Cistanche Tubulosa iegūto feniletanoīdu glikozīdu iejaukšanās ar MTT testu

1. Ievads

Parazītiskais augsCistanche tubulosa(Šrenks) R. Vaits (Orobanchaceaeģimene) ir plaši izplatīta Ziemeļāfrikas, arābu un Āzijas valstīs [1]. Izcelsme noC. tubulosaunC. deserticolair svarīgi tradicionālajā ķīniešu medicīnā, jo tos izmanto impotences, sterilitātes, lumbago un aizcietējumu ārstēšanai resnās zarnas inerces dēļ [2]. Turklāt etanola ekstrakts noC. tubulosair pierādīts, ka pelēm ir ievērojama aizsargājoša iedarbība pret smadzeņu hipoksiju [3].

Endotēlija šūnām ir izšķiroša loma hipoksiskas plaušu hipertensijas patoģenēzē. EA.hy926 endotēlija šūnu līnija ir ievērojami līdzīga primārajām endotēlija šūnām. Veicot pētījumu par C. tubulosa etanola ekstrakta antihipoksisko iedarbību uz EA.hy926 endotēlija šūnām, mēs pamanījām, ka 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il){{7 }},5-difeniltetrazolija bromīda (MTT) tests, ko parasti izmanto, lai novērtētu šūnu dzīvotspēju citotoksicitātes un citostatiskās aktivitātes pētījumos, radīja pretrunīgus rezultātus, uzrādot palielinātu EA.hy926 šūnu dzīvotspēju pēc apstrādes.

Precīzs šūnu dzīvotspējas novērtējums ir būtisks, lai noteiktu zāļu iespējamo citotoksisko vai citoprotektīvo iedarbību. Tāpēc mēs izpētījām, kuras C. tubulosa etanola ekstrakta sastāvdaļas var būt atbildīgas par pretrunīgajiem rezultātiem, kas novēroti MTT testā. Mēs izolējām divus galvenosfeniletanoīdu glikozīdi (PhG)no C. tubulosa etanola ekstrakta,ehinakozīds (turpmāk – 1. savienojums) un akteozīds (turpmāk – 2. savienojums). Mēs noteicām to ietekmi uz EA.hy926 šūnu dzīvotspēju, izmantojot dažādas metodes. Turklāt, lai vēl vairāk noskaidrotu, kurš savienojumu 1 un 2 aizvietotājs var būt atbildīgs par pretrunīgiem rezultātiem, mēs pārbaudījām to aglikonus, kofeīnskābi (turpmāk savienojums 3) un 3, 4-dihidroksilfeniletanolu (turpmāk savienojums 4) uz EA. .hy926 šūnu dzīvotspēja, izmantojot tās pašas metodes.

DABĪGA CISTANCHE TUBULOSA APOPTOZES INHIBĒŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2. Rezultāti un diskusija

2.1. Savienojumu identifikācija

Divu savienojumu struktūras, kas izolētas noC. tubulosa etanola ekstraktstika identificēti ar kodolmagnētiskās rezonanses (NMR) un masas spektrometrijas (MS) analīzēm, kā parādīts 1. attēlā. Savienojums 1 tika identificēts kā ehinakozīds, salīdzinot ar iepriekš ziņoto KMR (1. tabula) un MS (m/z 785 [M-H). ]− ) dati [4]. 2. savienojuma KMR spektri bija ļoti līdzīgi savienojuma 1 spektriem, izņemot to, ka tajā nebija -D-glikopiranozilgrupas (1. tabula). Savienojums 2 (m/z 623 [M−H]−) tika identificēts kāakteozīds[5]. Svarīgi, ka abiem savienojumiem ir viens un tas pats aglikons, kas ietver kofeīnskābi (3. savienojums) un 3, 4-dihidroksilfeniletanolu (4. savienojums).

2.2. Šūnu dzīvotspējas testi

MTT un CCK{{0}} testi tika izmantoti, lai analizētu savienojumu 1–4 ietekmi uz EA.hy926 šūnu dzīvotspēju. MTT tests parādīja, ka EA.hy926 šūnu dzīvotspēja ievērojami palielinājās pēc apstrādes ar 25 un 50 μM 1., 2. vai 3. savienojumu (166,3% un 174,1% savienojumam 1, 205,8% un 224,3% savienojumam 2, un attiecīgi 164,8% un 189,6% savienojumam 3, p < 0,05), salīdzinot ar kontroles šūnām (2.A attēls). Turklāt šūnu morfoloģiskā pārbaude noteica, ka apstrāde ar 50 μM savienojumu 1, 2 vai 3 palielināja purpursarkano formazāna kristālu veidošanos, kas tieši norāda uz dzīvo šūnu proporciju (3. attēls). Un otrādi, CCK-8 tests liecināja, ka šūnu dzīvotspēja ievērojami samazinājās pēc apstrādes ar 12,5, 25 un 50 μM savienojumu 1, 2 vai 3 (75,5%, 45,1% un 43,7% savienojumam 1, 85,5%. 51,8% un 34,3% savienojumam 2 un attiecīgi 64,5%, 48,2% un 36,4% savienojumam 3, attiecīgi, p < 0,05, salīdzinot ar kontroles šūnām (2.B attēls). 4. savienojums neietekmēja šūnu dzīvotspēju ne MTT, ne CCK-8 testā. Neatbilstība starp rezultātiem, kas iegūti ar diviem testiem, liecina, ka viens no diviem testiem var precīzi neatspoguļot 1. un 2. savienojumu ietekmi uz EA.hy926 šūnu dzīvotspēju.

2.3. Hoechst apoptozes novērtējums

Krāsošana Hoechst 33342 ir šūnu caurlaidīgs DNS traips, kas tiek ierosināts ar ultravioleto gaismu un izstaro zilu fluorescenci pie 460 līdz 490 nm. Apoptotisko šūnu kondensētais hromatīns iekrāsojas spilgtāk nekā normālu šūnu hromatīns [6]. Kamēr kontroles šūnās bija vienmērīgi izkliedēts hromatīns, normāli organoīdi un neskartas šūnu membrānas, šūnas, kas 48 stundas inkubētas ar 50 μM savienojumiem 1, 2 vai 3, parādīja tipisku apoptotisko šūnu iekrāsošanos (4.A attēls). Un otrādi, šūnu pakļaušana 50 μM savienojuma 4 nepalielināja apoptotisko kodolu skaitu, salīdzinot ar kontroles ārstēšanu.

2.4. Apoptotisko šūnu plūsmas citometriskā analīze

Aneksīna V-FITC/PI dubultās krāsošanas tests identificē apoptotiskās šūnas, pateicoties aneksīna V-FITC augstai afinitātei saistoties ar fosfatidilserīnu, kas tiek izvadīts šūnās, kurās tiek veikta apoptoze [7]. Šajā testā dzīvotspējīgas šūnas nesaistās ne ar aneksīnu V, ne PI un tāpēc netiek iekrāsotas (apakšējais kreisais kvadrants), agrīnās apoptotiskās šūnas tiek iekrāsotas zaļā krāsā, saistoties aneksīna V-FITC (apakšējais labais kvadrants), un vēlīnās apoptotiskās šūnas. tiek iekrāsoti zaļā un sarkanā krāsā, aneksīnam V-FITC saistoties attiecīgi ar fosfatidilserīnu un PI ar nekrotiskām šūnām (augšējais labais kvadrants). Kā parādīts 4B attēlā, šūnas tika inkubētas ar 50 μM savienojumiem 1, 2 vai 3 48 stundas, apoptotisko šūnu procentuālais daudzums palielinājās attiecīgi no 3,74% (kontroles šūnas) līdz 10,32%, 12,95% un 11,30%. Salīdzinot ar kontroles šūnām, savienojums 4 nepalielināja apoptotisko EA.hy926 šūnu procentuālo daudzumu.

Saskaņā ar rezultātiem, kas iegūti ar CCK-8 testu un krāsošanu ar Hoechst 33342, plūsmas citometrijas tests parādīja, ka savienojumi 1, 2 un 3 inducēja apoptozi EA.hy926 šūnās. Kopumā šie novērojumi liecina, ka EA.hy926 šūnu dzīvotspējas palielināšanās, kas novērota ar MTT testu pēc apstrādes ar savienojumiem 1–3, bija kļūdaini pozitīvs rezultāts.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA IMUNITĀTES UZLABOŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.5. Diskusija

1983. gadā Mosmans izstrādāja kolorimetrisko MTT mikroplates testu šūnu proliferācijas un citotoksicitātes mērīšanai [8]. Šo vienkāršo testu un tā modifikācijas tagad plaši izmanto šūnu bioloģijas laboratorijās visā pasaulē. Frakcionēšanas pētījumi zīdītāju šūnās norādīja, ka reducētais piridīna nukleotīdu kofaktors NADH ir atbildīgs par lielāko daļu MTT samazināšanās. To apstiprināja pētījumi, kuros izmantoja veselas šūnas [9]. Tāpēc MTT samazināšana ir saistīta ar metaboliski aktīvām šūnām un ir saistīta ne tikai ar mitohondriju elpošanu, bet arī ar citoplazmu un nemitohondriju membrānām, tostarp endosomu / lizosomu nodalījumu un plazmas membrānu [10]. MTT molekulas tīrais pozitīvais lādiņš ir galvenais faktors tās uzņemšanai šūnās, izmantojot plazmas membrānas potenciālu.

Proti, MTT tests dažkārt var precīzi neatspoguļot pārbaudītā savienojuma faktisko ietekmi uz konkrētām šūnām. Tomēr ķīmiskās struktūras vai grupas, kas var izraisīt pretrunīgus rezultātus MTT testā, nav identificētas. Jaunākie pētījumi ir parādījuši, ka MTT tests var par zemu novērtēt (-)-epigallokatehīna-3-galāta, kas ir zaļajā tējā visizplatītākais polifenols [11], antiproliferatīvo iedarbību. Pētījumos, kuros izmantoja MTT testu, lai noteiktu audzēja ķīmisko jutību, pretvēža ķīmijterapijas līdzekļi, piemēram, epirubicīns, paklitaksels, docetaksels un imatiniba mezilāts (Gleevec), uzrādīja palielinātu šūnu dzīvotspēju [12,13]. Turklāt vairākos pētījumos ir ziņots, ka daži augu ekstrakti un redoksaktīvie polifenoli var traucēt MTT testu, jo tie tieši samazina MTT tetrazolija sāli, ja nav šūnu [14].

Nepieciešamība izšķīdināt MTT formazāna kristālus pirms spektrofotometriskās analīzes mikroplašu lasītājā un reakcijai raksturīgais beigu raksturs ierobežo MTT testa izmantošanu noteiktiem lietojumiem. Tā rezultātā tika izstrādāti tetrazolija analogi, kuros fenilgrupas bija dekorētas ar negatīvi lādētām sulfonātu grupām, piemēram, 2,3-bis-(2-metoksi-4-nitro- 5- sulfofenil)-2H-tetrazolija-5-karboksanilīds (XTT), negatīvi lādēts iekšējais sāls [15] un 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -5-(3-karboksimetoksifenils)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolijs (MTS), vāji skābs iekšējais sāls, kas ir cieši saistīts ar MTT [16] . Šo modifikāciju rezultātā tika ražoti barotnē šķīstoši formazāna produkti, kas likvidēja šķīdināšanas soli pirms kvantitatīvās noteikšanas. Attiecīgi, tā kā palielinātais šo molekulu negatīvais lādiņš samazināja to spēju pārvietoties pa šūnu membrānām [17], starpposma elektronu akceptoriem (IEA), piemēram, 1-metoksi-5-metilfenazīna metilsulfātu ({{25). }}metoksi PMS) bija nepieciešami, lai atvieglotu tetrazola krāsas samazināšanos vai palielinātu samazinājuma ātrumu.

Pavisam nesen tika izstrādāta jauna ūdenī šķīstošo tetrazolija sāļu paaudze, kuras prototips ir WST-1 [18]. WST-1, negatīvi lādēts disulfonēts iekšējais sāls, kas satur joda atlikumu, ir stabilāks par XTT un MTS 1-metoksi PMS klātbūtnē, tas ir obligāts IEA. Tā rezultātā WST{5}}/1-metoksi PMS tika pārdots kā ērts viena reaģenta šūnu proliferācijas komplekts. Ir izstrādāti vairāki citi WST sērijas tetrazolija sāļi, no kuriem visnoderīgākais, iespējams, ir WST-8 [19]. Šķiet, ka WST-8 šūnu samazināšanās īpašības ir ļoti līdzīgas WST-1, un to tirgo neatkarīgi kā CCK-8 testu. WST-8 ir šūnu necaurlaidīgs un tāpēc tiek samazināts ārpusšūnu, elektronu transportēšanas ceļā no intracelulārā NADH uz WST-8 cauri plazmas membrānai, ko nodrošina 1-metoksi PMS. Lai gan gan MTT, gan WST-8/1-metoksi PMS samazināšanu veicina intracelulārais NADH, šķiet, ka NADH avots šajās divās metodēs atšķiras. WST-8/1-metoksi PMS samazināšana ir vairāk atkarīga no malāta/aspartāta atspoles, kas saista mitohondriju trikarbonskābes ciklu-NADH ar ekstramitohondriju telpu [20].

Sākotnējos eksperimentos mēs apstiprinājām, ka savienojumi 1, 2, 3 un 4 nevar tieši samazināt MTT tetrazolija sāli (nav parādīts). Šajā pētījumā pašu savienojumu tiešā ietekme ar reaģentu tika novērsta, rūpīgi mazgājot mikroplates ar fosfātu buferšķīdumu (PBS), pirms tika pievienots MTT vai CCK-8 šķīdums, kā norādīts ražotāja protokolos. Tomēr rezultāti, kas iegūti, izmantojot abas metodes, joprojām bija pretrunīgi (2. attēls). Kā gaidīts, šūnu inkubācija ar 1., 2. un 3. savienojumu palielināja tetrazolija sāls reducēšanos par purpursarkanu formazānu, salīdzinot ar kontroles grupu (3. attēls), kas liecina, ka tikai tetrazolija sāls reducēšana konkrēta savienojuma klātbūtnē. nav pietiekams, lai spriestu par savienojuma spēju traucēt MTT testu.

Lai noteiktu, vai savienojumi 1, 2, 3 un 4 var izraisīt apoptozi EA.hy926 šūnās, tika novērtētas šūnu morfoloģiskās izmaiņas un fosfatidilserīna eksternalizācija. Saskaņā ar šūnu dzīvotspējas samazināšanos, kas novērota ar CCK-8 testu, Hoechst krāsošanas un plūsmas citometrijas analīzes rezultāti, izmantojot aneksīnu V-FITC/PI, liecināja, ka augšanas inhibīcija, kas novērota pēc apstrādes ar 1., 2. un 3. savienojumu, bija vismaz daļēji EA.hy926 šūnu apoptozes dēļ. Mūsu rezultāti arī apstiprināja domu, ka kofeilgrupa, kas atrodas gan savienojumā 1, gan 2, bija atbildīga par pretrunīgajiem rezultātiem, kas iegūti ar MTT testu.

Līdzīgi kā mūsu atklājumos, Rottlerin, spēcīgs lielas vadītspējas kālija kanālu atvērējs, in vitro neuzrādīja reaktivitāti pret MTT. Tomēr tas spēcīgi uzlaboja formazāna kristālu veidošanos šūnās, kas bija acīmredzamā pretrunā ar Rottlerin inhibīciju NF-κB un šūnu proliferāciju, kas novērota, analizējot [3H]-timidīna iekļaušanu DNS [21]. Mehānisms, ar kuru Rottlerin uzlaboja MTT samazināšanos, tika attiecināts uz tā mitohondriju atdalīšanas efektu [22]. Rotlerīnam ir kanēļa skābes aizvietotāju grupa. Salīdzinot ar kanēlskābi, savienojumam 3 ir divi papildu hidroksilgrupas atlikumi, kas atrodas C-3 un C-4. Tāpēc mēs domājam, ka mehānisms, ar kuru savienojumi 1 un 2 rada pretrunīgus rezultātus MTT testā, var būt saistīts arī ar to mitohondriju atdalīšanas efektiem. Lai pārbaudītu šo hipotēzi, ir nepieciešami salīdzinoši pētījumi starp 1. un 2. savienojumu un ķīmisko atvienotāju, piemēram, trifluorkarbonilcianīda fenilhidrazonu (FCCP).

 NATURAL CISTANCHE TUBULOSA SEKSUĀLĀS FUNKCIJAS UZLABOŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3. Eksperimentālā sadaļa

3.1. Reaģenti un ķīmiskās vielas

3. savienojums (kafeīnskābe-pulveris, tīrība=98,6%) tika iegādāts no Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Ķīna). Savienojums 4 (3, 4-dihidroksilfeniletanola eļļa, tīrība=98,5%) tika iegūts no Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Ķīna). MTT un dimetilsulfoksīds (DMSO) tika iegūti no Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ASV). CCK-8 tests tika iegādāts no Dojin Laboratories (Kumamoto, Japāna). Hoechst 33342 un aneksīna V-FITC / PI apoptozes noteikšanas komplekti tika iegādāti no Beyotime Biotehnoloģijas institūta (Haimena, Ķīna).

3.2. Augu materiāls

C. tubulosastublāji tika savākti no Yutian prefektūras, Sjiņdzjanas Uiguru autonomā reģiona, Ķīnas. Vaučeru paraugi tika deponēti Trešās militārās medicīnas universitātes (Čuncjina, Ķīna) galvenajā augstkalnu medicīnas laboratorijā, un to autentiskumu apstiprināja Yi Zhang no Čendu Tradicionālās ķīniešu medicīnas universitātes (Čendu, Ķīna).

3.3. Augu materiāla ieguve un izolēšana

Gaisā kaltēti C. tubulosa (0,6 kg) stublāji tika saberzti pulverī un ekstrahēti ar 50% etanolu 2 stundas 70 grādu temperatūrā. Pēc šķīdinātāja noņemšanas pazeminātā spiedienā etanola ekstrakts (212,5 g) tika izšķīdināts un suspendēts ūdenī (2 l) un ekstrahēts ar n-butanolu (2 L × 3). N-butanola ekstraktu (110 g) hromatografēja uz poliamīda kolonnas un eluēja ar etanolu/ūdeni (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50), iegūstot piecas frakcijas (A-E) . Frakcija B (65 g) tika frakcionēta ODS kolonnā; eluējot ar etanolu: ūdeni (1:9), atdala 1. savienojumu (3 g). Frakcija D (10,5 g) tika frakcionēta ODS kolonnā; eluējot ar etanolu/ūdeni (1:4), atdala 2. savienojumu (1 g).

KMR spektri tika reģistrēti Bruker Avance 600 spektrometrā CD3OD ar tetrametilsilānu (TMS) kā iekšējo standartu. Masas spektri tika veikti ar BioTOF-Q masas spektrometru.

3.4. Šūnu kultūra

EA.hy926 šūnu līnijas tika iegūtas no American Type Culture Collection (Manassas, VA, ASV). Šūnas tika kultivētas RPMI 1640 barotnē, kas papildināta ar 10% (v/v) liellopu augļa serumu un 1% (v/v) penicilīna-streptomicīnu mitrā vidē ar 5% CO2 pie 37 grādiem.

3.5. Šūnu dzīvotspēja

Šūnu dzīvotspēja tika novērtēta, izmantojot MTT un CCK{{0}} testus. 1. un 2. savienojums un to aglikoni, kofeīnskābe (3) un 3, 4-dihidroksilfeniletanols (4) tika izšķīdināti DMSO līdz galīgajai DMSO koncentrācijai < 0,1% (v/v) barotnē.

EA.hy926 šūnas tika iesētas 96-iedobju plāksnēs ar ātrumu 4 × 103 šūnas/iedobē. Pēc 24 stundu inkubācijas šūnas 24 stundas apstrādāja ar 6, 25–50 μM savienojumu 1, 2, 3 vai 4. Kultivēšanas barotne tika noņemta un šūnas divas reizes nomazgāja ar fosfātu buferšķīdumu (PBS). Katrai iedobei, kas satur 100 μL barotnes, pievienoja MTT rezerves šķīduma (5 mg · ml-1) alikvotas (10 μL) un inkubēja ar šūnām 4 stundas. Pēc inkubācijas barotne tika noņemta un katrai iedobei pievienoja 150 μL DMSO alikvotas daļas, lai izšķīdinātu formazāna kristālus. Absorbcija tika mērīta pie 490 nm, izmantojot mikroplašu lasītāju (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, ASV). Šūnu dzīvotspēja tika izteikta kā MTT samazināšanās procents, piešķirot 100% vērtību kontroles šūnu absorbcijai. Visi eksperimenti tika veikti trīs reizes un uzrādīti kā vidējā ± standarta novirze (SD).

CCK-8 tests tika veikts, ievērojot literatūru ar nelielām izmaiņām [23]. Konkrēti, šūnas 24 stundas apstrādāja ar 6,25–50 μM savienojumiem 1, 2, 3 vai 4 un divas reizes nomazgāja ar PBS, pirms pievienoja 10 μL CCK-8 šķīdumu un 100 μL barotnes. Pēc mikroplates inkubācijas 37 grādu temperatūrā 2 stundas absorbcija tika mērīta pie 450 nm, izmantojot mikroplašu lasītāju. Šūnu dzīvotspēja tika izteikta kā dzīvotspējīgo šūnu procentuālais daudzums attiecībā pret kontroles šūnām (100%). Visi eksperimenti tika veikti trīs reizes un izteikti kā vidējais ± SD.

3.6. Apoptozes novērtējums, izmantojot Hoechst 33342 krāsošanu

Apoptotiskās morfoloģiskās izmaiņas tika novērotas ar Hoechst 33342 krāsošanu. Īsumā, EA.hy926 šūnas tika iesētas 48-iedobju plāksnēs (2 × 104 šūnas/iedobē) un apstrādātas ar 50 μM savienojumu 1, 2, 3 vai 4 48 stundas 37 grādu temperatūrā, divas reizes mazgātas ar PBS, un fiksēts ar 4% (v/v) paraformaldehīdu 15 minūtes istabas temperatūrā. Pēc divreiz skalošanas ar PBS šūnas 5 minūtes istabas temperatūrā krāsoja ar Hoechst 33342 (10 ug · ml-1) un divas reizes mazgāja ar PBS. Hoechst iekrāsotie kodoli tika vizualizēti, izmantojot fluorescences mikroskopu (Olympus, Tokija, Japāna).

3.7. Apoptozes analīze ar plūsmas citometriju

Apoptotiskās šūnas tika noteiktas ar aneksīna V-FITC / PI dubultās krāsošanas un plūsmas citometrijas analīzi. Īsumā, pēc apstrādes ar 50 μM savienojumu 1, 2, 3 vai 4 48 stundas, šūnas tika novāktas un atkārtoti suspendētas PBS pie 1 × 105 šūnas · ml-1. Pēc centrifugēšanas ar ātrumu 500 × g 5 minūtes 25 grādu temperatūrā pievienoja 195 μL aneksīna V-FITC saistīšanas buferšķīduma un 5 μL aneksīna V-FITC. Pēc maigas virpuļa sajaukšanas maisījumu 10 minūtes inkubēja istabas temperatūrā tumsā. Pēc centrifugēšanas ar ātrumu 500 × g 5 minūtes 25 grādu temperatūrā pievienoja 190 μL FITC konjugētā aneksīna V saistošā buferšķīduma un 10 μL PI. Pēc maigas virpuļa sajaukšanas paraugi tika analizēti, izmantojot FACSCalibur plūsmas citometru (Becton Dickinson, Sanhosē, CA, ASV) 30 minūšu laikā.

3.8. Statistiskā analīze

Visi eksperimentālie dati tika izteikti kā vidēji ± SD. Eksperimentālo paraugu un atbilstošās kontroles atšķirību nozīmīgums tika novērtēts ar vienvirziena dispersijas analīzi (ANOVA), izmantojot SPSS programmatūru (versija 11.5). Statistiskā nozīmība tika iestatīta uz p < 0.05.

4. Secinājumi

Mūsu rezultāti liecina, ka MTT testā novēroto dzīvotspējīgo šūnu skaita pārvērtēšana var maskēt noteiktu savienojumu citotoksicitāti. Tāpēc zāļu skrīninga procesos mēs iesakām izmantot dažādas metodes, lai noteiktu konkrētā savienojuma ietekmi uz šūnu dzīvotspēju (piemēram, CCK-8 un 3H-TdR testus), lai izvairītos no maldinošu rezultātu radīšanas.

DABĪGA CISTANČE TUBULOZA TEOSTOSTERONA SEKRECIJAS VEICINĀŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%