Ar feniletanoīdu glikozīdu bagāta ekstrakta no Cistanche Deserticola zarnās transportēšanas novērtējums caur Caco{1}} šūnu vienslāņa modeli

Ievads

Caco{0}} šūnu līnijai, kas iegūta no cilvēka resnās zarnas adenokarcinomām, piemīt enterocītiem līdzīgas īpašības. Normālos apstākļos Caco-2 šūnas spontāni atšķiras no nobriedušām šūnām un veido neskartus vienslāņus. Blakus esošās šūnas pielīp, izmantojot ciešus savienojumus, kas izveidoti monoslāņa apikālajā pusē, kas var pasīvi atšķirtun aktīvi transportēja zāles pa epitēlija slāni. Tā kā Caco{0}} šūnu monoslāņi ir morfoloģiskās un bioķīmiskās līdzības ar normāliem enterocītiem, tas kalpo kā labi pieņemts in vitro modelis, lai pētītu zāļu absorbcijas potenciālu zarnās un transportēšanas īpašības.

Pretstatā ķīmiskajām vielām augu ekstrakti (PE) ir maisījumi, kuru bioloģiskā aktivitāte un aktīvās sastāvdaļas bieži vien nav labi identificētas. Turklāt PE zarnu transporta īpašības, atšķirībā no tā sastāvdaļu īpašībām, ir cieši saistītas ar klīnisko lietošanu. Caco{0}} šūnu monoslāņa testa parauga plūsmas mērījumi parasti ietver ķīmiskas metodes, piemēram, HPLC, LC/MS utt. Lai gan šīs metodes ir spēcīgi rīki, tās ir sarežģītas, laikietilpīgas, dārgas un dažkārt. nepieciešamas sarežģītas iekārtas. Vēl svarīgāk ir tas, ka ne viens, ne mazākuma komponents nevar atspoguļot PE kopumā. Tādējādi ir jāizveido jauna pieeja, kas nav atkarīga no sastāvdaļu noteikšanas, lai identificētu un novērtētu PE transportēšanas īpašības.

Cistanche deserticola YC Ma (CD), holoparazītu augs, ir izplatīta tradicionālā ķīniešu medicīna, ko galvenokārt izmanto nieru mazspējas, ķermeņa vājuma un aizcietējumu ārstēšanai, un šie lietojumi ir oficiāli reģistrēti Ķīnas farmakopejā.Feniletanoīdu glikozīdi (PhG), tostarp ehinakozīds (EC), akteozīds (AC) un izoakteozīds (IS) utt., ir polifenolu savienojumu klase. Tās tiek uzskatītas par vienu no galvenajām Cistanche sugu bioaktīvajām sastāvdaļām. Farmakoloģiskie pētījumi ir parādījuši, ka PhG bioaktivitāte ir daudzveidīga un ietver antioksidantu, pretnoguruma, hepatoprotektīvu, imūnmodulējošu, pretiekaisuma un neiroprotektīvu iedarbību. Tomēr PhG zarnu transporta īpašības nav pētītas. Šajā pētījumā mēs pētījām ar PhG bagātu ekstraktu (PRE) no CD kā integrētas sistēmas zarnu caurlaidību un trīs galveno PhG (AC, IS un EC) caurlaidību diferencētās Caco{4}} šūnās. Mūsu rezultāti liecināja, ka PRE galvenokārt tiek transportēts caur slikti absorbētu pasīvo difūziju lejup pa koncentrācijas gradientu bez izplūdes, kas nodrošina farmakokinētisko pamatu PhG klīniskai lietošanai CD.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA SEKSUĀLĀS FUNKCIJAS UZLABOŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materiāli un metodes

Materiāli

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS, and EC (>98%) tika iegādāti no Must Biotechnology Co. (Čendu, Ķīna). Dulbecco modificēto Ērgļa barotni (DMEM), liellopu augļa serumu (FBS) un neaizvietojamās aminoskābes (NEAA) ražoja Gibco BRL (Grand Island, NY, ASV). 6-iedobes TranswellTM plāksnes (ieliktņa membrānas augšanas laukums 4,67 cm2) tika iegūtas no Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, ASV). Žurkas astes kolagēns tika iegūts no Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ASV). Visi reaģenti un ķīmiskās vielas HPLC analīzei bija analītiskas kvalitātes.

PRE sagatavošana no kompaktdiska

Gaisā žāvētais CD materiāls tika pulverizēts un ekstrahēts, perkolējot ar 70% etanolu. PhG bagātā frakcija tika sagatavota, kā aprakstīts iepriekš, un ekstrahēta ar ūdeni piesātinātu n-butilspirtu. Ekstrakta šķidrums tika koncentrēts un žāvēts pazeminātā spiedienā. Makroporaino sveķu-UV spektrofotometrija noteica PhG saturu 78,4%. Gala paraugs pārstāvēja 1,75% izejvielas iznākumu no sausnas svara. Iegūtais paraugs tika uzglabāts -20 grādu temperatūrā līdz turpmākai lietošanai.

AC, IS un EC noteikšana ar HPLC

Shimadzu HPLC sistēma, kas aprīkota ar LC risinājuma programmatūru, tika izmantota, lai pārbaudītu AC, IS un EC saturu PRE. Tika izmantota apgrieztās fāzes Intersil C18 kolonna (4,6 mm × 25{5}} mm, 5 μm), kas tika uzturēta istabas temperatūrā. Kustīgās fāzes bija acetonitrils un ūdens, kas satur 0,1% fosforskābi (v/v) ar gradienta eluēšanu (1. tabula) ar plūsmas ātrumu 1,0 ml/min. UV spektrofotometra detektors tika iestatīts uz 334 nm. Lai precīzi noteiktu maiņstrāvas un IS plūsmu, mēs izstrādājām jaunu HPLC-fluorescences noteikšanas (HPLC-FLD) metodi. Pēc strukturālās analīzes un fluorescences viļņa garuma skenēšanas (dati nav parādīti) mēs ieguvām optimālos fluorescences noteikšanas apstākļus maiņstrāvai (piemēram, 338 nm, Em: 448 nm) un IS (piemēram, 320 nm, Em: 434 nm).

HPLC analītiskā metode tika apstiprināta, izmantojot šādus veiktspējas raksturlielumus: stabilitāte, linearitāte, jutība, precizitāte (mainība dienas laikā un starplaikā) un precizitāte. Transportēšanas buferšķīdumā esošās analizējamās vielas tika uzglabātas 25 grādu temperatūrā tumsā 24 stundas, un tika mērīta to stabilitāte. Analīti C vitamīna klātbūtnē bija ļoti stabili (0,4%), jo relatīvās standarta novirzes (RSD) vērtības pīķu apgabalos bija <3,5%. Lineārās regresijas vienādojums, korelācijas koeficients, linearitātes diapazons, LOD un LOQ AC, IS un EC ir parādīti 2. tabulā. LOD (18–30 nM) un LOQ (60–100 nM) vērtības parāda, ka HPLC-FLD un HPLC-UV metodes ir ļoti jutīgas. Visas RSD vērtības, kas izsaka metodes precizitāti, bija < 2% dienas un starpdienu mainīgumam, kas norāda uz labu precizitāti. Reģenerācijas novērtēšanai AC, IS un EC tika pievienoti transporta buferim, lai iegūtu trīs (augstu, vidēju un zemu) koncentrācijas līmeņus. Metodes atgūstamības vērtības attiecībā uz analītiem ir apkopotas 3. tabulā. Vidējās atgūstamības bija no 90,0% līdz 96,4%, kas liecina par labu precizitāti. Noslēgumā jāsaka, ka izveidotās HPLC metodes ir apmierinošas attiecībā uz linearitāti, jutību, precizitāti un precizitāti AC, IS un EC kvantitatīvai noteikšanai transporta buferī.

PRE noteikšana ar biotestu sistēmu

Biotests (kopējā antioksidanta spēja) tika balstīts uz FRAP (dzelzs reducējošās/antioksidanta jaudas) testu, ko mēs iepriekš aprakstījām [16] un apstiprinājām linearitātes un precizitātes ziņā (mainība dienas laikā un starplaikā). Bioloģiskās pārbaudes metodes linearitāte tika noteikta, pamatojoties uz kalibrēšanas līknēm. Linearitātes koncentrācijas diapazons bija 0.0625–40 ug/ml (y=0.0258x+0.0968, R2=0.996). Izveidotās bioloģiskās analīzes metodes precizitāte tika noteikta, ņemot vērā mainīgumu dienas laikā un starp dienu PRE analīzei (10,0 ug/ml). Metodes atkārtojamība dienas laikā tika noteikta, pamatojoties uz piecām secīgām noteikšanām tajā pašā dienā. Starpdienu atkārtojamība tika mērīta, pamatojoties uz piecām secīgām noteikšanām trīs dažādās dienās. RSD vērtības metodes precizitātei bija attiecīgi 1,014% un 4,72% dienas un starpdienu mainīgumam, kas norāda uz labu precizitāti. Tādējādi izveidotā biotesta metode ir apmierinoša attiecībā uz linearitāti, precizitāti un precizitāti PRE kvantitatīvai noteikšanai transporta buferšķīdumā.

Šūnu kultūra

Caco{{0}} šūnas tika kultivētas 37 grādu temperatūrā un 95% relatīvajā mitrumā atmosfērā, kas satur 5% CO2 un barotni, kas sastāvēja no DMEM, 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-glutamīna, penicilīna. (100 V/ml) ​​un streptomicīnu (100 ug/ml). Barotne tika mainīta katru otro dienu šūnu augšanas un diferenciācijas laikā. Šūnas tika audzētas 75-cm2 plastmasas kolbās un novāktas ik pēc 3–5 dienām ar 0,05% EDTA-tripsīnu. Transporta eksperimentiem šūnas tika iesētas ar blīvumu 1 × 105 šūnas / cm2 uz Transwell ieliktņiem, kas pārklāti ar kolagēnu. Aptuveni 21 dienu pēc sēšanas vienslāņi tika izmantoti transportēšanas eksperimentiem. To integritāte tika noteikta, mērot trans-epitēlija elektrisko pretestību (TEER) pāri monoslāņiem ar EVOM, kas aprīkots ar ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., ASV). Caco-2 šūnu monoslāņa TEER vērtībām bija jāpārsniedz 500 O∙cm2.

NATURAL CISTANCH TUBULOSA NOMIERINĀŠANAI UN LAKSATĪVAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Transporta eksperimenti

Vienslānis tika mazgāts ar transportēšanas buferšķīdumu (P-buferis, kas satur 10 mM HEPES, 1 mM nātrija piruvātu, 10 mM glikozes, 3 mM CaCl2 un 145 mM NaCl, pH 7,4) un pēc tam iepriekš inkubēja 20 minūtes. pie 37 grādiem. Pēc transportēšanas bufera noņemšanas svaigu transportēšanas buferšķīdumu, kas satur testa paraugus, pievienoja apikālajai (AP) kamerai (1, 5 ml) AP, lai veiktu bazolaterālo (BL) virziena pētījumus, vai BL kamerā (2, 5 ml) BL uz AP virziena pētījumiem. Maiņstrāvas, IS un EK testiem, izmantojot HPLC, alikvota daļa (300 ul) tika izņemta no katras uztvērēja kameras dažādos laika intervālos (30, 60, 90 un 120 min). Pēc katras parauga ņemšanas uztvērēja kamera tika papildināta ar tādu pašu daudzumu svaiga iepriekš uzkarsēta (37 grādi) transportēšanas buferšķīduma. Savāktie paraugi tika uzglabāti -20 grādu temperatūrā turpmākai lietošanai. PRE noteikšanai, izmantojot biotestu, tika ņemti tikai paraugi 120 minūtēs. PRE, AC, IS un EC nestabilitātes dēļ paraugu stabilizēšanai tika pievienots 0,4% (w/v) C vitamīns, lai noteiktu AC, IS un EC saturu ar HPLC, un paraugi PRE biotestam tika pārbaudīts tūlīt pēc paraugu ņemšanas. Tika aprēķināta katra parauga šķietamā caurlaidības koeficienta (Papp vai 'Papp) vērtība.

Datu analīze

Papp vērtības AC, IS un EC virzienos AP BL vai BLAP tika aprēķinātas, pamatojoties uz šādu vienādojumu: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), kur Papp ir šķietamais caurlaidības koeficients (cm/s), kas noteikts ar HPLC. (4Q/4t) ir testa savienojuma (AC, IS vai EC) parādīšanās ātrums uztvērēja pusē (μmol/s); A ir ieliktņa virsmas laukums (cm2 ); C0 ir sākotnējā testa savienojuma koncentrācija donora pusē (μmol/ml). Konkrēti, aprēķinot Papp vērtības, tika izmantota masas vienība "ug", nevis "μmol". Dati ir izteikti kā vidējie ± SD.

Rezultāti

AC, IS un EC kompozīcija PRE no CD

Tā kā AC, IS un EC tiek uzskatītas par galvenajām bioaktīvajāmCistanche sugu PhGs, mēs analizējām to saturu PRE, izmantojot HPLC-UV. Reprezentatīvā hromatogramma ir parādīta 1. attēlā. Šo sastāvdaļu identifikācija tika balstīta uz aiztures laiku un UV spektra salīdzināšanu ar autentiskajiem standartiem pie viļņa garuma 334 nm. AC, IS un EC saturs PRE bija attiecīgi 26,60%, 1,84% un 32,83%. Tādējādi šie trīs savienojumi veido 61,27% no PRE; turklāt iepriekš minētie rezultāti liecina, ka PhG saturs PRE ir 78, 4%. Tāpēc AC, IS un EC veido aptuveni 80% no PRE PhG.

PRE, AC, IS un EC kopējās antioksidācijas spējas

Pētījumi parPhG antioksidanta aktivitāteir ziņots par CD, un AC, IS un EC veido aptuveni 80% no PRE PhG. Tādējādi PRE, AC, IS un EC kopējās antioksidācijas spējas tika pārbaudītas un izteiktas, izmantojot FRAP vērtības (× 10–6 mmol). Kā parādīts 2. attēlā, kad FRAP vērtība bija 8 × 10–6 mmol, PRE, AC, IS un EC galīgās koncentrācijas bija 6,20 ug/ml, 3,14 ug/ml, 22,92 ug/ml un 4,89 ug. /ml, attiecīgi norādot, ka šo četru paraugu kopējā antioksidācijas spēja bija šāda: AC > EC > PRE > IS. PRE bioaktivitāte ir saistīta ar tā aktīvo sastāvdaļu grupām (AIG). Apmēram 60% PRE AC un EC uzrādīja spēcīgāku kopējo antioksidatīvo aktivitāti nekā PRE un IS. Tā kā IS (1,84%) veido ļoti nelielu PRE daļu, citi komponenti, piemēram, vāji antioksidants IS, arī nepārprotami ir aktīvi PRE. Pārsteidzoši, ka kopējā antioksidatīvā aktivitāte atšķīrās gandrīz 7-kārtīgi starp AC un tā izomēru IS, norādot, ka ne tikai fenola hidroksilgrupu skaits, bet arī fenola hidroksilgrupu novietojums molekulā ietekmēja antioksidatīvo efektu. .

Caco-2 monoslāņu validācija

Lai apstiprinātu Caco-2 šūnu vienslāņu sistēmu, tika noteiktas Papp vērtības propranololam (labi transportējams marķieris) un lucifera dzeltenajam (slikti transportējams marķieris) no AP uz BL pāri Caco-2 monoslāņiem. noteiktas attiecīgi kā 1, 51 × 10–5 cm / s un 2, 8 × 10–7 cm / s, un šīs vērtības saskan ar iepriekšējos ziņojumos publicētajām vērtībām. Sārmainās fosfatāzes aktivitātes tests arī apstiprināja, ka Caco-2 šūnu monoslāņi bija kvalitatīvi salīdzināmi ar tievās zarnas epitēliju.

AC, IS un EC caurlaidība

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 cm/s), turpretim slikti uzsūcas medikamentu rādītāji bija zemi (< 1.0 × 10–6 cm/s) [3]. As shown in Table 4, the Papp values of AC, IS, and EC were nearly on the order of 10–7 cm/s, indicating that these compounds were poorly permeable. Furthermore, efflux or active transport was not observed because the ratios of Papp BL to AP / Papp AP to BL for AC, IS, and EC were between 0.90 ~ 1.55, and the criterion of net efflux proposed by the FDA Guidance is a ratio less than 2. Based on the kinetic curves presented in Fig. 3, the bidirectional transport percentages of AC, IS, and EC at 200 μM increased linearly with time. The transport rate (TR) values of the three compounds increased linearly in both directions between approximately 100 and 300 μM (Fig. 4). These results indicate that the main transport mechanism of AC, IS, and EC is also passive diffusion. 

PRE caurlaidība

Iepriekš minētie rezultāti liecina, ka PRE kopējā antioksidācijas spēja ir saistīta vismaz ar 61,27% AIG no PRE. Tādējādi mēs novērtējām PRE TR, pamatojoties uz tā kopējās antioksidatīvās spējas koncentrācijas un iedarbības līkni, un aprēķinājām Papp vērtības, lai atspoguļotu PRE transporta īpašības. AP!BL un BL!AP PRE PAPP vērtības bija (2,16 ± 0,26) × 10–7 cm/s un (3,13 ± 0,29) × 10–7 cm/ s, attiecīgi norādot, ka šis savienojums bija slikti caurlaidīgs. Turklāt izplūde vai aktīvā transportēšana nebija acīmredzama, jo “Papp BL pret AP / “Papp AP pret BL attiecība pret PRE bija 1, 45. Turklāt PRE divvirzienu TR lineāri palielinājās no aptuveni 300 līdz 900 ug/ml (5. att.). Rezultātu virziena izvēles trūkums liecina, ka pasīvā difūzija ir galvenais PRE transporta mehānisms.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA IMUNITĀTES UZLABOŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Diskusija

Salīdzinot ar augsti attīrītiem medikamentiem, PE parasti ir maisījumi, kas sastāv no simtiem sastāvdaļu ar ļoti atšķirīgām fizikāli ķīmiskajām īpašībām. Tāpēc PE rada sistemātisku, daudzmērķu un daudzkanālu sinerģisku darbību to sarežģītā AIG [21] dēļ, kas kavē PE transporta raksturlielumu analīzi. Lai zinātniskāk novērtētu PE transportēšanas īpašības, daži pētnieki PE ir identificējuši vairākus komponentus, nevis vienu komponentu [22–24]. Tomēr ierobežots skaits sastāvdaļu nevar atspoguļot PE kopumā. Tomēr visu PE komponentu noteikšana nav iespējama. Turklāt, ja dažādiem PE komponentiem ir pilnīgi atšķirīgi transporta raksturlielumi, PE holistiskās transporta īpašības būs grūti noteikt.

Deviņdesmitajos gados tika izmantotas biotestu sistēmas, lai novērtētu pretmikrobu līdzekļu TR [25]. Līdz 2005. gadam Eguči un viņa kolēģi [26] bija novērtējuši burkānu ekstrakta antioksidatīvo aktivitāti, izmantojot BL barotnes no diferencētām Caco-2 šūnām; šī pieeja ir piemērotāka, lai atspoguļotu in vivo situācijas.

Pamatojoties uz iepriekšējo ziņojumu par PhG aktivitāti un mūsu rezultātiem (2. att.), AIG TR PRE var novērtēt, nosakot barotnes kopējo antioksidācijas spēju uztvērēja kamerā. Pēc transportēšanas eksperimentiem mēs noskaidrojām, ka PRE TR bija līdzīgs abos virzienos, un šis transports bija nepiesātināts un slikti absorbēts ('Papp < ​​1.0 × 10–6 cm/s), un tā nebija. norāda uz izplūdi, kas liecina, ka pasīvā difūzija lejup pa koncentrācijas gradientu ir galvenais PRE transportēšanas mehānisms (5. att.). Turklāt PRE transporta raksturlielumi atbilst AC, IS un EC, efektīvo komponentu, kam piemīt antioksidatīva aktivitāte PRE, transportēšanas īpašībām (4. attēls un 4. tabula). Šis rezultāts bija sagaidāms un norādīja, ka pašreizējā biotestu sistēma ir piemērota un uzticama, lai novērtētu AIG transportēšanas īpašības PRE diferencētās Caco{10}} šūnās.

Atšķirībā no kanoniskās Papp vērtības, ko parasti izmanto, lai atspoguļotu viena savienojuma transportēšanu, 'Papp vērtība, kas iegūta no TR, pamatojoties uz koncentrācijas-efekta līkni, var ne tikai atspoguļot sastāvdaļas, kas iekļūst monoslāņos ar neskartu struktūru, bet ietver arī citus faktorus, kas saistīti ar mērķa aktivitāti, piemēram, komponentu metabolītus, ķīmiski noārdītus produktus un pat dažus citokīnus, kas izdalīti no Caco-2 šūnām, reaģējot uz stimulāciju, kas var ietekmēt mērķa bioaktivitāti. Tādējādi iepriekš minētais daudzfaktors, nevis tikai transportētie neskartie komponenti, nosaka 'Papp vērtību. Tāpēc “Papp var spēcīgāk korelēt ar in vivo situācijām nekā kanoniskā Papp vērtība. Šajā pētījumā mēs noskaidrojām PRE pasīvi izkliedēto un slikti absorbēto raksturu, pamatojoties uz tā Papp vērtību, un šis raksturs var būt saistīts ar CD lielo devu un ilgu klīniskās ārstēšanas periodu. Tomēr šie atklājumi sniegs sistemātiskākus norādījumus klīnicistiem CD pielietošanā, ja ir identificēti tikai vairuma AIG CD transportēšanas raksturlielumi, ne tikai PhG.

Tomēr atlasītajam bioaktivitātes vienumam jābūt pietiekami jutīgam, lai to varētu noteikt uztvērēja kameras vidē, kas rada izaicinājumu biotestu sistēmas izveidei, lai novērtētu PE transportēšanas īpašības. Turklāt bioaktivitātei jābūt atkarīgai arī no pēc iespējas vairāk komponentu. Mūsu pētījumā kopējās antioksidācijas spējas tests bija piemērotāks nekā vairākas citas metodes (S1 attēls). Bet pat tādā gadījumā mūsu tests var noteikt PRE TR tikai pēc 120 minūtēm.

Kopumā šajā pētījumā tika izveidota jauna biotestu sistēma, lai novērtētu PRE zarnu caurlaidību diferencētās Caco{0}} šūnās. Iegūtie rezultāti parādīja, ka slikti absorbēta pasīvā difūzija lejup pa koncentrācijas gradientu bez izplūdes ir galvenais PRE transportēšanas mehānisms (5. att.), kas nodrošina farmakokinētisko pamatu PhG klīniskai lietošanai CD. Ir iespējams izmantot jaunu biotestu sistēmu, lai novērtētu TR un tādējādi aprēķinātu “Papp vērtības, lai novērtētu AIG zarnu transportēšanas īpašību PE. Šī pieeja var būt piemērota arī citam PE ar atbilstošu bioaktivitāti.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA SEKSUĀLĀS FUNKCIJAS UZLABOŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%