Karnovska fiksators novērš artefaktu parādīšanos kā vakuolāciju, kas rodas audu apstrādes rezultātā nierēs, kas apstrādātas ar antisense oligonukleotīdu Ⅱ

Makroskopiski patoloģiskas izmaiņas netika novērotas. Turklāt asins ķīmijā nieru parametri (ti, BUN un CRE) nevienā grupā neuzrādīja būtiskas izmaiņas (1. tabula).

Cistanche uztura bagātinātājs nieru funkcijas atbalsta papildinājums PhGs75% Ech 30% Act 12%

Kopsavilkums par histopatoloģisko atradumu nierēm, kas fiksētas ar 10% NBF, ir parādīts 2. tabulā. Mikroskopiski bazofīlas granulas un vakuolas proksimālajās kanāliņos, īpaši S1 un S2 segmentos, tika novērotas abos ASO-1W. un ASO-2W grupas nierēm, kas fiksētas ar 10% NBF (1.A attēls). Šīs izmaiņas bija nopietnākas ASO-2W grupā nekā ASO-1W grupā. Bazofīlo granulu uzkrāšanās galvenokārt tika novērota uz proksimālo kanāliņu suku robežas kā agregāti un/vai punktveida struktūras. Tā kā tiek ziņots, ka bazofīlās granulas atrodas gan endosomās vai lizosomās, gan brīvi proksimālā tubulārā epitēlija citoplazmā14, šīs dažādās formas var atspoguļot to uzkrāto laukumu; tas ir, agregāti un punktveida struktūras var uzkrāties attiecīgi lizosomās un citoplazmā. Vakuolas proksimālajās kanāliņos bija apaļas un raupjas formas, un lielākā daļa no tām bija sapludinātas ar blakus esošajām vakuolām. Turklāt daži no vakuoliem saturēja vājas bazofīlas granulas (1. att. E), kas liecina, ka vakuoli bija saistīti ar ASO uzkrāšanos. Imūnhistoķīmiski LAMP-2 bija pozitīvs uz vakuolu membrānas virsmas (1. G un 1H att.). Rezultāti liecināja, ka vakuolācija bija lizosomu paplašināšanās. Vakuolācijas smaguma atšķirība starp ASO-1W un ASO-2W grupām var norādīt uz atšķirībām lizosomās uzkrāto ASO skaitā. Mēs domājam, ka lizosomās uzkrāto ASO daudzums palielinās, palielinoties ASO iedarbības laikam. Līdz ar to lizosomu paplašināšanās parādījās kā vakuolācija audu apstrādes dēļ.

1. tabula. Asins ķīmijas dati

2. tabula. Histopatoloģiskie atradumi nierēs, fiksēti ar 10% N

Lai gan tika novērota mērena vakuolācija, proksimālā kanāliņu deģenerācija nebija acīmredzama, un lielākā daļa vakuolēto epitēlija bija negatīvi attiecībā uz KIM-1 imūnhistoķīmiskajā krāsojumā (1. att.). Turpretim paraugiem, kas fiksēti Karnovska fiksatorā, vakuolu proksimālajās kanāliņos nebija visiem indivīdiem, savukārt bazofīlās granulas tika novērotas bieži (1.B att.). Bazofīlās granulas bija pamanāmākas nekā paraugos, kas pakļauti 10% NBF fiksācijai, jo šūnu struktūra bija labi saglabājusies (1. att. F). Paraugos, kas pakļauti 4% PFA fiksācijai, tika novērotas vakuolas un bazofīlas granulas; tomēr vakuolācijas smagums bija nedaudz zemāks nekā paraugos, kas pakļauti 10% NBF fiksācijai (1. C attēls).

Oligonukleotīdi ir ūdenī ļoti šķīstošas ​​molekulas un tiek ekstrahētas no audiem apstrādes laikā, jo šūnu komponenti nav pilnībā savienoti.

Pamatojoties uz šiem rezultātiem, mēs secinājām, ka fiksācijas metode ietekmēja vakuolus proksimālajās kanāliņos un ka morfoloģiskās izmaiņas, kas novērotas audos, kas pakļauti 10% NBF un 4% PFA fiksācijai, var būt artefakti ASO uzkrāšanās zonā audu apstrādes laikā. Citiem vārdiem sakot, vakuolācija var būt toksikoloģiski nenozīmīga, jo netika novērota tubulāra deģenerācija, palielināta KIM-1 ekspresija vai patoloģiskas izmaiņas nieru parametros. Tāpēc mēs iesakām izmantot Karnovska fiksatoru kā izvēles fiksācijas metodi precīzai nieru patoloģiskai izmeklēšanai ar ASO ārstētiem dzīvniekiem.

Noslēgumā jāsaka, ka mūsu pašreizējie atklājumi atklāja iespējamu vakuolācijas pārvērtēšanu, izmantojot parasto NBF fiksācijas metodi. Karnovska fiksators var būt noderīgs līdzeklis, lai atšķirtu mākslīgās vakuolas no patiesas nefrotoksicitātes.

1. attēls. Reprezentatīvi fotomikrogrāfi no nierēm, kas apstrādātas ar antisense oligonukleotīdu (ASO). Histopatoloģiskas izmaiņas ar 2-nedēļu bloķētu nukleīnskābi, kas satur antisensu oligonukleotīdu (LNA-ASO) apstrādātajā grupā (ASO-2W) nierēm, kas fiksētas ar (A) 10% neitrāla bufera formaldehīda šķīdumu (NBF), ( B) Karnovska fiksators vai (C) 4% paraformaldehīda fosfāta buferšķīdums (PFA). (D) ASO-2W nieru bojājuma molekulas -1 (KIM-1) ​​imūnhistoķīmiskā krāsošana nierēm, kas fiksētas ar 10% NBF.Histopatoloģiskas izmaiņas 1-nedēļas LNA-ASO ārstētajā grupā (ASO-1W) nierēm, kas fiksētas ar (E) 10% NBF un (F) Karnovska fiksatoru. Imūnhistoķīmiskā krāsošana ar lizosomu saistītā membrānas proteīna 2 (LAMP-2) no (G) ASO-1W un (H) ASO-2W nierēm, kas fiksētas ar 10% NBF. (A) Proksimālajās kanāliņos tiek novērotas bazofīlas granulas (melnas bultiņas) un vakuoli (melnas bultiņas). Hematoksilīna un eozīna (H&E) krāsošana. Stienis=20 μm. (B) Vakuoli netiek novēroti, bet tiek novērotas bazofīlas granulas (melnas bultiņas). H&E krāsošana. Stienis=20 μm. (C) Tiek novērotas bazofīlas granulas (melnas bultiņas) un vakuoli (melnas bultiņas). Tomēr vakuolācijas smagums bija zemāks nekā paraugos, kas pakļauti 10% NBF fiksācijai. H&E krāsošana. Stienis=20 μm. (D) Lielākā daļa vakuolēto proksimālo kanāliņu ir negatīvi attiecībā uz KIM{15}}. Stienis=20 μm. (E, F) Dažās vakuolās, kas novērotas proksimālajās kanāliņos, bija vāji basofīlas granulas (zaļas bultiņas). Ir skaidri novērotas bazofīlās granulas, saglabājas šūnu struktūra (zaļas bultiņas). H&E krāsošana. Bāri =20 μm. (G, H) Vakuolu membrānas virsma ir pozitīva attiecībā uz LAMP-2 (zilas bultiņas). Stieņi=20 mm.

Iespējamo interešu konfliktu atklāšana: autori paziņo, ka viņiem nav interešu konflikta.

Pateicība: autori ir pateicīgi Keisuke Yoshikawa un Tetsuya Ohta par laipnajiem padomiem.

Atsauces

1. Rinaldi C, un Vuds MJA. Antisense oligonukleotīdi: nākamā robeža neiroloģisko traucējumu ārstēšanā. Nat Rev Neirol. 14: 9–21. 2018. [Medline] [CrossRef]

2. Uemura Y un Kobayashi K. Peļu alveolāro makrofāgu mērķēšana, intratraheāli ievadot bloķētu nukleīnskābi, kas satur antisensu oligonukleotīdus. Narkotiku Deliv. 26: 803–811. 2019. [Medline] [CrossRef]

3. Bennett CF. Terapeitiskie antisense oligonukleotīdi sasniedz pilngadību. Annu Rev Med. 70: 307–321. 2019. [Medline] [CrossRef]

4. Freizers KS. Antisense oligonukleotīdu terapijas: solījums un izaicinājumi no toksikoloģiskā patologa viedokļa. Toksisks patols. 43: 78–89. 2015. [Medline] [CrossRef]

5. Engelhards JA. Antisense oligonukleotīdu salīdzinošā nieru toksikopatoloģija. Nukleīnskābe Ther. 26: 199–209. 2016. [Medline] [CrossRef]

6. Frazier KS, Sobry C, Derr V, Adams MJ, Besten CD, De Kimpe S, Francis I, Gales TL, Haworth R, Maguire SR, Mirabile RC, Mullins D, Palate B, Doorten YPS, Ridings JE, Scicchitano MS , Silvano J un Woodfine J. Sugai specifiskas iekaisuma reakcijas kā primāro komponentu glomerulāru bojājumu attīstībai pelēm un pērtiķiem pēc hroniskas otrās paaudzes antisense oligonukleotīda ievadīšanas. Toksisks patols. 42: 923–935. 2014. [Medline] [CrossRef]

7. Šūšana S, Gubler M, Gérard R, Avignon B, Mueller Y, Braendli-Baiocco A, Odin M un Moisan A. GalNAc konjugācija mazina antisense oligonukleotīdu zāļu citotoksicitāti nieru kanāliņu šūnās. Mol Ther Nukleīnskābes. 14: 67–79. 2019. [Medline] [CrossRef]

8. Kakiuchi-Kiyota S, Koza-Taylor PH, Mantena SR, Nelms LF, Enayetallah AE, Hollingshead BD, Burdick AD, Reed LA, Warneke JA, Whiteley LO, Ryan AM un Mathialagan N. Bloķēto aknu transkripcijas profilu salīdzinājums ribonukleīnskābes antisense oligonukleotīdi: pierādījumi par atšķirīgiem ceļiem, kas veicina nemērķa izraisītu toksicitāti pelēm. Toxicol Sci. 138: 234–248. 2014. [Medline] [CrossRef]

9. Hagedorn PH, Yakimov V, Ottosen S, Kammler S, Nielsen NF, Høg AM, Hedtjärn M, Meldgaard M, Møller MR, Ørum H, Koch T un Lindow M. Pēc to secības var paredzēt terapeitisko oligonukleotīdu hepatotoksisko potenciālu. un modifikācijas modelis. Nukleīnskābe Ther. 23: 302–310. 2013. [Medline] [CrossRef]