Zarnu aizsardzība ar proantocianidīniem ietver antioksidatīvas un pretiekaisuma darbības saistībā ar insulīna jutības, lipīdu un glikozes homeostāzes uzlabošanos 2. daļa

Lūdzu sazinietiesoscar.xiao@wecistanche.comlai iegūtu vairāk informācijas

Teīna izteiksme, izmantojot Western blot. 6. attēlā parādīts, ka Fe/Asc pievienošana Caco-2/15 šūnām paaugstināja divu svarīgo enzīmu līmeni, bet PAC līdzsvaroja to Fe/Asc izraisīto augšupregulāciju.

Tā kā insulīna signalizācija modulē lipoģenēzes, FA oksidācijas un glikoneoģenēzes procesus, bija svarīgi izpētīt Fe / Asc un PAC ietekmi uz MAPK un PI3K / Akt, diviem galvenajiem insulīna signalizācijas ceļiem. Šim nolūkam Caco-2/15 šūnas tika iepriekš inkubētas ar insulīnu pirms otras Caco{5}}/15 šūnas.

6. attēls. PAC ietekme uz glikoģenēzi Caco-2/15 šūnās. Proantocianidīni (PAC, 250 ug/mL) tika pievienoti apikālo šūnu nodalījumam 24 stundas pirms apstrādes ar Fe/Asc (200 μM/2 mM) 6 stundas 37 grādu temperatūrā. (A) G6Pāzes un (B) PEPCK proteīna ekspresija tika novērtēta ar Western blot.cistanche pulverisRezultāti atspoguļo vidējos ± SEM 3 neatkarīgos eksperimentos, katrs trīs eksemplāros. Parādīts reprezentatīvs Western blots, kas ilustrē eksperimentu trīs eksemplāros ar to pašu gēlu un vienā un tajā pašā ekspozīcijā.*P<0.05 vs="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc="" treated="" cells.="">cistanche sakneG6Pāzes glikozes-6-fosfatāze, PEPCK fosfoenolpiruvāta karboksikināze.

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

ārstēšanu, lai aktivizētu signalizācijas ceļu. Kamēr Fe/Asc paaugstināja p38-MAPK proteīna ekspresiju un fosfo p38-MAPK/p38-MAPK attiecību, PAC novērsa šīs darbības (7.A–C. att.). No otras puses, tā kā Fe / Asc samazināja fosfo Akt (pAkt) olbaltumvielu masu un Akt / Akt attiecību, PAC parādīja spēju uzturēt normālu līmeni. Līdzīga tendence tika novērota attiecībā uz PI3K (att. 7D-I. Tāpēc šie novērojumi apstiprina PAC labvēlīgo lomu insulīna signalizācijā.

Diskusija

Polifenoli ir labi pazīstami ar savu pleiotropo bioloģisko un medicīnisko iedarbību, kas izskaidro daudzu zinātnieku un pārtikas rūpniecības nozaru piesaisti šiem aizraujošajiem augu izcelsmes dabiskajiem produktiem. PAC izceļas no daudzveidības un lielā polifenolu skaita to farmakoloģiskās un terapeitiskās ietekmes uz hroniskiem traucējumiem dēļ2021. Neskatoties uz to slavējamajām iezīmēm, joprojām ir daudz nezināma par to ietekmi uz GI traktu, kas izvieto paplašinātus gremošanas, imunoloģiskos, neironu un metagenomikas tīklus2.cistanche miegsŠī iemesla dēļ šajā izmeklēšanā ir pieliktas pūles, lai noskaidrotu PAC lomu zarnu OxS, antioksidantu aizsardzībā, iekaisumos, FA oksidācijā, lipoģenēzē un glikoneoģenēzē, vienlaikus cenšoties noskaidrot pamatā esošos mehānismus, piemēram, insulīna signalizāciju. un transkripcijas faktoru statusu.

Lai pārbaudītu PAC efektus, mēs izmantojām Caco{0}}/15 šūnu līniju — populāru zarnu modeli, ko galvenokārt novērtē zinātnieku aprindas2 un ko Pārtikas un zāļu pārvalde atzinusi par uzņemšanas un transportēšanas procesiem4. Caco{4}}/15 šūnas ne tikai spontāni diferencējas funkcionāli un morfoloģiski līdzīgos cilvēka enterocītos3,25, bet arī palīdz efektīvi izpētīt absorbciju un mijiedarbību zarnās, uzturu, toksikoloģiju, pārtikas mikrobioloģiju, biopieejamības testus un skrīningu. zāļu caurlaidība atklāšanas programmā2²627. Tāpat kā mūsu iepriekšējos ziņojumos par dažādām tēmām28-3】, Caco-2/15 šūnu līnija ir bijusi nozīmīga pašreizējā pētījumā, lai atklātu PAC potenciālu dažādu vielmaiņas ceļu regulēšanā. Svarīgi ir tas, ka šajā pētījumā šūnas tika iesētas uz porainiem filtriem, kas ļāva piekļūt abām bipolārā zarnu epitēlija pusēm: apikālajiem un bazolaterālajiem nodalījumiem, kas atbilst attiecīgi zarnu lūmenam vai serozālajai cirkulācijai. Turklāt mēs iepriekš inkubējām Caco-2 /15 šūnas ar Fe/Asc, jo šī sistēma mūsu laboratorijā bija ļoti svarīga, lai izraisītu spēcīgu OxS un iekaisumu, ko savukārt izaicināja liels efektoru spektrs17,1932-3 Jāatzīmē, Fe/Asc kā spēcīgs skābeklis. -radikālus ģenerējošā sistēma izraisa oksidatīvus bojājumus bioloģiskajām makromolekulām, izmaina intracelulāro redoks vidi un ir iesaistīta daudzos patoloģiskos stāvokļos2.35,56.Mūsu atklājumi liecina par ievērojamu lipīdu peroksidācijas (augsts MDA līmenis) paaugstināšanos, kā arī neaizsargātu antioksidantu aizsardzību (zems GPx un SOD2 proteīna ekspresijas).cistanche tubulosa priekšrocībasTurklāt, pateicoties spējai radīt lipīdu peroksīdus, Fe/Asc komplekss veicina iekaisumu, par ko liecina pastiprināta TNFa, COX2 un NF-is ekspresija. Kopumā šie rezultāti apstiprina radikāļu un iekaisuma veidošanos, reaģējot uz Fe / Asc

PAC klātbūtne neitralizēja Fe / Asc izraisīto lipīdu peroksidāciju. Tā kā antioksidantu aizsardzības neveiksme varētu izskaidrot OCS indukciju, mēs pārbaudījām tā iedarbību uz endogēniem antioksidantu enzīmiem. Faktiski PAC spēja atjaunot Fe / Asc mediēto SOD2 un GPx samazināšanos. Lai definētu OxS saasināšanās ar Fe/Asc un PAC izraisīto mazināšanas mehānismu, mēs novērtējām Keap1-NRF2-antioksidantu atbildes elementa (ARE) signalizācijas ceļu, kas tiek uzskatīts par spēcīgāko endogēno antioksidantu. regulators37.cistanche tējaNRF2 ir šūnu OCS sensors, kura funkcija ir uzturēt redoksu homeostāzi. Normālos apstākļos. NRF2 tiek nepārtraukti ubikvitināts un ir vērsts uz proteasomu noārdīšanos ar tā negatīvi saistītā regulatora Keap18 palīdzību. Endogēno un eksogēno efektoru klātbūtnē Keapl tiek inaktivēts un pazemināts, tādējādi izjaucot Keapl-NRF2 mijiedarbību un atbrīvojot NRF2, kas pārvietojas uz šūnas kodolu, saistās ar promotoriem, kas satur.

7. attēls. PAC ietekme uz insulīna jutību Caco-2/15 šūnu līnijā. Proantocianidīni (PAC, 250 ug/mL) tika pievienoti apikālo šūnu nodalījumam 24 stundas pirms apstrādes ar Fe/Asc (200 μM/2 mM) 6 stundas 37 grādu temperatūrā. Divas stundas pirms 6 stundu inkubācijas beigām ar Fe/Asc maisījumu tika pievienots insulīns (100 nM), lai novērtētu jutību pret insulīnu. (A) p38-MAPK, (B) fosfora p38-MAPK, (D) Akt, (E) fosfo Akt, (G) PI3k un (H) fosfo PI3k proteīna ekspresija bija novērtēts ar Western blot. Pēc tam tika aprēķinātas attiecības (C) phospho p38-MAPK/p38-MAPK, (F)phospho Akt/Akt un (Dphospho PI3k/PI3k). Rezultāti atspoguļo vidējos ± SEM 3 neatkarīgos eksperimentos. katrs divos eksemplāros. Parādīts reprezentatīvs Western blots, kas ilustrē eksperimentu trīs eksemplāros uz tā paša gēla un ar tādu pašu ekspozīciju.*P<0.05 vs+/-insulin="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc+/-insulin-treated="" cells.p38-mapkp38-mitogen-activated="" protein="" kinase,="" pi3k="" phosphoinositide="" 3-kinase,="" akt="" protein="" kinase="">

ARE un paātrina antioksidantu enzīmu transkripciju39. Saskaņā ar mūsu datiem Caco-2/15 šūnu apstrāde ar PAC apspieda Keapl un, iespējams, ļāva NRF2 pārvietoties uz kodolu, ļaujot saistīties ar ARE (kodola secība: 5'TGACnnnGC3') antioksidantu gēnu promotora reģionā. (SOD2 un GPx), kā rezultātā tiek stimulēta to transkripcija un koordinēta augšupregulācija. Saskaņā ar šiem datiem fenola resveratrola savienojums novērsa OxS H, O, ārstētos reimatoīdā artrīta fibroblastiem līdzīgos sinoviocītos, veicinot NRF2 ekspresiju un samazinot Keap12 ekspresiju. Turklāt, saskaņā ar Kanzaki et al, antioksidantu un citoprotektīvo enzīmu aktivāciju var saistīt ar NRF2 / Keapl attiecību1.

Kā gaidīts no OCS uzlabošanās, PAC ievērojami samazināja iekaisumu, par ko liecina TNFa un COX2 pazemināšanās. Tā kā NF-KB ir galvenais iekaisuma citokīnu regulators, mēs pārbaudījām tā reakciju uz PAC. Saskaņā ar iekaisuma izraisītāju tendenci PAC atcēla Fe / Asc mediēto NF-KB indukciju un samazināja NF-KB / IikB attiecību. Tādējādi mēs varam pamatoti pieņemt, ka PAC palīdz aizsargāties pret iekaisumu, kas apdraud zarnu šūnu funkcijas, kontrolējot NF-kB, galveno iekaisuma reakcijas regulatoru. Ir vērts pieminēt, ka PAC var pasargāt no iekaisuma, stimulējot šūnu antioksidantu aizsardzības mehānismus, jo pastāv cieša saikne starp redoksu nelīdzsvarotības un iekaisuma biomarķieriem .

Šī pētījuma mērķis bija izpētīt Pac ietekmi uz zarnu lipīdu homeostāzi. Mūsu interesantie atklājumi parādīja, ka PAC, no vienas puses, regulēja CPTla un pazemināja FAS, kas attiecīgi pārstāv FA oksidācijas un lipoģenēzes biomarķierus. Tāpēc šie enzīmi ir potenciālie PAC mērķi, kas norāda uz polifenola potenciālu novērst lipīdu uzkrāšanos, ko uzskata par OxSand iekaisuma patoloģisku izpausmi daudzos audos *3. Molekulārie mehānismi, iespējams, ir saistīti ar PPARa regulēšanu un SREBPlc, divu transkripcijas faktoru, kas regulē lipīdu metabolismu, pazemināšanos. FAS ir centrālais enzīms lipoģenēzē, kas ir atbildīgs par malonil-CoA pārvēršanos par FAs45. No tās puses ACC katalizē malonil-CoA veidošanos, kas ir būtisks FAS substrāts. Saskaņā ar mūsu konstatējumiem tika konstatēts, ka arī Solanum nigrum polifenoli samazina FAS un SREBP, vienlaikus palielinot CPTla un PPARa ar oleīnskābi apstrādātos hepatocītos.

Polifenolu darbības mehānismi parasti ir saistīti ar AMKa fosforilācijas aktivizēšanu7. Svarīgi, ka mūsu pētījumā fosforilēto AMKa pazemināja Fe / Asc, bet stimulēja PAC, kas izskaidro fosfo ACC pazemināšanos, kā rezultātā tika kavēta lipoģenēze un palielināta enerģijas metabolisms. Tomēr AMKa olbaltumvielu ekspresiju palielināja Fe / Asc izraisītais OxS Caco2 / 15 šūnās. Attiecīgi ROS un OxS var izraisīt AMKa, izmantojot dažādas augšup esošās kināzes .

OCS un iekaisums spēcīgi izraisa insulīna rezistenci un papildu vielmaiņas traucējumus 9, 50, kas lika mums novērtēt Pac spēju regulēt dažus galvenos proteīnus attiecībā pret insulīna signalizācijas ceļu. Vispirms mēs koncentrējāmies uz p38-MAPK, kura ekspresiju atklāja OxS pārregulēšana, vienlaikus traucējot insulīna receptoru signālu kaskādi. Gan p38-MAPK fosforilācijas analīze, gan fosfo p38-MAPK/p38-MAPK attiecības aprēķins atklāja būtisku reakcijas pieaugumu uz Fe/Asc, kas ir saderīgs ar traucētu IS Caco{ {6}} no 15 šūnām. Validācija tika iegūta, samazinot pAkt un PI3K. Turpretim PAC mainīja tendenci, jo tie parādīja spēju samazināt p38-MAPK fosforilāciju un fosfo p38-MAPK/p38-MAPK attiecību, vienlaikus uzlabojot PI3K/Akt signalizācijas ceļu, kas, kā zināms, ir starpnieks insulīna galvenajās bioloģiskajās darbībās, regulējot glikozes transportu, proteīnu sintēzi, šūnu proliferāciju, šūnu izdzīvošanu un glikoneoģenēzi. IS traucējumi OxS un hroniska iekaisuma dēļ var ietekmēt arī glikoneoģenēzes procesu3, 54. Divu galveno de novo glikozes sintēzē iesaistīto enzīmu (PEPCK, G6Pase) analīze atklāja ievērojamu atbildes reakciju uz Fe / Asc, bet PAC ievadīšana atgrieza tos līdz normālam līmenim Caco2/15 šūnās.

Visbeidzot, daudzi pētījumi zinātniskajā literatūrā pierāda būtisku fenola savienojumu ietekmi uz veselību vai nu kā specifiska fenola molekula, vai vairāku polifenolu maisījums, izmantojot netiešus pierādījumus. Šis darbs norāda uz PAC (komplekso flavanolu) būtisko ietekmi zarnu homeostāzē, novēršot OxS, iekaisumu un saistītos vielmaiņas traucējumus. Tā kā tievās zarnas var pilnībā neuzsūkt PAC, ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai izpētītu mehānismus, kas saistīti ar to labvēlīgo ietekmi uz veselību tievajās zarnās.

Materiāls un metodes

Intestinal Caco{0}}/15 šūnu kultūra un ārstēšana. Visiem eksperimentiem mēs izmantojām cilvēka epitēlija kolorektālās adenokarcinomas Caco-2/15 šūnu līniju, stabilu Caco-2 vecāku šūnu klonu (American Type Culture Collection, Rockville, Md., ASV), kas tika iegūts no Dr. JF Beaulieu (Šūnu bioloģijas katedra, Medicīnas fakultāte, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Kvebeka, Kanāda). Caco-2/15 šūnu līnijai ir unikāla īpašība in vitro diferencēt polarizētos nobriedušos enterocītos un veidot necaurlaidīgu mon-over. Caco-2/15 šūnas tika kultivētas, kā aprakstīts iepriekš323455, un izmantotas šūnu integritātes, OCS un iekaisuma pētīšanai17,19 un IS56.

Olbaltumvielu ekspresijas analīze ar imūnblotēšanu. Pēc inkubācijas ar dažādām apstrādēm Caco{0}}/15 šūnas tika lizētas ledusaukstā buferšķīdumā, kas satur 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM Na2E-DTA, 1 mM EGTA, 1 procentu NP. -40, 1% deoksiholāta, 2,5 mM nātrija pirofosfāta, 1 mM Na2VO4, 1 ug/ml leupeptīna un 1 mM PMSF. Katra parauga olbaltumvielu koncentrācija tika noteikta, izmantojot Bredfordas metodi (Bio-Rad). Pēc tam olbaltumvielas 5 minūtes denaturēja parauga buferšķīdumā, kas satur SDS un ß-merkaptoetanolu. Homogenāti, kas satur 15 ug kopējo proteīnu, tika atdalīti uz 10 procentu SDS-poliakrilamīda gēla atbilstoši olbaltumvielu molekulmasai un tika elektroblotēti uz nitrocelulozes membrānām. Piens bez taukiem tika izmantots, lai bloķētu nespecifiskas membrānu vietas, pirms pievienoja primārās antivielas nakti 4 grādu temperatūrā. Par antivielu atšķaidīšanu ir ziņots papildinformācijā un mūsu nesenajā publikācijā. Reaktīvās joslas tika notvertas, izmantojot ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad). Visi dati ir izteikti kā mērķa proteīna attiecība pret aktīnu tajā pašā paraugā.

Statistiskā analīze. Visas vērtības ir izteiktas kā vidējais ± SEM vismaz trīs dažādos eksperimentos, kas veikti trīs eksemplāros. Dati tika analizēti ar vienvirziena ANOVA, kam sekoja Tukey vairāku salīdzinājumu testi, izmantojot PRISM 7.{2}}(GraphPad Software, Sandjego, CA, ASV). Atšķirības tika uzskatītas par būtiskām P<>

Šis raksts ir izvilkts no Scientifc Reports|(2021) 11:3878|https://doi.org/10.1038/s41598-020-80587-5