridoīdu glikozīdu sadalīšanās produktiem. Pēc CTE perorālas lietošanas(Cistanche tubulosa ekstrakts), II fāzes aglikonu metabolīti un PhG un iridoīdu glikozīdu sadalīšanās produkti galvenokārt tika konstatēti žurku urīnā. Metabolisma spēja radīt sekundāros glikozīdus un aglikonus depresīvā rota-zarnu trakta mikrobiotā bija daudz vājāka nekā parasto žurku zarnu mikrobiotā, kas tika attiecināta uz nesakārtotajām glikozīdhidrolāzēm, ko CUS nomāktām žurkām ražo zarnu mikrobiota. Šis pētījums sniedz jaunu skatījumu uz vēlāku laiku. CTE attīstība(Cistanche tubulosa ekstrakts)kā potenciāls antidepresants.

Pateicības

Šis darbs tika atbalstīts ar dotācijām no Ķīnas Nacionālās galvenās pētniecības un attīstības programmas (2017YFC1702400).

A pielikums. Papildu dati

Papildu datus šim rakstam var atrast tiešsaistē vietnē HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728

No: ' In vitro un in vivo metabolismsCistanche tubulosa ekstraktsnormālām un hroniskām neparedzama stresa izraisītām depresīvām žurkāmYang Li u.c

---Journal of Chromatography B 1125 (2019) 121728

Atsauces

[1] Ķīnas farmakopejas komisija, Ķīnas Tautas Republikas farmakopeja, 2015. gada izd., China Medical Science Press, Pekina, Ķīna, 2015. gada lpp. 135 I daļa.
[2] Y. Jiang, P.-F. Tu, Cistanche sugu ķīmisko sastāvdaļu analīze, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970.–1979.
[3] Z. Fu, X. Fan, X. Wang, X. Gao, Cistanches Herba: pārskats par tās ķīmiju, farmakoloģiju un farmakokinētiku, J. Ethnopharmacol. (2017), https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.10.015.
[4] Y. Li, Y. Peng, P. Ma, H. Yang, H. Xiong, M. Wang, C. Peng, P. Tu, X. Li, Antidepressant-like effects ofCistanche tubulosa ekstraktshroniska neparedzama stresa žurkām, atjaunojot zarnu mikrobiotas homeostāzi, Front. Pharmacol. (2018), https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00967.
[5] JA Foster, MV Neufeld, Zarnu-smadzeņu ass: kā mikrobioms ietekmē trauksmi un depresiju, Trends Neurosci. 36 (2013) 305.–312.
[6] E. Sherwin, TG Dinan, JF Cryan, Jaunākie sasniegumi zarnu mikrobiotas lomas izpratnē smadzeņu veselībā un slimībās, Ann. NY Akad. Sci. 12 (2017) e0177977.
[7] Y. Meng, H. Jia, Z. Chao, Y. Yong, Z. Yang, M. Yang, Z. Zou, Variations in zarnu mikrobiota un fekāliju metaboliskā fenotipa, kas saistītas ar depresiju, izmantojot 16S rRNS gēnu sekvencēšanu un LC/ Uz MS balstīta metabolomika, J. Pharm. Biomed. Anal. 138 (2017) 231–239.

[8] JR Kellijs, Y. Borre, BC O', E. Patersons, AS El, J. Dīns, PJ Kenedijs, S. Beers, K. Skots, G. Molonijs, Blūza pārnešana: ar depresiju saistīta zarnu mikrobiota inducē neiro-uzvedības izmaiņas žurkām, J. Psychiatr. Res.. 82 (2016) 109.–118.
[9] L. Yang, P. Ying, M. Wang, P. Tu, X. Li, Cistanches Herba ūdens ekstrakta metabolisms cilvēka kuņģa-zarnu traktā in vitro: vielmaiņas profila noskaidrošana, pamatojoties uz visaptverošu metabolītu identifikāciju kuņģa sulā, zarnās. sula, cilvēka zarnu baktērijas un zarnu mikrosomas, J. Agric. Food Chem. 65 (2017) 7447–7456.
[10] Y. Li, G. Zhou, S. Xing, P. Tu, X. Li, Ehinakozīda metabolītu identificēšana, ko ražo cilvēka zarnu baktērijas, izmantojot ultra-performance šķidruma hromatogrāfiju/kvadrupola lidojuma laika masas spektrometriju, J. Lauksaimniecības. Food Chem. 63 (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, G. Zhou, Y. Peng, P. Tu, X. Li: Trīs tipisku feniletanoīdu glikozīdu metabolītu no Cistanches Herba skrīnings un identificēšana, ko veic cilvēka zarnu baktērijas, izmantojot UPLC/Q-TOF-MS, J. Pharm. Biomed. Anal. 118 (2016) 167–176.
[12] L. Yang, P. Ying, M. Wang, G. Zhou, Y. Zhang, X. Li, Cistanche deserticola un C. tubulosa ūdens ekstrakta metabolītu ātrā skrīnings un atšķirību identificēšana žurkām ar UPLC- Q-TOF-MS kombinētā modeļa atpazīšanas analīze, J. Pharm. Biomed. Anal. 131 (2016) 364–372.
[13] C. Q, P. Y, B. X, Z. W, C. L, L. X, sistemātiski raksturojiet ehinakozīda un akteozīda metabolītus no Cistanche tubulosa žurku plazmā, žultī, urīnā un izkārnījumos, pamatojoties uz UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Hromatogr. 30 (2016) 1406–1415.
[14] Y. Wang, H. Hao, G. Wang, P. Tu, Y. Jiang, Y. Liang, L. Dai, H. Yang, L. Lai, C. Zheng, An Pieeja identificēt secīgus metabolītus tipisks feniletanoīda glikozīds, ehinakozīds, kura pamatā ir šķidruma hromatogrāfijas jonu uztveršanas laiks
lidojuma masas spektrometrijas analīze, Talanta 80 (2009) 572–580.
[15] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, P. Tu, Metabolism of ehinakozīds, labs antioksidants, žurkām: tā žults metabolītu izolēšana un identificēšana, Narkotiku Metab. Dispos. 37 (2009) 431–438.
[16] J. Xu, HB Chen, SL Li, Izpratne par molekulāro mehānismu mijiedarbību starp augu izcelsmes zālēm un zarnu mikrobiotu, Med. Res. Rev. 37 (2017) 1140–1185.
[17] H. Liu, J. Yang, F. Du, X. Gao, X. Ma, Y. Huang, F. Xu, W. Niu, F. Wang, Y. Mao, Absorbtion and disposition of Ginsenosides after oral Panax notoginseng ekstrakta ievadīšana žurkām, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 2290–2298.
[18] JM Laparra, Y. Sanz, S. Schaffer, F. Visioli, Interactions of zarnu mikrobiota ar funkcionāliem pārtikas komponentiem un uztura bagātinātājiem, Pharmacol. Res. 61 (2010) 219–225.
[19] H. Takeda, M. Tsuji, T. Yamada, J. Masuya, K. Matsushita, M. Tahara, M. Iimori, T. Matsumiya, Caffeic acid attenues in garozas BDNF mRNS ekspresijas samazināšanās, ko izraisa piespiedu iedarbība. peldēšanas stress pelēm, Eur. J. Pharmacol. 534 (2006) 115.–121.
[20] A. Zheng, L. Hao, C. Ke, X. Jie, Z. Xuan, L. Yuan, C. Cong, J. Liu, Z. Feng, Mātes hidroksitirosola ievadīšana uzlabo neiroģenēzi un kognitīvās funkcijas pirmsdzemdību stresa apstākļos. pēcnācēji, J. Nutr. Biochem. 26 (2015) 190.–199.
[21] H. Li, J. He, W. Jia, Zarnu mikrobiotas ietekme uz zāļu metabolismu un toksicitāti, eksperta atzinums. Narkotiku Metab. Toksikols. 12 (2016) 31.
[22] KA El, F. Armougom, JI Gordon, D. Raoult, B. Henrissat, Ogļhidrātu aktīvo enzīmu pārpilnība un daudzveidība cilvēka zarnu mikrobiotā, Nat. Rev. Microbiol. 11 (2013) 497–504.