P-gp mediētu zāļu un zāļu mijiedarbības in vitro novērtējums, izmantojot RPTEC/TERT1 cilvēka nieru šūnu modeli
Mar 01, 2022
Ievads P-glikoproteīna (P-gp) inhibējošā potenciāla novērtējums in vitro ir svarīgs jautājums zāļu izstrādes procesā, jo tas ļauj prognozēt klīniski nozīmīgu zāļu un zāļu mijiedarbību (DDI) [1–3]. P-gp pieder ATP saistošo kasešu (ABC) transportētāju virsģimenei, un to kodē daudzu zāļu rezistences gēns MDR1 (pazīstams arī kā ABCB1). Ir zināms, ka šis membrānas transportētājs ir pārmērīgi ekspresēts audzēja šūnās un izraisa rezistenci pret daudzām pretvēža zālēm [4]. Atrodas visās fizioloģiskajās barjerās, tostarp zarnās, aknās unnieres, P-gp aizsargā pret ksenobiotikām, ierobežojot šo substrātu uzsūkšanos no gremošanas trakta un atvieglojot to izplūšanu žultī un urīnā. Tādējādi P-gp ir ievērojama loma dažādu terapeitisko klašu farmakokinētikā [5–7]. Ir zināms, ka daudzas zāles, piemēram, pretvēža līdzekļi, pretsēnīšu līdzekļi un sirds un asinsvadu zāles, ir P-gp substrāti un/vai inhibitori, un daudzas no tām ir iesaistītas klīniski nozīmīgās mijiedarbībās [8–10]. Tāpēc ASV Pārtikas un zāļu pārvalde (FDA) nosaka, ka zāļu izstrādes sākumposmā ir jānovērtē P-gp inhibīcijas potenciāls. Šim nolūkam veiktie in vitro testi parasti ir balstīti uz zāļu transportēšanas pētījumiem, izmantojot P-gp ekspresējošās šūnu līnijas. Precīzāk, FDA vadlīnijas iesaka in vitro noteikt pusmaksimālās inhibējošās koncentrācijas (IC50) vērtības, lai novērtētu klīnisko DDI risku, ko izraisa P-gp inhibīcija. Šim nolūkam ir veikti daudzi eksperimentāli testi, un lielākā daļa no tiem ir vērsti uz zāļu mijiedarbību, kas saistīta ar uzsūkšanos zarnās, izmantojot Caco-2 vai MDCK-MDR1 modeļus [11–13].
CISTANCHE UZLABOS NIERU/NIeru SLIMĪBU
Kopšnierueliminācija ir arī izplatīts eliminācijas ceļš dažādām zāļu klasēm, aktīvai tubulārajai sekrēcijai caur ABC transportieriem arī var būt galvenā loma šajās mijiedarbībās [14]. Tomēr in vitro dati parnieruP-gp mediētie DDI ir ierobežoti. Tas daļēji ir saistīts ar to, ka nav izstrādāti un raksturoti in vitro modeļi, lai prognozētunierunarkotiku transportēšana. Starp dažādām cilvēka šūnu līnijām, šķiet, ka RPTEC/TERT1 modelis sola novērtētnieruzāļu mijiedarbība. Šī šūnu līnija ir iegūta no vesela cilvēka donora un ir iegūta no iemūžinātām proksimālajām kanāliņu šūnām. Turklāt, izmantojot šo modeli, ir pierādīta P-gp izpausme un funkcionalitāte, tādējādi apstiprinot tā spēju paredzētnieruzāļu izplūdes [15, 16]. Šajā kontekstā šis pētījums tika izstrādāts, lai izpētītu P-gp inhibēšanas potenciālu, izmantojot RPTEC / TERT1 modeli. Pirmkārt, tika veikts rodamīna 123 (R123) uzkrāšanās skrīninga tests, lai iegūtu katras pārbaudītās zāles inhibīcijas profilu. Pamatojoties uz šo skrīningu, pēc tam tika atlasītas četras zāles, lai novērtētu to koncentrācijas atkarīgo ietekmi uz divu P-gp substrāta zāļu: apiksabāna un rivaroksabāna intracelulāro uzkrāšanos.
Atslēgvārdi:nieru šūna, nieru modelis, nieru zāles, nieru eliminācija, nieres.
Materiāli un metodes
ReaģentiApiksabāns, [2H71 3C ] - apiksa aizliegums , ri va roksa aizliegums , [13C6]-rivaroksabāns, nilotinibs, krizotinibs, erlotinibs, aksitinibs, idelalisibs, varfarīns un dabigatrāna eteksilāts tika iegādāti no Alkirlisachim Francija). Verapamils, ketokonazols, simvastatīns, amiodarons, rodamīns 123, Hanka līdzsvarotais sāls šķīdums (HBSS) un HEPES šķīdums tika iegādāti no Sigma-Aldrich (Saint-Quentin-Fallavier, Francija).
Šūnu kultūra RPTEC/TERT1 šūnas tika iegūtas no American Type Culture Collection (ATCC, Molsheim, Francija) un kultivētas hormonāli noteiktā, serumu nesaturošā barotnē, kas sastāv no Dulbecco Modifed Eagle's Medium F12 (ATCC), kas papildināta ar augšanas faktora komplektu (ATCC) un 1% antibiotiku/pretsēnīšu līdzekļu maisījums (penicilīns-streptomicīns, amfotericīns B) 37 grādu temperatūrā un 5% CO 2. Visiem eksperimentiem šūnas tika iesētas 96-iedobju plāksnēs ar blīvumu 50,000 šūnas katrā iedobē un tika izmantotas augšanai pēc 14 dienu kultivēšanas. Barotne tika atjaunota ik pēc 2 dienām, un šūnas tika izmantotas no 27. līdz 34. pasāžai. Caco-2 šūnas arī tika iegādātas no ATCC. Šūnas tika turētas barotnē, kas sastāvēja no Eagle's Minimal Essential Medium (Sigma–Aldrich, Misūri štatā, ASV), kas papildināta ar 10 procentiem FBS, 1 procentiem neaizvietojamām aminoskābēm un 1 procenta antibiotiku/pretsēnīšu maisījumu (penicilīna-streptomicīna, amfotericīna B). ) pie 37 grādiem un 5 procentiem CO2. Caco-2 šūnas tika iesētas 96-iedobju plāksnēs ar blīvumu 5 × 10 3 šūnas vienā iedobē un tika izmantotas augšanai pēc 14 dienu kultivēšanas. Cilvēka proksimālās cauruļveida epitēlija šūnas (HPTEC) tika iegūtas no BIOPREDIC (Renna, Francija) un kultivētas DMEM/F12, kas papildinātas ar hidrokortizonu, EGF, insulīnu, transferīnu un nātrija selenītu. Šūnas tika iesētas 96-iedobēs ar kolagēnu pārklātās kultūras plāksnēs ar blīvumu 6600 šūnu vienā iedobē un tika izmantotas augšanai pēc 11 dienu kultivēšanas.
Rodamīna 123 uzkrāšanās skrīninga tests P-gp inhibējošais potenciāls tika noteikts, mērot rodamīna 123 intracelulāro uzkrāšanos RPTEC / TERT1 šūnās dažādu zāļu klašu klātbūtnē un bez tās. No 14 pārbaudītajām zālēm kā P-gp inhibitori tika izmantoti ciklosporīns A (10 µM), ketokonazols (50 µM), verapamils (100 µM) un amiodarons (50 µM). Apiksabāns, rivaroksabāns un dabigatrāna eteksilāts — trīs tiešie perorālie antikoagulanti (DOAC) — tika izmantoti kā P-gp substrāti (10 µM). Varfarīns (50 µM) tika izmantots kā neinhibitors, un tika izmantoti pieci pretvēža līdzekļi, tostarp nilotinibs, krizotinibs, erlotinibs un idelalisibs, nezinot to inhibīcijas profilus 10 µM koncentrācijā. Vairāki nosacījumi tika reproducēti ar Caco-2 šūnām, kuras FDA ir apstiprinājusi zāļu transportēšanas pētījumiem. Šādā veidā tika noteikta rodamīna 123 intracelulārā aizture Caco-2 šūnās verapamila (100 µM), ciklosporīna A (10 µM), nilotiniba (10 µM) un DOAC (10 µM) klātbūtnē un bez tās. ). Īsumā, pēc 14 dienu kultivēšanas 96-iedobju plāksnēs šūnas tika iepriekš inkubētas 10 minūtes 37 grādos ar katru medikamentu, kas izšķīdināts HBSS ar 10 mM HEPES (v/v). Pēc tam šūnas tika inkubētas ar 10 µM rodamīnu 123 45 minūtes 37 grādu temperatūrā. Visbeidzot, pēc trīs mazgāšanas aukstā HBSS / HEPES šķīdumā šūnas tika lizētas istabas temperatūrā 45 minūtes nātrija dodecilsulfāta (SDS) šķīdumā, kas satur 1 procentu nātrija borāta. Intracelulārā rodamīna 123 daudzums tika kvantitatīvi noteikts, izmantojot Infnite M nanospektrofuorometru (Life Sciences, TECAN, Šveice), iestatot viļņu garumus uz 485/535 nm. Dati tika izteikti procentos no rodamīna 123 uzkrāšanās kontroles šūnās, kas nav pakļautas potenciālajiem P-gp inhibitoriem, un patvaļīgi iestatītas uz 100 procentu uzkrāšanos.
DOAC intracelulārās uzkrāšanās tests un IC50 noteikšana No iepriekšējā rodamīna 123 skrīninga testa tika izvēlētas četras zāles, lai izpētītu to koncentrācijas atkarīgo ietekmi uz apiksabāna un rivaroksabana (10 µM) intracelulāro uzkrāšanos RPTEC/TERT1 šūnās. Ketokonazols, krizotinibs un nilotinibs tika izvēlēti kā P-gp inhibitori, un varfarīns tika izvēlēts kā neinhibitors. Ciklosporīns A (10 µM) tika izmantots kā plaša spektra transportētāju inhibitors. Pētījumi par mijiedarbību starp DOAC un nilotinibu, lai noteiktu IC50 vērtības, tika reproducēti Caco-2 šūnās, lai salīdzinātu abus šūnu modeļus. Visi savienojumi tika atšķaidīti vai nu atsevišķi, vai ar saistīto inhibitoru HBSS transporta buferī, kas papildināts ar 1 procentu HEPES (v/v) un 1 procentu DMSO (v/v). Pirms inkubācijas visi šķīdumi tika iepriekš uzsildīti līdz 37 grādiem un pH tika noregulēts uz 7,4. Pretvēža zālēm krizotinibam un nilotinibam to sliktās šķīdības un citotoksiskā potenciāla dēļ koncentrācija bija robežās no 0,1 līdz 25 µM. Ketokonazolam un varfarīnam koncentrācija bija robežās no 0,1 līdz 100 µM. Īsumā, pēc 14 dienu kultivēšanas visas zāles, kas izšķīdinātas HBSS ar 1 procentu HEPES (v/v), tika iepriekš inkubētas 10 minūtes 37 grādu temperatūrā. Pēc tam šūnas tika inkubētas ar 10 µM apiksabāna vai rivaroksabāna 60 minūtes 37 grādu temperatūrā. Visbeidzot, pēc trīs mazgāšanas aukstā HBSS/HEPES šķīdumā šūnas tika lizētas istabas temperatūrā 45 minūtes 0,2% Triton X-100 šķīdumā. Pēc tam intracelulārā DOAC daudzums tika kvantitatīvi noteikts ar šķidruma hromatogrāfijas-masas spektrometriju (LC-MS). Dati tika izteikti kā procentuālais DOAC uzkrāšanās pieaugums, un DOAC intracelulārā uzkrāšanās kontroles šūnās tika patvaļīgi iestatīta uz 100 procentiem. IC50 vērtības P-gp aktivitātes inhibīcijai, kas atbilst pusi no maksimālās efektīvās koncentrācijas (EC50) vērtībām DOAC uzkrāšanās palielināšanai, tika noteiktas, izmantojot nesvērtu nelineāru mazāko kvadrātu regresijas modelēšanu palielinātai uzkrāšanai ar funkciju “nls()” R. programmatūra, saskaņā ar šādu vienādojumu (1. vienādojums):
Šķidruma hromatogrāfija – masas spektrometrijas analīzeApiksabāna (m/z 460.19793) un rivaroksabāna (m/z 436.07285) kvantitatīvā noteikšana tika veikta, izmantojot Ultimate U300{{18 }} šķidruma hromatogrāfijas sistēma (Dionex, Sunnyvale, CA, ASV), kas savienota ar Q-Exactive Plus masas spektrometru (ThermoFisher, Brēmene, Vācija). LC atdalīšana tika panākta, izmantojot Hypersil Gold C18 (3 µm, 50 × 2,1 mm) analītisko kolonnu (ThermoFisher Scientifc, Waltham, MA, ASV) un plūsmas ātrumu 0,6 ml/min. . Kustīgā fāze A bija ūdens ar 0,1 procentu skudrskābes (FA), un kustīgā fāze B bija acetonitrils ar 0,1 procentu FA. Rivaroksabanam gradients bija: 0–0,3 min, 10 procenti B; 0,3–1 min, lineāra no 10 procentiem līdz 70 procentiem B; 1–1,5 min, 70 procenti B; 1,51 min, atgriešanās sākuma apstākļos līdz 3 min. Apiksabānam gradients bija: 0–0,3 min, 10 procenti B; 0,3–0,7 min, lineāra no 10 līdz 90 procentiem B; 0,7–1,5, 90 procenti B; 1,51 min, atgriešanās sākuma apstākļos līdz 3 min. Noteikšana tika veikta elektrosmidzināšanas pozitīvas paralēlās reakcijas uzraudzības (PRM) režīmā ar izšķirtspēju 35,000 (pie m/z 200). Iekšējie standarti (IS) bija [13C,2H7]-apiksabāns (m/z 468,2452) apiksabānam un [13C6]-rivaroksabāns (m/z 442,09297) rivaroksabānam. Katrai narkotikai un tās attiecīgajai IS tika uzraudzīts mērķa jons (kvantitatīvā noteikšanai) un konfrējošs jons. Rivaroksabānam un tā IS mērķa jons bija attiecīgi m/z 144,95125 un konfrenējošie joni bija attiecīgi m/z 231,11280 un m/z 237,13298. Apiksabānam un tā IS mērķa jons bija attiecīgi m/z 199,08656 un konfrenējošie joni bija attiecīgi m/z 282,12387 un m/z 241,06062.
Rezultāti
Rodamīna 123 uzkrāšanās skrīninga testsRodamīna 123 uzkrāšanās skrīninga tests tika veikts RPTEC/TERT1 šūnās ar 14 zālēm ar dažādiem inhibīcijas profiliem (1. att.). Kā gaidīts, rodamīna 123 intracelulārā uzkrāšanās ciklosporīna A, plaša spektra inhibitora, klātbūtnē bija viena no augstākajām, un uzkrāšanās palielinājās par 75 procentiem, salīdzinot ar kontroles šūnām. Verapamila, specifiska P-gp inhibitora, klātbūtne izraisīja rodamīna 123 uzkrāšanās palielināšanos par 57 procentiem, kas liecina par P-gp iesaistīšanos. Tādā pašā veidā ketokonazols, kas aprakstīts kā spēcīgs P-gp inhibitors, izraisīja lielāku rodamīna 123 intracelulārās uzkrāšanās pieaugumu (66 procenti), salīdzinot ar verapamilu, apstiprinot tā inhibīcijas profilu. Un otrādi, amiodarona, kas raksturots kā mērens P-gp inhibitors, pievienošana izraisīja uzkrāšanos palielināšanos par 59 procentiem, kas ir līdzīgs verapamila izraisītajam. Pretvēža līdzekļiem nilotinibam, aksitinibam, krizotinibam, erlotinibam un idelalisibam tika novēroti dažādi inhibīcijas profili. Nilotiniba pievienošana izraisīja spēcīgu rodamīna 123 uzkrāšanās pieaugumu (71 procents), kas liecina par nozīmīgu inhibējošo potenciālu, kam sekoja aksitinibs, kas izraisīja aiztures palielināšanos par 57 procentiem. No otras puses, krizotinibam un erlotinibam bija mērens vai zems inhibējošais potenciāls, palielinot rodamīna 123 uzkrāšanos attiecīgi par 23 procentiem un 16 procentiem. Idelalisibs neietekmēja rodamīna 123 uzkrāšanos; tas pats attiecās uz varfarīnu, kas bija
izvēlēts kā neinhibitors. No trim DOAC apiksabāns un rivaroksabāns izraisīja nelielu rodamīna 123 aiztures pieaugumu: attiecīgi 33 procenti un 12 procenti. Interesanti, ka dabigatrāna eteksilāts, dabigatrāna priekšzāles un zināms P-gp substrāts, izraisīja rodamīna 123 aiztures palielināšanos par aptuveni 50 procentiem, lai gan tas nav aprakstīts kā potenciāls P-gp inhibitors. Visbeidzot, simvastatīna pievienošana izraisīja tikai nelielu fluorescējošā substrāta uzkrāšanās pieaugumu (32 procenti). Pamatojoties uz šo skrīningu, tika atlasītas četras zāles, lai novērtētu to koncentrācijas atkarīgo ietekmi uz apiksabāna un rivaroksabana intracelulāro uzkrāšanos RPTEC/TERT1 modelī. Ketokonazols tika izvēlēts kā pozitīvas kontroles nosacījums P-gp inhibīcijai, un varfarīns tika izvēlēts kā P-gp neinhibitors negatīvās kontroles stāvoklim. Nilotinibs un krizotinibs tika atlasīti attiecīgi kā spēcīgi un vidēji P-gp inhibitori. Vairāki nosacījumi tika reproducēti ar atsauces modeli Caco{15}}. R123 intracelulārā uzkrāšanās šūnās tika noteikta pēc kombinācijas (vai ne) ar apiksabānu un rivaroksabānu (10 µM), nilotinibu (10 µM) un ciklosporīnu A (10 µM) un verapamilu (100 µM) inhibīcijas kontroles apstākļos. (2.A att.). Kā gaidīts, verapamils un ciklosporīns A izraisīja lielu R123 aiztures pieaugumu attiecīgi par 297 procentiem un 275 procentiem. Tādā pašā veidā nilotinibs izraisīja lielu R123 intracelulārās uzkrāšanās pieaugumu (229 procenti), apstiprinot tā inhibējošo potenciālu. Apvienojot R123 ar DOAC, R123 uzkrāšanās nedaudz palielinājās (40–44 procenti), salīdzinot ar citām zālēm. Turklāt rodamīna 123 intracelulāra uzkrāšanās ciklosporīna A neesamības un klātbūtnes gadījumā.nieruŠajā pētījumā tika pētītas arī primārās cilvēka šūnas, lai pārbaudītu ar RPTEC/TERT1 šūnām iegūto rezultātu ticamību (2.B att.). Šīs analīzes parādīja, ka ciklosporīna A klātbūtne palielināja R123 aizturi par 71%. Šī vērtība bija tuvu tai, kas iegūta tādos pašos apstākļos ar RPTEC/TERT1 šūnām (ar ciklosporīnu A palielinājums par 75 procentiem). Tāpēc P-glikoproteīna aktivitāte bija līdzīga RPTEC / TERT1 modelī un primārajās cilvēka šūnās.
DOAC intracelulārās uzkrāšanās tests: IC50 un I1/IC50 attiecības noteikšana Tika veikti intracelulārās uzkrāšanās pētījumi, lai novērtētu apiksabāna un rivaroksabāna P-gp transportēšanu nemainīgā koncentrācijā 10 µM RPTEC/TERT1 šūnās in vitro un pieaugošas nilotiniba, krizotiniba, ketokonazola koncentrācijas klātbūtnē. , un varfarīnu (2., 3. att.). Tika novērtēta palielināta apiksabāna un rivaroksabāna aiztures modelēšana, lai noteiktu IC50 vērtības. Apvienojot DOAC ar nilotinibu, tika iegūtas zemākās IC50 vērtības: 0,85 µM un 1,37 µM attiecīgi rivaroksabanam un apiksabānam (4., 5. att.). Kombinācija ar krizotinibu deva IC50 vērtības attiecīgi 10,1 µM un 12,2 µM rivaroksabanam un apiksabānam. Pārsteidzoši, DOAC apvienošana ar ketokonazolu neradīja zemākās IC50 vērtības (attiecīgi 16,5 µM un 16,9 µM rivaroksabānam un apiksabānam). Visbeidzot, kā gaidīts, kombinācija ar varfarīnu, kas bija
izvēlēts kā neinhibitors, neietekmēja divu DOAC intracelulāro aizturi. Tāpēc tika pētīta gan apiksabāna, gan rivaroksabana intracelulārā uzkrāšanās Caco-2 šūnās pieaugošas nilotiniba koncentrācijas klātbūtnē, lai salīdzinātu ar šūnu modeļiem. Interesanti, ka, kā novērots ar RPTEC/TERT1 modeli, rivaroksabāna (4,16 µM) IC50 vērtība bija zemāka nekā apiksabāna (9,35 µM) vērtība. Interesanti ir arī atzīmēt, ka Caco-2 šūnās novērotās IC50 vērtības bija augstākas nekā tās, kas iegūtas RPTEC/TERT1 šūnās tam pašam inhibitoram. DDI klīnisko nozīmi var paredzēt no in vitro datiem. Saskaņā ar FDA vadlīnijām [I1]/IC50 attiecība tika aprēķināta katrai zāļu kombinācijai. Šī attiecība ļauj salīdzināt in vivo koncentrāciju ar tām, kas rada būtisku efektu in vitro. Apiksabānam RPTEC/TERT1 šūnās attiecības bija attiecīgi 3,1, 0,06 un 17,4 ar nilotinibu, krizotinibu un ketokonazolu (1. tabula). Caco-2 šūnās apiksabāna un nilotiniba mijiedarbības attiecība [I1]/IC50 bija 0,46 (1. tabula). Rivaroksabānam attiecības bija nedaudz augstākas nekā apiksabānam iegūtās attiecības RPTEC/TERT1 šūnās: attiecīgi 5,1, 0,08 un 17,7 nilotinibam, krizotinibam un ketokonazolam (2. tabula). Tādā pašā veidā [I1]/IC50 attiecība, kas novērota mijiedarbībai starp rivaroksabānu un nilotinibu Caco-2 šūnās, bija 1,03, kas bija augstāka nekā apiksabānam iegūtā attiecība (2. tabula).
Diskusija
Daudzi pētījumi, kas veikti pēdējās desmitgadēs, ir ziņojuši par ievērojamu P-gp lomu zāļu farmakokinētikā [17–19]. Ņemot vērā pieaugošo normatīvo interesi par zāļu mijiedarbību, ko izraisa P-gp, in vitro testi, lai izpētītu zāļu inhibējošo potenciālu, ir svarīgs zāļu izstrādes un klīniskās prakses aspekts. Šim nolūkam ir veikti daudzi in vitro testi, un lielākā daļa saistīto datu par paredzamo uzsūkšanos zarnās ir iegūti no Caco-2 un MDCK-MDR1 šūnu līnijām [20–22]. Tomēr ir pieejami maz datu par zāļu aktīvo tubulāro sekrēciju, kam arī ir galvenā loma zāļu izplatīšanā un kas ir atkarīga no ABC transportētāju klātbūtnes. Šis novērojums ir skaidri saistīts ar raksturojuma trūkumunierušūnu līnijas zāļu prognozēšanainieruefux. Šim mērķim ir nepieciešams in vitronierumodelis, kas cieši atdarina fizioloģisko barjeru. Cilvēka šūnu līnija RPTEC/TERT1, kas ekspresē vairākus ABC transportētājus (īpaši P-gp), šķiet laba alternatīva, kā parādīts iepriekšējā pētījumā [16]. Šajā kontekstā šajā darbā tika pētīta RPTEC / TERT1 modeļa pielietošana, lai novērtētu P-gp inhibēšanas potenciālu. Cik mums ir zināms, šis darbs ir pirmais, kas sniedz datus no P-gp inhibīcijas pētījumiem, izmantojot cilvēkunierušūnas.
In vitro testi P-gp inhibējošā potenciāla noteikšanai parasti balstās uz specifiska P-gp atsauces substrāta, piemēram, digoksīna vai rodamīna 123, izmantošanu [23–25]. Pateicoties to lietošanas vienkāršībai, fluorescējošās zondes ir izdevīgas augstas caurlaidspējas pārbaudēm. Turklāt rodamīns 123 ir plaši izmantots P-gp aktivitātes noteikšanai plašā pētījumu diapazonā [26–28]. Tādā veidā šajā pētījumā tika veikti rodamīna 123 uzkrāšanās RPTEC/TERT1 šūnās testi, lai noteiktu 14 zāļu inhibīcijas profilus. Starp šīm zālēm kā spēcīgi P-gp inhibitori tika izvēlēti ciklosporīns A, ketokonazols un verapamils. Šie inhibitori ir plaši raksturoti ar to nozīmīgo P-gp inhibēšanas potenciālu, kas izraisa gan digoksīna, gan rodamīna 123 transportēšanas modulāciju [27, 29, 30]. Kā gaidīts, šīs zāles izraisīja visaugstāko rodamīna 123 aizturi RPTEC / TERT1 šūnās. Turpretim, lietojot varfarīnu, kas tika izmantots kā negatīva kontrole, R123 aiztures palielināšanās netika novērota, apstiprinot RPTEC/TERT1 modeļa uzticamību. Interesanti, ka starp visām pārbaudītajām zālēm DOAC, tostarp dabigatrāna eteksilāts, apiksabāns un rivaroksabāns, ievērojami palielināja R123 aizturi, lai gan iepriekš tie netika raksturoti kā inhibitori, tikai P-gp substrāti [31, 32]. Šis novērojums var būt saistīts ar tā saukto "konkurētspējīgo" inhibīciju, kad zāles var mijiedarboties ar tām pašām saistīšanās vietām P-gp. Vislabāk raksturotās P-gp vietas ir H vieta (Hoechst 33342 saistīšanai) un R vieta (rodamīna 123 saistīšanai). Tomēr šajās mijiedarbībās varētu būt nozīme vairākām citām nezināmām zāļu saistīšanās vietām, kas varētu izskaidrot DOAC atšķirīgo ietekmi uz R123 uzkrāšanos [33, 34]. Tāpēc P-gp inhibīcija, kas novērota konkrētām zālēm, ir atkarīga no substrāta, ko izmanto in vitro pētījumos [28, 35]. Tāpēc jāapsver dažādu P-gp substrātu izmantošana, kas mijiedarbojas ar dažādām zāļu saistīšanās vietām, lai precīzi aprakstītu zāļu iespējamo P-gp inhibējošo spēju. Interesanti ir arī atzīmēt, ka vairāki apstākļi no rodamīna 123 skrīninga tika veikti arī Caco-2 šūnās, lai salīdzinātu RPTEC/TERT1 šūnas ar atsauces modeli zāļu transportēšanas pētījumos. Kā gaidīts, ciklosporīns A, verapamils un nilotinibs izraisīja vislielāko rodamīna aiztures pieaugumu. Tādi paši inhibīcijas profili tika novēroti gan Caco-2, gan RPTEC/TERT1 šūnām. Tomēr rodamīna 123 aiztures pieaugums, ko radīja mijiedarbība Caco-2 modelī, bija lielāks nekā tas, kas novērots RPTEC/TERT1 šūnās, kas liecina par iespējamām atšķirībām P-glikoproteīna ekspresijā starp modeļiem. pētījumā tika izmantota otrā metode, lai novērtētu un apstiprinātu iespējamo P-gp inhibīciju ar zālēm.
CISTANCHE UZLABOS NIeru/NIeru DIALĪZI
Pamatojoties uz rodamīna 123 uzkrāšanās testu, tika izvēlētas četras zāles, lai noteiktu to koncentrācijas atkarīgo ietekmi uz apiksabāna un rivaroksabana intracelulāro uzkrāšanos. Ir pierādīts, ka P-gp spēlē galveno lomu apiksabāna un rivaroksabana izvadē [32, 36]. Tāpēc tika novērtētas nilotiniba, krizotiniba un ketokonazola IC50 vērtības, un DOAC tika izvēlēti kā "upura" medikamenti. Cik mums ir zināms, šis pētījums ir pirmais, kurā tiek veikti intracelulārās uzkrāšanās pētījumi ar DOAC cilvēkiem.nierušūnas. Nilotinibam un krizotinibam iegūtās IC50 vērtības atbilst to inhibīcijas profiliem, kas iegūti rodamīna 123 uzkrāšanās testā. Nilotinibs, kas izraisīja spēcīgu R123 aiztures pieaugumu, uzrādīja zemāko IC50 vērtību abiem DOAC, apstiprinot tā augsto inhibīcijas potenciālu. Šis rezultāts atbilst arī iepriekšējam pētījumam, kas uzrādīja no koncentrācijas atkarīgu [3H]-paklitaksela intracelulārās uzkrāšanās pieaugumu MDR1-transfektētajās šūnās, kas liecina, ka tam ir inhibitora profils [37]. Krizotinibam R123 tests uzrādīja mērenu inhibīcijas potenciālu, ar mazāku R123 aiztures pieaugumu nekā nilotiniba izraisītajam. Šo novērojumu apstiprina iepriekšējais pētījums, kurā krizotinibs palielināja R123 un doksorubicīna intracelulāro uzkrāšanos MDR{12}}transfektētajās šūnās [38]. Šis rezultāts atbilst arī IC50 vērtībām, kas noteiktas ar DOAC, kas bija augstākas par attiecīgajām nilotiniba vērtībām, apstiprinot tā mēreno inhibīcijas profilu. Tomēr ir interesanti atzīmēt, ka nilotiniba vai krizotiniba koncentrācija 10 µM neizraisīja tādu pašu rodamīna 123 un DOAC aiztures pieaugumu. Rodamīna skrīningā nilotinibs palielināja substrāta aizturi par aptuveni 71%, savukārt DOAC tas bija aptuveni 40%. Turpretim krizotinibs izraisīja nelielu rodamīna aiztures pieaugumu (23 procenti), bet lielāku DOAC aiztures pieaugumu (apmēram 50 procenti) tajā pašā koncentrācijā. Kā minēts iepriekš, šo novērojumu var izskaidrot ar atšķirībām P-gp saistīšanās vietās. Ir zināms, ka daudzas zāles mijiedarbojas un konkurē ar H saistīšanās vietu, nevis R saistīšanās vietu (kurā saistās rodamīns 123), un otrādi [39]. Interesanti, ka ketokonazols, kas ir zināms kā spēcīgs P-gp inhibitors, izraisīja nedaudz mazāku rodamīna 123 aiztures pieaugumu nekā nilotinibs (attiecīgi 66 procenti pret 71 procentu). Tomēr līdzīga vērtība tika novērota ar Caco-2 šūnām, kur ketokonazola klātbūtne izraisīja R123 uzkrāšanās pieaugumu par 60 procentiem [40]. DOAC intracelulārā uzkrāšanās IC50 vērtību noteikšanai arī uzrādīja augstākas vērtības, salīdzinot ar nilotinibu un krizotinibu. Interesanti, ka lielākā daļa IC50 vērtību, kas konstatētas LLC-PK1 vai Caco-2 modeļos, izmantojot digoksīnu kā P-gp substrātu, bija no 3 līdz 4 µM ketokonazolam [41, 42]. Šīs vērtības diezgan atšķiras no šajā pētījumā konstatētajām vērtībām (attiecīgi 16,5 µM un 16,9 µM ar apiksabānu un rivaroksabānu). Šis novērojums apstiprina, ka substrāta un izmantotā modeļa izvēle ir izšķiroša ietekme, nosakot P-gp inhibējošo potenciālu. Turklāt nesen veikts pētījums ziņoja, ka ABC transportētāju ekspresijas līmeņi in vitro šūnu modeļos ietekmē zāļu transportēšanas testus un tādējādi ar P-gp saistīto DDI novērtējumu [43]. Patiešām, verapamila IC50 vērtību noteikšana, izmantojot rivaroksabānu kā P-gp substrātu, atklāja neviendabīgumu starp MDCKMDR1 un Caco{53}} šūnu modeļiem ar IC50 vērtībām attiecīgi 6,94 µM un 21,2 µM [43]. Turklāt šajā pētījumā Caco-2 šūnās tika pētīta arī no koncentrācijas atkarīgā nilotiniba ietekme uz apiksabāna un rivaroksabana intracelulāro uzkrāšanos. Interesanti, ka nilotiniba IC50 vērtības Caco-2 šūnās bija ievērojami augstākas nekā RPTEC/TERT1 šūnās. Šo novērojumu var izskaidrot ar atšķirību P-gp izteiksmē starp šiem modeļiem. Turklāt ir zināms, ka P-gp sadalījums ir atkarīgs no aplūkotajiem audiem. Falons et al. parādīja, ka P-gp līmenis bija augstāksnieresnekā cilvēka aknu audos [45]. No otras puses, šķiet, ka P-gp ekspresijas līmenis zarnās ir augstāks nekā zarnāsnieresaudi [46]. Tāpēc, izmantojot cilvēka šūnas, piemēram, RPTEC/TERT1 modeli, kas nepārspīlē transportētājus, varētu sniegt papildu datus. Šos datus var izmantot un ieskaitīt fizioloģiski pamatotā farmakokinētiskajā modelēšanā (PBPK), integrējot vairākus parametrus, piemēram, P-gp daudzumu audos vai in vitro modelī vai IC50 vērtības.
Lai gan RPTEC/TERT1 modelī ketokonazolam konstatētās IC50 vērtības bija augstākas nekā literatūrā novērotās, [I1]/IC50 attiecība, kas apstiprināta kā potenciālo klīniski nozīmīgu DDI prognozētājs iekšķīgi lietojamām zālēm, parādīja. augstas vērtības, kas pārsniedza FDA noteikto slieksni 0,1. Šis rezultāts ir saskaņā ar klīnisko pētījumu, kas uzrādīja divkāršu apiksabāna iedarbības palielināšanos, vienlaikus lietojot ketokonazolu [44]. Kopumā visi šie rezultāti parāda, ka RPTEC / TERT1 modelis ir daudzsološs instruments P-gp inhibīcijas potenciāla novērtēšanai.
CISTANČE UZLABOS NIERU/NIERES SĀPES
Secinājums
Mūsu pētījums parādīja, ka RPTEC / TERT1 modeļa pielietošana ir ērta, lai novērtētu dažādu zāļu klašu P-gp inhibējošo potenciālu. Rodamīna 123 uzkrāšanās testi ļāva veikt sākotnējo zāļu skrīningu. Tomēr, izmantojot papildu substrātus, lai apstiprinātu prognozes, ir jāizpēta arī tādu zāļu P-gp inhibējošais potenciāls, kas nesadarbojas ar P-gp R vietu. IC50 vērtības, kas noteiktas pēc apiksabāna un rivaroksabana intracelulārās uzkrāšanās, atbilst inhibīcijas profiliem, kas novēroti, lietojot rodamīnu 123. Turklāt ketokonazola un varfarīna kā spēcīga P-gp inhibitora un neinhibitora lietošana attiecīgi apstiprināja RPTEC/TER1 modeļa uzticamība, ja to izmanto, lai iegūtu in vitro datus par zāļu inhibējošo potenciālu pret P-gp. Visbeidzot, salīdzinot rezultātus, kas iegūti, izmantojot RPTEC/TERT1 modeli, ar tiem, kas iegūti, izmantojot Caco-2 šūnas, atklāja, cik svarīgi ir veikt in vitro pētījumus dažādos šūnu modeļos, lai noskaidrotu konkrētās zāles inhibējošo profilu.
